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문제 정의
- 본 연구에서는 바다에서 비교적 풍부하고 값싸게 얻어질 수 있는 갈조류(brown algae) 중에서 중금속 흡착능력이 우수하다고 알려진 Sargassum /Zm&ms로부터 추출한 alginate를 은 및 구리와 반응시켜 생성된 Ag- 혹은 Cu-alginate를 사용하여 대장균(Escher汩”a coli) 및 포도상구균(Staphylococcus aureus) 에 대한 항균효과를 조사하였다. 특히, Ag-alginate가 항균 제품에 사용되었을 경우, 미생물이 활동하기 좋은 습도 조건에서 수용성 특성을 나타내므로 은 이온의 용출제어가 용이하여 항균효과를 극대화시킬 수 있는 장점이 있다<7).
제안 방법
- 01 wt.%가 되도록 여러 종류의 항균제를 첨가하여 미생물의 성장을 측정하였다. Fisher의 경우, Fisher Scientific 사의 시약용 급 Na-alginate(BP185-l)를 사용하여 Ag-alginate를 제조하였으며, Zeoclean은 국내의 (주)다우바이오텍에서 제조하여 항균제로서 판매되고 있는 항균 액체세라믹인 Ag-zeolite 수용액(SB 10)이고, Zeomic은 일본 (주)시나넨社에서 판매하고 있는 수용액상의 Ag-zeolite 계통의 항균제이다.
- 015 wt.%의 항균제를 그람음성균주인 대장균 및 그람양성균주인 포도상구균의 main culture 배양액에 첨가하여 균체의 성장억제를 측정하였다. 항균효과 시험은 배양과정을 조사하기 위하여 2시간마다 배양액을 채취하고 25배 희석하여 자외선분광분석기(HP 8452A)를 사용하여 600 run 의 파장에서 흡광도(optical density)를 이용하여 미생물 농도의 변화과정을 조사하였다(10).
- 5 g, NaCl 1 g을 50 mL의 3차 증류수에 용해시킨 후, autoclave에서 121 °C, 15 분 동안 고압 ■ 멸균하여 seed culture로 사용하였으며, main culture는 seed culture 제조법과 동일하나 시료와 증류수의 양을 100 mL로 하여 제조하였다. Clean bench에서 상온으로 냉각시킨 액체배지에 냉장 보관된 고체배지로부터 종균을 접종시키고, water bath에서 대장균(28°C, 12시간)과 포도상구균 (37°C, 24시간)의 seed culture를 배양시킨 후, seed culture 0.3 mL를 원하는 조성으로 제조된 main culture 100 mL에 접종하여 seed culture와 같은 조건으로 배양하였다. 또한 배양 중 pH 변화를 억제하기 위하여 main culture 100 mil] 완충용액 0.
- 건조된 biomass 10 g을 0.1 N HN03 1 L 용액에서 12시간 동안 진탕시켜 추출이 용이하도록 알긴산으로 전환하고, 2% NazCCh용액 1 L에 넣고 24시간 동안 진탕한 후, 여과하여 alginate 추출용액을 제조하였으며, 에탄올로 세척 및 원심분리과정을 3회 반복하여 추출용액을 정제하고 불순물을 제거하였다{8). 추출된 alginate 함량분석은 poly(hexamethylene biguanidinium chloride) [PHMBH+C1] 적정시약과 자외선 분광분석기를 사용하여 Kennedy 및 Bradshaw의 방법(9)으로 수행하였다.
- 또한, 성장기에 있는 액체배지의 main culture를 102, 104, 106, 108, 10“배로 희석하여, 고체 배지에 삼각 유리봉을 이용하여 분산 . 도말하고, 배양기에서 대장균(28°C, 24시간)과 포도상구균(37°C, 48시간)을 배양한 후, 미생물의 성장과 기타 세균에 의한 오염여부를 정성적으로 관찰하였다.
- 항균효과 시험은 배양과정을 조사하기 위하여 2시간마다 배양액을 채취하고 25배 희석하여 자외선분광분석기(HP 8452A)를 사용하여 600 run 의 파장에서 흡광도(optical density)를 이용하여 미생물 농도의 변화과정을 조사하였다(10). 또한, 성장기에 있는 액체배지의 main culture를 102, 104, 106, 108, 10“배로 희석하여, 고체 배지에 삼각 유리봉을 이용하여 분산 . 도말하고, 배양기에서 대장균(28°C, 24시간)과 포도상구균(37°C, 48시간)을 배양한 후, 미생물의 성장과 기타 세균에 의한 오염여부를 정성적으로 관찰하였다.
- 상기의 alginate 추출용액에 AgNO3 및 Cu(NO3)2 적당량 (alginate/은이온의 몰 비율은 1.0, alginate/구리이온의 몰 비율은 2.0으로 조절)을 넣고 약 6시간 동안 실온에서 교반하여 Ag- 혹은 Cu-alginate를 제조하였으며, 에탄올로 세척, 건조 및 원심분리하여 정제된 침전물을 얻었다. 이 침전물의 일부를 0.
- 액체배지는 Tryptone 1 g, Yeast Extract 0.5 g, NaCl 1 g을 50 mL의 3차 증류수에 용해시킨 후, autoclave에서 121 °C, 15 분 동안 고압 ■ 멸균하여 seed culture로 사용하였으며, main culture는 seed culture 제조법과 동일하나 시료와 증류수의 양을 100 mL로 하여 제조하였다. Clean bench에서 상온으로 냉각시킨 액체배지에 냉장 보관된 고체배지로부터 종균을 접종시키고, water bath에서 대장균(28°C, 12시간)과 포도상구균 (37°C, 24시간)의 seed culture를 배양시킨 후, seed culture 0.
- 0으로 조절)을 넣고 약 6시간 동안 실온에서 교반하여 Ag- 혹은 Cu-alginate를 제조하였으며, 에탄올로 세척, 건조 및 원심분리하여 정제된 침전물을 얻었다. 이 침전물의 일부를 0.1N HNO3 용액에 용해시킨 후, 은 및 구리 함량을 Atomic Absoq)tion Spectrophotometer로 각각 분석하고, 항균실험을 수행하였다.
- 정지되었다. 이러한 예비 실험결과를 참조하여 seed culture로부터 대장균은 12시간, 포도상구균은 24시간 배양 후, main culture로 옮겨서 제조된 항균제의 조성에 대한 항균효과를 시험하였다.
- %의 항균제를 그람음성균주인 대장균 및 그람양성균주인 포도상구균의 main culture 배양액에 첨가하여 균체의 성장억제를 측정하였다. 항균효과 시험은 배양과정을 조사하기 위하여 2시간마다 배양액을 채취하고 25배 희석하여 자외선분광분석기(HP 8452A)를 사용하여 600 run 의 파장에서 흡광도(optical density)를 이용하여 미생물 농도의 변화과정을 조사하였다(10). 또한, 성장기에 있는 액체배지의 main culture를 102, 104, 106, 108, 10“배로 희석하여, 고체 배지에 삼각 유리봉을 이용하여 분산 .
대상 데이터
- 본 연구에서 사용된 해조류는 Sargassum jmitans로서 해변에서 채취되어 햇볕에서 건조한 후, 정확한 alginate 추출함량을 분석하기 위하여 건조기에서 50°C, 24시간 동안 건조시켰다. 건조된 biomass 10 g을 0.
- 사용 시험균주는 각종 항생제에 내성이 많이 생긴 것으로 알려진 황색 포도상구균(Staphylococcus aureus ATCC 6538) 과 식품오염 지표로 사용되는 대장균(Esc/ieric/沥 coli IFO 3301)을 울산대학교 면역제어센터(SRC)에서 분양받아 사용하였으며, plate counter agar(PCA) 2.35 g (조성 : Tryptone 5 g, Yeast Extract 2.5 g, Dextrose 1 g, Agar 15 g)을 3차 증류수 100 mL에 녹인 후, autoclave에서 121°C, 15분간 고압 . 멸균한 고체배지에서 대장균은 28°C, 포도상구균은 37°C에서 48 시간 동안 배양 후, 4笆에서 냉장 보관하고 주기적으로 계대 배양하였다.
이론/모형
- 1 N HN03 1 L 용액에서 12시간 동안 진탕시켜 추출이 용이하도록 알긴산으로 전환하고, 2% NazCCh용액 1 L에 넣고 24시간 동안 진탕한 후, 여과하여 alginate 추출용액을 제조하였으며, 에탄올로 세척 및 원심분리과정을 3회 반복하여 추출용액을 정제하고 불순물을 제거하였다{8). 추출된 alginate 함량분석은 poly(hexamethylene biguanidinium chloride) [PHMBH+C1] 적정시약과 자외선 분광분석기를 사용하여 Kennedy 및 Bradshaw의 방법(9)으로 수행하였다.
성능/효과
- 015 wt% Cu)을 첨가하여 배양기에서 대장균(28°C)과 포도상구균(37°C)을 배양하면서 배양 시간에 따른 미생물의 농도를 측정하였다 포도상구균의 경우, 배양액에 0.003 〜0。09 wt% 의 구리가 함유될 때 구리의 함유량에 따라 항균효과가 조금씩 증가하였으며, 0.015 wt% 의 구리가 첨가될 때는 미생물이 거의 성장되지 않음을 알 수 있다. 대장균의 경우, 배양액에 0.
- Main culture전의 seed culture에 대한 성장곡선을 pH 7에서 배양시간 경과에 대한 예비실험 결과, 포도상구균의 경우, 8시간 정도까지 거의 성장하지 않고 있다가 약 12〜16시간 사이에서 급격한 성장을 나타내었으며, 대장균의 경우, 30시간 정도까지 완만한 성장을 하다가 30시간 이후부터 성장이 거의 정지되었다. 이러한 예비 실험결과를 참조하여 seed culture로부터 대장균은 12시간, 포도상구균은 24시간 배양 후, main culture로 옮겨서 제조된 항균제의 조성에 대한 항균효과를 시험하였다.
- 이온교환되어 Na-alginate가 생성된다. S. /tahms로부터 추출한 용액의 alginate를 Kennedy 및 Bradshaw의 방법(9)으로 분석한 결과, 갈조류 단위 질량당 약 32% 이었으며, GPC(gel permeation chromatography, HP 1047A)에 의한 평균 분자량을 측정한 결과, 2, 120이었다. 아래의 반응식과 같이 Na- alginate의 단위 분자량이 198인 것을 감안하면, 평균 중합도는 10.
- % Ag)를 첨가하면 상기의 반응식과 같이 Na-alginate의 Na이온이 Ag이온과 교환되어 Ag-alginate가 생성되는데, 반응진행 정도는 Ag이온과 Na이온이 alginate와의 친화력 차이에 기인된다. 그리고 Na-alginate 추출용액에 AgNCh를 첨가하면 Ag-alginate의 침전물이 생성되었으며, 이러한 침전물에 무수에탄올을 가하고 원심분리하여 0.1 N HNO3 용액에 용해시켜 원자홉광분석기 (Shimatsu AA 680, Japan)로 용액을 분석한 결과, Ag이온만 검출되었으며, Na 이온은 전혀 검출되지 않았다. 즉, 중합도가 높은 alginate와 결합한 Ag 이온은 경화반응을 촉진하여 침전물을 형성하며, 중합도가 낮은 alginate는 용해된 상태에서 Ag 및 Na 이온과 평형을 이루고 있는 것으로 판단된다.
- 5 및 pH 10에서는 거의 성장하지 않았다. 대장균의 경우는 산성과 염기성에서도 어느 정도 성장을 하였으며, pH 7에서 가장 활발한 성장을 하였다. 그러므로 항균제에 대한 항균효과를 시험하기 위하여 미생물의 성장이 가장 활발한 pH 7.
- Fisher의 경우, Fisher Scientific 사의 시약용 급 Na-alginate(BP185-l)를 사용하여 Ag-alginate를 제조하였으며, Zeoclean은 국내의 (주)다우바이오텍에서 제조하여 항균제로서 판매되고 있는 항균 액체세라믹인 Ag-zeolite 수용액(SB 10)이고, Zeomic은 일본 (주)시나넨社에서 판매하고 있는 수용액상의 Ag-zeolite 계통의 항균제이다. 모든 항균제들의 항균성능이 포도상구균과 대장균에 대해서 유사한 효과를 나타내고 있으며, alginate 추출용액 및 시약용급 Na-alginate로부터 제조한 Ag-alginate와 수용액 중에서 균일한 분산성을 나타내고 있는 Zeomic이 우수한 항균효과를 보여주고 있다. Zeoclean의 경우, 수용액 중에서 Ag-zeolite의 분산이 양호하지 못하여 교반 후 방치하여 두면 침전 형태로 가라앉아 고액 분리가 생기는 현상이 생겨서 낮은 항균효과를 나타낸 것으로 사료된다.
후속연구
- 사멸시키고, 악취를 제거하는 작용도 하게 된다(12). 그러나 항균제 중에 포함되어 있는 은 및 구리함량이 항균 효과에 영향을 주고 있으며, 항균성능을 극대화 할 수 있는 최적의 은 및 구리함량을 어느 정도 결정할 수 있지만, Figure 8에 나타난 바와 같이 은 이온과 결합한 상대 이온의 성상에도 미생물에 대한 항균 성능이 영향을 받고 있으므로 이에 대한 항균메카니즘의 규명이 필요할 것으로 사료된다.
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