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문제 정의
- 그러나 YE도 값비싼 원료에 속하므로(15-17) 최근에는 발효의 경제성을 향상시키기 위해 다량의 영양분을 함유하고 원료비용이 낮아 대량 발효공정에 전분제조의 부산물인 CSL이 사용되어지고 있으나 YE에 비해발효시간이 길고, 함유 불순물에 의한 후속 정제 및 분리 비용 상승 등의 단점이 있어 보완이 요구되고 있다. 그러므로 YE와 CSL를 혼합하여 사용하므로 젖산 발효의 경제성을 높이고자 하였다. L.
- 본 연구에서는 전통적인 발효 식품인 김치로부터 높은 젖산생산성을 가진 호모발효젖산균을 분리 동정하고, 특성을 파악하여 경제적인 젖산 생산을 위한 배양 조건을 연구하고자 한다
제안 방법
- L casei KH-1은 다른 Lact아?ac沮必속과는 달리 세포의 성장과젖산의 생산에 기질로서 lactose 를 이용하지 못하였지만 glucose의 이용은 이전의 연구들과 비교할 때 효과적이었다. Lactobad血s속의 배양에 사용되는 MRS배지의 질소원을 저렴한 원료 즉, YE와 CSL를 1:1로 첨가한 배지로 대신하여 최대의 젖산수율(L09 mole . mole")을 얻어 젖산발효에 효과적인 질소원의 대체가 이루어졌다.
- 균의 형태를 관찰하기 위하여 Scanning Electron Microscopy (SEM)을 이용하였다. 분리된 균주를 100 mL vial의 10 mL MRS배지에 1%접종하여 37℃, 48시간 동안 교반 배양하여 얻은 배양액을 원심분리하여 균체를 회수한 다음 멸균수로 수세한 후 Arain medium solution에 녹여 30분 동안 진공 건조하여 1-2시간 -20笆에서 보관한다.
- 상대적인 균의 농도는 UV-spectrophotometer를 사용하여 620 nm에서 optical density(OD)를 측정하였고, 세포건조중량(cell dry weight, CDW, g/L)은 배양액을 0.45 pm filter에 홉인 여과하여 80笆에서 24시간 동안 건조한 후 측정하였다. Glucose 농도는 포도당 측정용 kit(영동제약)을 사용하여 효소법에 의해 측정하였고, 환원당의 측정은 dinitrosalicylic acid reagent (DNS)법(4)을 이용하였다.
- 04 g, agar 14 g이포함되어 있다. 선별된 균주의 pH, 탄소원과 질소원에 따른 성장과 산물 생산에 대한 특성을 조사하기 위해서는 MRS (Merck) 액체배지에서 탄소원인 glucose대신에 sucrose 또는 lactose를 첨가하거나, MRS 액체배지의 질소원인 YE, ME, PFC의 총 질소함량인 2.73 g/L에 해당하는 단일 질소원 즉, NH4NO3, (NH4)2SO4, NaNOs, urea, bacto peptone, YE, casein hydrolysate, CSL, tryptone, ME, beef extract, PFC 등의 농도를 각각 계산하여 배지에 첨가해서 사용했다. 원료비를 절감하고 효과적인 젖산생산을 위해 MRS 액체배지의 질소원을 대신하여 사용되는 YE와 CSL의 최적의 혼합율을 결정하기 위하여 LI 또는 3:1로 각각 첨가한 배지를 사용하였다.
- 73 g/L에 해당하는 단일 질소원 즉, NH4NO3, (NH4)2SO4, NaNOs, urea, bacto peptone, YE, casein hydrolysate, CSL, tryptone, ME, beef extract, PFC 등의 농도를 각각 계산하여 배지에 첨가해서 사용했다. 원료비를 절감하고 효과적인 젖산생산을 위해 MRS 액체배지의 질소원을 대신하여 사용되는 YE와 CSL의 최적의 혼합율을 결정하기 위하여 LI 또는 3:1로 각각 첨가한 배지를 사용하였다.
- 7 을 364로 떨어뜨렸고 48시간 이후에는 세포의 성장과 산물생성은 더 이상 진행되지 않았다. 이러한 세포의 성장 저해가 산물에 의한 것인지 기질의 고갈로 인한 것인지를 조사하기 위하여 기질이 충분히 고갈되고 배지 산성화가 지속되었을 때 기질을 첨가했다. 기질의 첨가에도 불구하고 세포의 활발한 성장은 이루어지지 않았고, 이는 L.
- 분리된 균주를 100 mL vial의 10 mL MRS배지에 1%접종하여 37℃, 48시간 동안 교반 배양하여 얻은 배양액을 원심분리하여 균체를 회수한 다음 멸균수로 수세한 후 Arain medium solution에 녹여 30분 동안 진공 건조하여 1-2시간 -20笆에서 보관한다. 이를 cacodylate buffer로 15 분 간격으로 2-3회 수세한 후 에탄올 농도를 50%, 75%, 90%, 95%, 100%순으로 20-30분 정도 각각 균체를 담구어 4℃에서점차적으로 탈수시킨 후 고정액 (cacodylate buffer(pH 7.2) 에 2% glutaraldehyde와 2% paraformaldehyde를 혼합)으로 처리하여 충분히 건조시킨 시료를 gold coating하여 SEM으로 관찰을 하였다. 분리 균은 16S rRNA sequencing。)을 이용하여 동정하였는데 nucleotide sequence는 GenbaM의 accession no.
- 산생성에 의해 황색을 나타내는 colony를 다시 BCP-MRS배지에 streaking하여 균을 순수 분리한 후 MRS 액체배지로 옮겨 37℃, 150 rpm으로 진탕 배양하였다. 일정량의 배양액을 채취하여 10, 000 Xg에서 15분 동안 원심분리하고 상등액을 취하여 QI% H2SO4와 적당히 희석한 후, 0.45 pm membrane filter로 여과 처리하여 HPLC로 분석한 결과 젖산 수율이 높은 균을 선별하였다.
-
질소원에 따른 L. casei KH-1의 젖산생산
젖산균은 복잡한 영양 요구성을 가지고 있기 때문에 균마다 선호하는 아미노산, 비타민등이 다르고, 특히 질소원은 원료비의 상당부분을 차지하고 있어 발효에 의한 젖산생산의경제성을 결정하는 중요한 요인이므로 L. casei KH-I의 젖산생산에 효과적인 질소원을 조사하였고 Table 2에 결과를 나타냈다. MRS배지에 포함되어 있는 질소원의 총 질소함량 (N=2.
- 젖산균을 선별하기 위해 사용한 배지는 0.004% bromo cresol purple(BCP)을 첨가한 MRS(Merck) 고체배지였는데, 조성은 1 L를 기준으로 glucose 20 g, PFC 10 g, ME 8 g, YE 4 g, tween 80 1 mL, CHjCOONa 5 g, CgHmNQ? 2 g, K2HPO4 2 g, MgSO, . 7HjO 0.
- 초기 pH 5.7과 20 g/L의 포도당을 이용한 MRS 액체배지에서 L casei KH-1 이 37℃, 150 rpm으로 배양되어졌을 때의 성장곡선을 관찰하였다(Figure 3). 최대의 세포와 젖산농도는 각각 8.
대상 데이터
- 숙성중인 김치시료를 채취하여 멸균한 생리 식염수 0.9% NaCl로 적당량 희석한 상등액을 BCP-MRS배지에 도말하여 37℃에서 3-4일간 배양하였다. 산생성에 의해 황색을 나타내는 colony를 다시 BCP-MRS배지에 streaking하여 균을 순수 분리한 후 MRS 액체배지로 옮겨 37℃, 150 rpm으로 진탕 배양하였다.
이론/모형
- 6 mL/min의 유속으로 이용하였고, UV검출기로 220 nm에서 검출하였으며, 시료 주입량은 20 “L였다. D(-)와 L(+)-이성질체의 농도는 Boehringer Mann血eim의 "D-(-)-lactic acid /L-(+)-lactic acid" 측정 kit(Cat. No. 1112 821)을 사용하였다.
- 45 pm filter에 홉인 여과하여 80笆에서 24시간 동안 건조한 후 측정하였다. Glucose 농도는 포도당 측정용 kit(영동제약)을 사용하여 효소법에 의해 측정하였고, 환원당의 측정은 dinitrosalicylic acid reagent (DNS)법(4)을 이용하였다. 젖산농도는 시료를 상기와 같이 전처리하여 HPLC로 분석하였는데, 이때 사용한 컬럼은 Shodex RSpak DE-613, 이동상으로 5 mM H2SO4를 0.
성능/효과
- 균을 김치로부터 분리하였다. SEM을 사용하여 관찰한 분리한 균의 형태는 연쇄간균이었고 16S rRNA sequencing 에 의해 계통발생학적 분석의 결과 Lactobacillus casei KH-1 로 명명하였다. L.
- 이러한 세포의 성장 저해가 산물에 의한 것인지 기질의 고갈로 인한 것인지를 조사하기 위하여 기질이 충분히 고갈되고 배지 산성화가 지속되었을 때 기질을 첨가했다. 기질의 첨가에도 불구하고 세포의 활발한 성장은 이루어지지 않았고, 이는 L. casei KH-1의 산물인 젖산으로 인한 저해가 이루어지고 있음을 확인했다(data not shown). 젖산균에 의해 생산된 젖산은 D(-), L(+)와 DL (racemic mixture) 3가지 형태의 광학특성을 갖는데, 호모발효균인 L.
- 이러한 균의 계통발생학적 분석을 위하여 16S rRNA gene sequence를 이용하였는데, 그 결과는 Figure 1에서 보여주었다. 선발된 균의 nucleotide sequence가 Lactobacillus casei99%의높은 동질성을 갖으므로 Lactobacillus casei KH-1 으로 명명하였다. SEM을 사용하여 관찰된 L.
- 젖산균의 성장과 젖산 생산에 있어 YE와 ME의 단일 사용은 3가지 유기질소원(YE, ME, PFC)이 포함된 MRS 배지와 비슷한 수율의 젖산을 얻었다. 이는 L. casei KH-1의 성장과 젖산의 생산에 이용되는 질소원은 단일 유기질소원 즉, ME 또는 YE로 대체 가능하므로 MRS배지에서 보다 발효 젖산생산의경제성을 높일 수 있었다. 그러나 YE도 값비싼 원료에 속하므로(15-17) 최근에는 발효의 경제성을 향상시키기 위해 다량의 영양분을 함유하고 원료비용이 낮아 대량 발효공정에 전분제조의 부산물인 CSL이 사용되어지고 있으나 YE에 비해발효시간이 길고, 함유 불순물에 의한 후속 정제 및 분리 비용 상승 등의 단점이 있어 보완이 요구되고 있다.
- casei KH-1의 산물인 젖산으로 인한 저해가 이루어지고 있음을 확인했다(data not shown). 젖산균에 의해 생산된 젖산은 D(-), L(+)와 DL (racemic mixture) 3가지 형태의 광학특성을 갖는데, 호모발효균인 L. casei KH-1 가 생산한 젖산은 D(-)와 L(+)를 각각 7% 와 93%를 포함하는 racemic mixtrure이었다(Figure 4). 이는 L(+)-이성질체만을 생산한다는 이전의 연구⑹와는 다른 결과였고 또한 L.
후속연구
- mole'1 으로 높았다. 그러므로 L. casei KH-1 을 이용한 젖산의 생산에 whey나 낙농에서발생되는 lactose 와 같은 기질은 효과적이지 못하였지만, glucose를 효과적인 기질로 사용하였으므로 지구상의 가장 풍부한 biomass인 섬유소물질을 당화하여 얻어진 단당류를 본 젖산발효에 사용된다면 보다 경제적인 젖산 생산이 가능하리라 사료된다.
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