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문제 정의
- 그러나 genistein의 면역계에 대한 연구들은 in vivo 실험에서는 면역능을 증강시키나, in vitro 실험에서는 면역능을 저하시킨다고 보고하고 있어, 迪)in z渤0계와 in 成“계에서 작용의 차이점이 있음을 시사하고 있다. 따라서 본 실험에서는 이들 차이점을 확인하고자 in vivo 실험을 실시한 전보西)에 이어 in 勿7m계를 이용하여 genistein 이 murine thymocytes 의 apoptosis 및 복강 macrophage의 탐식능에 미치는 영향을 관찰하였다.
제안 방법
- Chemiluminesctince 측정은 lumiiiometer 를 이용하여 37°C 에서 측정하였다."28」측정용 mi ^opiate (white)의 각 well에 준비된 macrophage 부유액 50 竹를 분주하고, genistein 1, 10 및 50 皿를 각각 처리하여 2시간 배양한 후, lucigenin 용액 50 B 및 zymosan 용으与 30 B를 첨가하여, 37°C에서 15분간 전처리한 후 5분 간격으로 30쿤 동안 lucigenin chemiluminescence 양을 즉정하였다.
- DNA fragmentation 측정-동일한 방법으로 배양한 thymocytes를 lx 106 cells/m/로 조제하여 eppendorf tube에 1 n가를 넣고 propidium iodide(10 μ以m/) 20 p/를 혼합하여 4@C에서 30분간 형광염색하고 flow cytometer(excitation: 488 nm, emission: 620 nm) 로 DNA fragmental ion(Sub G1 peak) 을 측 정하였다.
- 세포 분리 -생쥐의 thymocytes 분리는 Wysocki20) 및 Mizel21) 등의 방법을 이용하였다. In vivo 실험에서는 생쥐 5마리를 1군으로 하여 전보]아에서 cytokine의 분비를 촉진한 용량인 genistein 50 mg/kg을 1일 1회씩 7일간 경구투여한 다음, 8일째 생쥐를 경추탈골하여 도살하였다. 적출한 흉선을 DPBS-A를 넣은 petri di아!에서 잘게 분쇄하고 멸균된 stainless mesh로 여과하여 세포 부유액을 얻은 후, DPBS-A로 2회 세척한 다음(1, 500 rpm에서 10분간 원심분리), thymocytes 부유액으로 하였다.
- Thymocyte의 DNA fragmentationOll 미치는 효과 -In vitro 실험에서 genistein을 처리 시 thymocytes 생존율의 감소가 apoptosis에 기인된 것인가를 확인하기 위하여, 이들 세포에 대 한 DNA fragmentation flow cytometer로 측정하였다. 대조군의 DNA fragmentation^- 14.
- 통계처리- 모든 실험 결과들은 mean±SE로 나타내었고 통계처리는 Student's Hest를 실시하여 pv0.05를 기준。로 유의성 여부를 판정하였다.
- 37°C의 CO2 incubator에서 48시간 배양한 다음, 배양 종료 5간 전에 MTT 시약을 가하였다. 배양 종료 후, 0.1N-HC1 에 용해시킨 10% SDS 100 世를 각 well에 첨가하고 차광상태에서 18시간 더 배양한 후 발색된 각 well의 흡광도를 microplate-reader로 570 nm 에서 측정하여 대조군의 흡광도에 대한 실험군의 흡광도를 백분율로 환산하여 계산하였다.
- 적출한 흉선을 DPBS-A를 넣은 petri di아!에서 잘게 분쇄하고 멸균된 stainless mesh로 여과하여 세포 부유액을 얻은 후, DPBS-A로 2회 세척한 다음(1, 500 rpm에서 10분간 원심분리), thymocytes 부유액으로 하였다. 복강 macrophage의 분리는 생쥐복강에 3% thioglycollate 2 m® 주입하고, 4일후 경추탈골하여 도살시킨 다음, 복강어 cold PBS 10 m2를 넣어 복강세포를 수집하였다. 수집한 복강세포를 4°C에 서 1, 300 rpm으로 10분간 원심분리하고 RPMI 배지로 2회 세척 후, 직경 120 mm petri dish에 분주하여 CO2 incubator에서 배양시키고, 2시간 후에 부착되 지 않은 세포를 제거한 다음, 부착한 macrophage를 cell scraperS.
- 세포 생존율 측정-분리한 thymocytes의 생존율에 미치는 genistein의 영향은 MTT법으로 측정하였다. 본 실험에 사용한 MTT법은 Mosmann22^] 개발하여 Kotnik 둥 23)이 변형시킨 방법으로, 96-well plate의 각 well에 분리한 thymocyte를 각각 RPMI 1640배지로 희석하여 96-weU plate에 1.2xlO6 cells/m/ 농도로 분주하고, genistein 1, 10 및 50 μM 농도를 각각 처리한 다음 concanavalin A(Con A) 1를 첨가하였다. 37°C의 CO2 incubator에서 48시간 배양한 다음, 배양 종료 5간 전에 MTT 시약을 가하였다.
- 4)에 25。gg/m/ 농도로 용해하여 사용하였다. 분리한 macrophaget RPMI1640 배지로 IX 105 cells/m/ 되도록 조정한 후, 100 山를 96 well에 툰주하고 E. coli 현탁액 25 B를 가하여 1시간 동안 배양한 다음 배양액을 제거하고 extracellular fluorescence억제하기 위해 trypan blue 100를 첨가하여 inverted fluoromicroscope 3A 관찰하였다.29)
- 25% bromaphenol blue 3|丑를 혼합한 다음, 10 B를 L2%(w/v) agarose gel (ethidium bromide 함 유)에 loa血g하고 전기영동(50 volt, 120분) 하였다. 전기영동 후 Imagemaster VDS로 사진 촬영을 하여 DNA laddering을 관찰하였다. 이 때marker로는 lamcla NDA EcoRI Hind m digest를 사용하였다%)
대상 데이터
- 분리하여 사용중 }였다. 배지는 RPMI 1640을 사용하였으며, 배지에는 10% FBS와 penicillin- streptomycin(100 units/mZ, 100 μg/m/)을 첨가하여 사용하였다.
- 에서 구입하여 사용하였으며, 기타 시약은 cell culture^- 및 1급 시약을 사용하였다. 사용기기는 Microplate- Reader(Dynatech MR5000), CO2 incubator(Vision scientific Co.), flow cytometer(Coulter EPICS-XL), Imagemaster VDS (Pharmacia Biotech Co.), luminometer(Berthold 96LP), inverted fluoromicroscope(Zeiss Co.) 등 을 사용하였다.
-
실험방법
실험동물- 본 실험에 사용한 생쥐는 6주령 BALB/c계 수컷을 대한실험동물에서 구입하여, 온도 20±2°C, 습도 50±5%, dark/light 12시간의 조건 하에서 1주일 이상 실험실에 적응시킨 후 사용하였으며, 고형사료와 물을 자유스럽게 섭취하도록 하였다.
이론/모형
- The cells (1.2 × 106 cells/mZ) were cultured for 48 h mixed with concanavalin A (Con A) and the cell viability was measured with MTT method. The data represents the mean - SE from 3 experiments.
- 세포 분리 -생쥐의 thymocytes 분리는 Wysocki20) 및 Mizel21) 등의 방법을 이용하였다. In vivo 실험에서는 생쥐 5마리를 1군으로 하여 전보]아에서 cytokine의 분비를 촉진한 용량인 genistein 50 mg/kg을 1일 1회씩 7일간 경구투여한 다음, 8일째 생쥐를 경추탈골하여 도살하였다.
- 세포 생존율 측정-분리한 thymocytes의 생존율에 미치는 genistein의 영향은 MTT법으로 측정하였다. 본 실험에 사용한 MTT법은 Mosmann22^] 개발하여 Kotnik 둥 23)이 변형시킨 방법으로, 96-well plate의 각 well에 분리한 thymocyte를 각각 RPMI 1640배지로 희석하여 96-weU plate에 1.
성능/효과
- ThymocyteS으의 mitochondrial tra isiriembrane potential (A나侦)에 미치는 효과- 생체에 있어서 서 포사의 과정에는 일련으 단계적인 순서가 있는데 특히 mitochordriel의 swelling이 일어나기 전 단계에 △屮이의 감소가 선행되어 인어나는 것으로 알려져 成 다.25)대 조군의 △屮m은 76.6±2.0% 이었으나, genistein 1, 10 및 50 μ暗 처리하였을 때는 72.6±2.2, 622±2.7 딫 46.0±2.8%로 10 四 이상의 농도에서 △屮m이 감소升였다(Fig. 3).。〕결과는 genistein0] thymocytes의 apoptosis를 f 도하는 과정에 △中m을 감소시켜 thymocyte의 apoptosis를 유도하卫 있음을 사사하는 것이다.
- Thymogtes의 생존율에 미치는 효과 -In vitro 실험에서는 대조군의 thymocytes에 T cell mitogen인 concanavalin A(ConA)를 처리하지 않았을 때의 세포 생존율을 100%로 하였을 때, Con A를 처리하였을 때 세포 생존율은 132.3±2.9%로 중가하였으며, genistein 1, 10 및 50 μM을 처리하고 Con A를 첨가하였을 때 세포 생존율은 각각 128.0± 2.0, 91.4+2.4 및 77.9±22% 로 10 皿 이상의 농도에서 Con A를 처리한 대조군에 비해 세포생존율이 감소하였다(Table I). 이러한 결과는 전보 19)에서 genistein을 경구 투여 하였을 때 T-lymphocyte^] 증식이 촉진되었고, y-interferon 및 interleuldn-2의 분비가 증가되었다는 결과와 비교하였을 경우, genistein을 경구로 투여하였을 때는 직접적으로 lymphocytes에 작용하지 않고, 다른 target cell을 경유하여 lymphocytes에 간접적으로 작용하고 있음을 시사하는 것이라 할 수 있다.
- Thymocyte의 DNA fragmentationOll 미치는 효과 -In vitro 실험에서 genistein을 처리 시 thymocytes 생존율의 감소가 apoptosis에 기인된 것인가를 확인하기 위하여, 이들 세포에 대 한 DNA fragmentation flow cytometer로 측정하였다. 대조군의 DNA fragmentation^- 14.4± 1.7%이었으나, genistein 1, 10 및 50 贝N을 처리하였을 때는 17.6士1.3, 37.0±2.8 및 62.1 ± 2.1%로 10 ]1M 이상의 농도에서 DNA fragmentation0] 증가하였다(Fig. 1). 또한 agarose gel electrophoresis에서도 genistein 10 |1M 이상의 농도에서 DNA ladde血g이 증가됨을 관찰할 수 있었다(Fig.
- 1). 또한 agarose gel electrophoresis에서도 genistein 10 |1M 이상의 농도에서 DNA ladde血g이 증가됨을 관찰할 수 있었다(Fig. 2). 한편, genistein 50 mg/kg을 경구 투여하고 분리한 thymocytes 는 DNA fragmentation 에 변화가 없었다.
- 4). 또한, FITC-conjugated E. coli particles을 이용하여 형광현미경으 로 복강 macrophage에 uptake되는 particle을 관찰한 결과, genistein 10 |1M 이상의 농도에서 디조군에 비해 particle의 uptake가 감소함을 확인하였다(Fig. 5). 이 결과는 genistein0] in z沥y에서 macrophage의 탐식능을 억제하여 non-specific immunity를 저하시킬 수 있음을 의미하는 것이다.
- 9±22% 로 10 皿 이상의 농도에서 Con A를 처리한 대조군에 비해 세포생존율이 감소하였다(Table I). 이러한 결과는 전보 19)에서 genistein을 경구 투여 하였을 때 T-lymphocyte^] 증식이 촉진되었고, y-interferon 및 interleuldn-2의 분비가 증가되었다는 결과와 비교하였을 경우, genistein을 경구로 투여하였을 때는 직접적으로 lymphocytes에 작용하지 않고, 다른 target cell을 경유하여 lymphocytes에 간접적으로 작용하고 있음을 시사하는 것이라 할 수 있다. 또한, Wang3*은 in 沅纳?계에서 lymphocyte^] 생존율을 daidzein은 증가시키나, genistein은 영향을 주지 않는다고 보고하였지만, 사용한 genistein의 농도가 저농도(10 皿 이하)이었고, 본 실험에서 사용한 농도가 고농도(10 μM 이상)이었기 때문에 용량 차이에 의한 결과라 추정된다.
후속연구
- 이러한 결과는 genistein이 topoisomerase- 旺를 억제하여 immature human thymocytes의 apoptosis를 유도한다는 McCabe의 보고糾와도 동일한 결과라 할 수 있다. In vivo 실험에서 genistein 50 mg/kg 투여시에는 thymocyMes의 apoptosis 가 유도되지 않았으나, 농도가 증가하면 apoptosis가 유도될 수도 있기 때문에 용량에 따른 변화가 추후 연구되어야 할 것이다. 이러한 실험 결과는 genistein0] 다양한 암세포의 apeptosis를 유도하는 작용이 있다는 보고院와 비교하였을 때, genistein은 암세포뿐만 아니라 면역세포인 T lymphocytes의 apoptosis도 유도하여 T 세포가 주도하는 specific-immunity를 저하시킬 가능성이 있음을 시사하는 것이다.
- 이 결과는 genistein0] in z沥y에서 macrophage의 탐식능을 억제하여 non-specific immunity를 저하시킬 수 있음을 의미하는 것이다. 전보19)에서 genistein 50 mg/kg을 경구 투여 하였을 때 macrophage의 탐식능이 증가되었다는 걸과와 비교하였을 때, in。泌에서 genistein이 간접적인 경로를 통하여 복강 macrophage의 탐식능을 증가시키고 있음을 시사하는 것이며, genistein의 농도에 의한 차이가 나타난 수 있기 때문에 이에 대한 연구가 진행되어야 할 것이다. 이상의 실험 결과는 genistein이 in !加。계에서는 면역세포의 하성을 측진시킬 수 있으나, in vitro계에서는 활성을 억제시킨 가능성이 있음을 시사하는 것이다.
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