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문제 정의
- 본 연구는 활성슬러지 및 논, 밭 토양에서 amylase 활성이 우수한 균주를 분리, 동정하여 균주특성을 규명하고, 효소 활성 능을 증대시키기 위해 돌연변이하여 원 균주와 특성을 비교하였으며, 균주의 산업적 이용 및 전분함유 합성폐수 처리에 응용 하였다.
제안 방법
- 즉정은 1% soluble starch sol. 0.25 ml에 효소액 0.25 ml을 넣고 37℃에서 5 분간 반응시킨 후 DNS (Dinitrosalicylic acid) 방법(3)에 의해 glucose를 표준물질로 하여 550 nm에서 흡광도를 측정, 비색정량 하였으며, 효소단위는 1 분에 1 pinole의 glucose에 상당하는 환원당을 유리하는 효소량을 1 unit로 하였다. Specific activity는 단백질 mg당의 activity로 표시 하였다.
- 선별된 분리균주 Bacillus sp. AIV 1940에 대해 형태학적 관찰을 하였다. 배지상에서의 집락은 약한 회백색의 3-4 mm 크기로 가장자리가 약간 돌기형태로 되어있고, 광학현미경으로 관찰한 결과 아중심성 내성아포를 나타내었으며, 그람양성으로 염색되었다.
- Bioscreen C를 이용한 기질 이용 능을 평가하기 위해 기질첨가량을 각각 0.1, 0.2, 0.2, 1, 3, 5, 10, 15, 20 g/l로 농도별로 균주 성장 능을 평가하였다. 전분농도가 1 g/l 이하의 농도에서의 균주 최대성장능이 OD 600 nm에서 0.
- a-Amylase 생성능을 향상시키기 위하여 Miller의 방법(8)을 변형하여 실험하였다. Bacillus sp.
- 2 g, FeCl2 5 mg, CaCl2 50 mg . l-1) 380 µl 사용하였으며, 기질로 전분농도를 0~20 g/l를 주입하여 성장능을 평가하였다.
- 균주는 LB배지에서 배양하여 그람염색 후 광학현미경 (Olympus BS51TR-32000, Japan)으로 형태 및 배열상태를 관찰하였다. 또한, 주사전자현미경 (FE-SEM, HITACHI-S4500II)으로 분리균주의 세부적인 형태와 크기 등을 관찰하였다.
- 85%, NaCl)를 사용하여 연속 희석하여 고체 배지에 도말하였다. 균주배양에 사용한 고체배지(BY medium)는 meat (beef) extract 0.5% (w/v), peptone 1%, NaCl 0.2%, yeast extract 0.2%, soluble starch 2%, agar 1.5%으로제조하였으며, 액체배지(ABY medium)는 meat (beef) extract 1%, peptone 2%, NaCl 0.4%, yeast extract 0.4%, soluble starch 1%, pH는 7.0으로 조절하여 저)조하였다. 배양된 콜로니 주위에 0.
- 균주의 catalase, oxidase test는 Gerhardt 등의 방법(4)을 변형하여 사용하였다. 기타 생화학적 실험은 API 50 CHB (API bioMerieux Co, France)을 이용하여 실시하였다.
- 사용하였다. 기타 생화학적 실험은 API 50 CHB (API bioMerieux Co, France)을 이용하여 실시하였다. 결과판독은 APILAB plus software version 4.
- 또한, 주사전자현미경 (FE-SEM, HITACHI-S4500II)으로 분리균주의 세부적인 형태와 크기 등을 관찰하였다.
- 분리균주를 이용하여 amylase의 유기물분해능을 평가하였다. Amylase 합성폐수 50 ml을 제조 후 30℃ 배양기에서 1 일간 배양 후 균주를 8, 000Xg으로 2 분간 원심분리하고 멸균증류수로 2번 세척 후 5% 접종하였다.
- Fatty acid methyl estei물질을 취한 다음 base washing으로 희석하고 NaOH 3 mF을 첨가하여 상층액을 분석용 vial에 넣어 분석용 시료로 사용하였다. 분석은 Microbial Identification System (MIDI, Inc. Newark, DE, USA)으로 실시하였고, 지방산조성은 MIS Library entry에서의 similarity index (SI)로 나타내었다.
- 교반배양기에서 150 rpm으로 30℃에서 반응시켰다. 성장에 따른 유기물감소량은 반응초기, 1 이과 3 일후에 COD 측정용 vial (HACK, Co, USA) 중 1500mg/l까지 측정가능한 vial로 시료를 희석하여 CODcr 변화량을 측정하였고, pH meter (DP-880P, 동아과학, Korea) 로수소이 온농도를 측정하였다.
- 0)로 세척하고 LB 10 에 재 현탁하여 12 시간 배양하였다. 이를 IO%까지 희석하고 BY배지에 도말한 후 30℃에서 20~24시간 배양하여 요오드용액법(5)으로 직접 선별하여 여러세대에서 안정되고 우수한 a-amylase 활성능을 유지하는 AIV 1940을 선별하였다.
- 전분 함유 합성 폐수의 유기물 제거능 효과를 알아보기 위해 분리 균주를 합성폐수에 접종하여 조사하였다(Fig. 4). 부가 탄소 원으로 glucose를 첨가하였고, 질소원으로는 peptone을 첨가하였다.
- 0을 사용하여 similarity %로나타내었다. 지방산분석에 의한 동정은 Miller 방법(7)을 변형하여 실시하였다. Trypticase soy broth agar (BBL, Cockeysville, MD)에서 28℃, 24시간 배양한 다음 습균체 약 40 mg을 screw cap tube (13 X100 mm) 에 넣고 50% methanol, 15% NaOH 1 ml을 첨가하여 10(TC에서 30 분간 끊였다.
대상 데이터
- AIV 19를 분리하였으며, 보다 우수한 효소활성능을 지닌 균주제조를 위해 NTG 처리를 통한 돌연변이 방법을 사용하여 200개의 콜로니를 선택하여 분해환 크기가 10 mm 이상인 균주들을 1차선별후 효소활성능이 우수한 Bacillus sp. AIV 1940 균주를 2 차 선별하였다(Fig. 1). Enzyme activity는 Bacillus sp.
- 이후 여러 세대 계대를 통한 생리 특성 유지여부를 검증하여 안정된 결과를 나타낸 Bacillus sp. AIV 1940 균주를 최종선별 하였다.
- 대조군은 생명공학 연구원 유전자은행에서 분양받은 Bacillus subtilis KCTC 2210, Bacillus sp. KCTC 1730, Pseudomonas aeruginosa KCTC 1750을 사용하였다.
- a-amylase 활성실험을 위한 효소액은 균주를 10 ml의 LB (peptone 1%, yeast extract 0.5%, NaCl 0.5%, pH 7.0) 배지에서 3(TC로 24 시간동안 진탕배양 후 8, 000Xg에서 3 분간 원심분리하여 균체를 완전히 제거한 상등액을 crude enzyme solution으로 사용하였다.
- 본 실험에서 사용된 균주는 전분가공 폐수처리장치내(SG공장, 인천) 반송슬러지, 용인시 인근 논, 밭 토양 등에서 시료를 채취하여 멸균 생리식염수(0.85%, NaCl)를 사용하여 연속 희석하여 고체 배지에 도말하였다. 균주배양에 사용한 고체배지(BY medium)는 meat (beef) extract 0.
- 전분가공 폐수처리장에서 채취한 활성슬러지와 용인시 기흥읍 근처의 논, 밭 등지에서 시료를 채취하여 균주들을 확보하였다. 전분을 기질로 하는 BY고체배지상에서 연속희석법으로 배양하여 배양특성이 Bacillus속 계통균주들을 주로 선택하여 배지에 다시 picking하여 배양시킨 후, 0.
이론/모형
- 균체 량은 배 양균주를 spectrophotometer (DU 550, Beckman, USA)를 사용하여 OD 600 nm에서 측정하였다. 단백질량은 Biuret 법으로 정량하였다(4).
성능/효과
- API- 50CHB를 이용한 생리, 생화학적 실험결과는 Table 2에 나타내었다. AIV 19와 AIV 1940 균주는 “Good identification'으로 나타났으며, 표준균주로 사용한 KCTC 2210는 "Excellent identifi- cation"으로 Bacillus subtilis의 생리 생화학적특성을 보였다. AIV 19는 Bacillus stearothermophilus으로 match가 되었으나, Bacillus sp.
- 농도에 따라 대체적으로 세균의 생장곡선 중 유도기가 길어지면서 분해가 지연되었다. 3 gll 이상의 농도에서는 균주성장이 저 농도에 비해 현저히 향상되었으나, 전반적으로 균체성장능이 낮게 나타났다. 이는 분리균주의 pH값이 4.
- 효소활성능 비교에서는 Bacillus sp. AIV 1940이 ATV 19보다 1.8배 정도 활성이 우수하였으나(Table 1), 합성폐수 결과에서는 상대적으로 낮은 분해율을 나타내었다. 이는 효소활성능과 비 례하여 기질의 분해능이 증가되지는 않았으며, 아마도 배지의 pH의 저하로 효소활성이 다소 낮게 나타난 것으로 사료된다.
- 반응 3일후에는 Bacillus sp. ATV 1940이 72.3%의 높은 제거율을 나타내어 전분 함유폐수의 유기물제거에 활용이 가능한 유용한 균으로 판명되었다. 효소활성능 비교에서는 Bacillus sp.
- 유기물제거반응 1일이 경과되었을 때 비교균주 Bacillus sp. KCTC 1730균주는 API Kit결과(Table 2)에서 Starch 이용능이 없는 것으로 판명되어 비교적 낮은 분해율(25.1%)을 나타내었다. 따라서 COD 분석결과에 나타난 분해율은 전분성분외의 기질의 분해에 의한 제거된 것으로 보인다.
- AIV 1940에 대해 형태학적 관찰을 하였다. 배지상에서의 집락은 약한 회백색의 3-4 mm 크기로 가장자리가 약간 돌기형태로 되어있고, 광학현미경으로 관찰한 결과 아중심성 내성아포를 나타내었으며, 그람양성으로 염색되었다. 위상차 현미경과 전자현미경으로 관찰한 결과 전형적 인간 균이며, 길이가 2.
- 2%의 분해율을 나타내었다. 초기 CODcr이 4, 455 mg/l인 고농도의 유기물합성폐수인 점을 감안한다면 매우 높은 분해율을 나타내었고, 분해균주가 유기물분해 및 전분함유폐수의 유기물 제거에도 이용할 수 있는 가능성을 제시하는 결과이다. 반응 3일후에는 Bacillus sp.
- 지방산은 균주의 세포막과 세포벽의 중요한 구성인자로 각 균주가 지닌 지방산 생합성계에 따른 조성차이로 균주를 분류할 수 있다. 표준균주의 지방산분석에서 B. subtilis KCTC 2210은 similarity index치가 0.796 (B. subtilis)으로 first choice에서 잘 일치하고 second choice에서 Bacillus amyloliquefaciens (0.724)를나타낸 것으로 보아 전형적인 Bacillus group에 속한 것으로 나타났다. 분리균주 Bacillus sp.
후속연구
- (Table 3). 그러나, 보다 정확한 동정을 위해서는 수리분석학적 해석, 16S rRNA 분석을 통한 유전자적 유사성 등의 검토가 요구된다. Abel 등(1)에 의하면 균체의 지방산 조성은 유전적 지배를 받으므로 표준화된 조건에서 plasmid나 미세한 변이에 의한 뚜렷한 영향을 받지 않으며 지리적이 차이에 관계없이 주어진 조건에서 분류 및 동정이 용이하다고는 점을 감안 할 때, API 결과와 지방산 조성에 따른 분류결과에서 Bacilhus속으로 분류하는 것이 바람직한 것으로 사료된다.
- 그러나 고농도 유기물 분해능을 가진 균주분리는 미진한상태이다. 본 연구를 통하여 폐수처리장의 전분함유 고농도 유기물의 제거에 이용 가능성을 높여주고, 향후 bioreactor나 pilot에 의한 대량처리기술에 적용시켜 관련폐수 처리 등에 응용하는 방향으로 진행되어야 할 것이다.
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