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문제 정의
- 본 연구에서는 여성호르몬을 대체하는 물질을 안전성이 검증된 식물로부터 확보하였다. Phytoestrogen 으로 이미 알려진 이소플라본을 함유하고 있는 대두, 대추야자, 석류, 병아리콩, 적클로버 등 식물들 중 이ycoside 화합물이 다량 들어 있으며 원재료 확보가 용이한 식물들을 선정하여 그 추출물을 FGF271 (Female Growth Factor 271)로 명명하고 천연 여성호르몬 대체제로 개발하고자 하였다.
- 따라서 생체내에서 에스트로겐의 대체가 가능하면서 부작용이 없는 물질에 대한 요구가 커지고 있는 실정이다. 본 연구에서는 여성호르몬을 대체하는 물질을 안전성이 검증된 식물로부터 확보하였다. Phytoestrogen 으로 이미 알려진 이소플라본을 함유하고 있는 대두, 대추야자, 석류, 병아리콩, 적클로버 등 식물들 중 이ycoside 화합물이 다량 들어 있으며 원재료 확보가 용이한 식물들을 선정하여 그 추출물을 FGF271 (Female Growth Factor 271)로 명명하고 천연 여성호르몬 대체제로 개발하고자 하였다.
- 본 연구에서는 이와 같이 안전하면서 각종 폐경기 증후군에 대처할 수 있는 식물성 에스트로겐 대체제 (Phytoestrogen) 의 효과를 확인하였다. 가장 고전적인 효과인 생식기 조직의 재생 효과를 확인하였고, 혈중 에스트로겐 농도의 증가도 관찰되었다.
제안 방법
- 1) 일반증상관찰 : 투여 전기간에 걸쳐 1일 1회 투여 직후의 일반증상을 관찰하였다. 일반 증상의 관찰은 사망여부, 증상의 종류, 발현일 및 증상의 정도를 개체별로 관찰하였다.
- 2) 체온측정 : 투여 최종주 5일동안 각 동물의 직장내 온도를 디지털 측정기(THERMALERT TH-8, Physitemp Instruments Inc.)를 이용하여 측정하였다.
- 3) 체중측정 : 투여당일 및 시험기간중 주 1회 그리고 부검 일에 절식 후의 체중을 측정하였다.
- 4) 사료 섭취량 측정 : 투여 당일 및 전 시험기간 중에 주 1회 사료섭취량을 측정하였다. 측정정방법은 체중측정 일로부터 1일간의 사료 급이량 및 잔량을 측정하며, 마리 당 평균 섭취량 (g/rat/day)으로 산출하였다.
- 5) 질도말 검사 : 수술 후 2일째부터 4일간 질도말 검사를 실시하여 성주기를 검사하였다. 또한 시험물질을 투여하고 3 주째부터 질도말 검사를 실시하여 성주기를 검사하였다.
- 7) 부검 및 장기중량측정 : 최종 계획도살시에 부검소견을 관찰하고 아래 장기에 대하여 전자 저울(BP310S, Sartorius)을 이용하여 중량을 측정하였다. 양측성 장기는 좌측 및 우측을 각각 측정하였다(좌측 난소, 자궁, 부신, 간장, 신장, 뇌 하수 체).
- 8) 병리조직학적인 검사 : 부검일에 장기 중량을 측정한 후 10%의 중성 formalin 액에 고정한 후에 이를 삭정하고 파라핀 포매 불록을 제작하여 박절하고 H&E 염색을 실시하여 광학현미경 하에서 조직학적인 검사를 실시하였다. 병리 조직학적인 검사는 강원대학교 수의학과 병리학교실에 의뢰하여 수행하였다.
- 낮은 용량군의 투여할 시험물질의 조제는 고용량군의 조제시험 물질을 다시 주사용수로 희석하는 방법으로 조제하였다. 투여경로는 경구투여로서, 투여방법은 동물을 경배부 피부 고정법으로 고정하고 금속제 경구 투여용 존데를 이용하여 위내에 직접 주입하였으며, 1회/일, 7일/주로 하여 약 5주간 투여하였다.
- 성주기를 검사하였다. 또한 시험물질을 투여하고 3 주째부터 질도말 검사를 실시하여 성주기를 검사하였다.
- 부검소견을 관찰하였다. 또한 투여 마지막 주에는 동물의 체온과 성주기를 검사하였고 동물실험 종료 후 혈청 중의 estrogen 농도를 측정하였고 암컷의 생식기와 관련된 장기의 중량측정, 병리조직학적인 소견을 관찰하였다. 본' 시험에서 선택한 시험물질의 양은 사람에서의 임상예정양의 약 3배와 30배였다.
- 10분간 원심분리하여 혈청을 분리하였다. 분리된 혈청은 -70℃로 보관하였다가 동물 임상검사센터인 한국 동물병원협회 부설 동물임상연구소에서 1470 wizard / counter (Perkin Elmer Life Science)를 사용하여 검사하였다. 이때 에스트로겐의 검사는 RIA 방법을 이용하였으며 단위는 ng/mL로 하였다(9).
- 일반 증상의 관찰은 사망여부, 증상의 종류, 발현일 및 증상의 정도를 개체별로 관찰하였다. 사망동물이 관찰된 경우 부검하여 모든 내부장기에 대하여 부검 소견을 관찰하였다.
- 시험물질 FGF2기이 나이든 암컷의 생식기능에 미치는 영향을 알아보기 위하여 좌측의 난소를 적출한 51 주령의 암컷랫드에 시험물질을 100 및 1000 ㎎/㎏으로 5주간 반복 경구투여하고 부형제인 주사용 증류수를 투여하는 대조군과 비교하였다 시험물질을 좌측의 난소를 적출한 후 10일째부터 투여하여 약 5주간 반복 경구투여하면서 체중측정과 일반 증상 및 부검소견을 관찰하였다. 또한 투여 마지막 주에는 동물의 체온과 성주기를 검사하였고 동물실험 종료 후 혈청 중의 estrogen 농도를 측정하였고 암컷의 생식기와 관련된 장기의 중량측정, 병리조직학적인 소견을 관찰하였다.
- 본 시험은 온도 23±3℃, 상대습도 55±15%, 환기횟수 10~20회/hr, 조명시간 12시간(오전 7시~ 오후 7시) 및 조도 150~300 Lux로 설정된 주식회사 켐온의 전임상연구센터 제 1 동물사육구역의 6호실에서 수행되 었다. 시험자들은 모두 고압증기멸균(121℃, 20분)된 작업복과 보호장구를 착용하고 작업을 실시하였다.
- 중량을 측정하였다. 양측성 장기는 좌측 및 우측을 각각 측정하였다(좌측 난소, 자궁, 부신, 간장, 신장, 뇌 하수 체).
- 일반증상을 관찰하였다. 일반 증상의 관찰은 사망여부, 증상의 종류, 발현일 및 증상의 정도를 개체별로 관찰하였다. 사망동물이 관찰된 경우 부검하여 모든 내부장기에 대하여 부검 소견을 관찰하였다.
- 즉, 자생식물 건조중량 100 g을 증류수에 침지하고, 90℃에서 8시간 정도 가열한 후 여과하여 수용성 추출물을 수득하였다. 이후 12, 500 rpm으로 8시간 정도 원심분리하여 상등액을 분리한 후 0.
- 사료섭취량을 측정하였다. 측정정방법은 체중측정 일로부터 1일간의 사료 급이량 및 잔량을 측정하며, 마리 당 평균 섭취량 (g/rat/day)으로 산출하였다.
- 낮은 용량군의 투여할 시험물질의 조제는 고용량군의 조제시험 물질을 다시 주사용수로 희석하는 방법으로 조제하였다. 투여경로는 경구투여로서, 투여방법은 동물을 경배부 피부 고정법으로 고정하고 금속제 경구 투여용 존데를 이용하여 위내에 직접 주입하였으며, 1회/일, 7일/주로 하여 약 5주간 투여하였다. 관찰 및 검사항목은 다음과 같다.
- 투여량은 사람에서의 인당 임상용량인 2 g의 약 3배인 100 ㎎/㎏ 투여군과 30배인 1000 ㎎/㎏ 을 투여하는 시험 군을 설정하였다(Table 1). 동물의 군분리는 수술하기 전에 다음과 같이 실시하였다.
- 78 g이었다. 한편 순화기간 중 일반증상을 관찰하여 건강한 동물만 난소적출 시술을 실시하였다. 본 시험은 온도 23±3℃, 상대습도 55±15%, 환기횟수 10~20회/hr, 조명시간 12시간(오전 7시~ 오후 7시) 및 조도 150~300 Lux로 설정된 주식회사 켐온의 전임상연구센터 제 1 동물사육구역의 6호실에서 수행되 었다.
- 한편, FGF2기을 측량하여 부형제인 주사용수에 용해하고 현탁 하는 방법으로 고용량군의 투여할 시험물질을 조제하였다. 낮은 용량군의 투여할 시험물질의 조제는 고용량군의 조제시험 물질을 다시 주사용수로 희석하는 방법으로 조제하였다.
대상 데이터
- 한편 순화기간 중 일반증상을 관찰하여 건강한 동물만 난소적출 시술을 실시하였다. 본 시험은 온도 23±3℃, 상대습도 55±15%, 환기횟수 10~20회/hr, 조명시간 12시간(오전 7시~ 오후 7시) 및 조도 150~300 Lux로 설정된 주식회사 켐온의 전임상연구센터 제 1 동물사육구역의 6호실에서 수행되 었다. 시험자들은 모두 고압증기멸균(121℃, 20분)된 작업복과 보호장구를 착용하고 작업을 실시하였다.
- 물은 지하수를 자외선 살균기 및 미세여과장치로 소독한 후 물병을 이용하여 자유섭취시켰다. 사료 중의 오염물질 분석은 사료 공급처에서 제공받은 자료를 사용하였고 물 중의 오염물질 분석은 경기도 보건환경연구원에 의뢰하여 검사한 자료를 참조하였는데 시험의 성적에 나쁜 영향을 줄만한 변화는 관찰되지 않았다.
- 사료는 (주) 대한바이오 링크로부터 공급받은 방사선 조사로 멸균된 실험동물용 고형사료 (Harlan Co. Ltd, 미국)를 자유 섭취시켰다. 물은 지하수를 자외선 살균기 및 미세여과장치로 소독한 후 물병을 이용하여 자유섭취시켰다.
- 동물의 군분리는 수술하기 전에 다음과 같이 실시하였다. 우선, 순화기간 중 건강하다고 판정된 동물의 체중을 측정한 후 5 g 간격으로 구분하여 각각의 평균 체중에 가까운 동물 30 마리를 선택하였다. 이렇게 선택된 동물들은 군별 10마리씩 체중이 균등하게 분배되도록 순위화한 체중을 이용하여 무작위법으로 분배하였다.
- 일반적으로 약효/약리 평가시험에서 흔히 사용되는 Sprague Dawley계 특정병원균 부재(SPF) 암컷 랫드를 (주)대한바이오링크에서 구입하였다 49주령인 쥐 30마리를 입수하였으며, 입수시 체중은 278.20-315.40 g이었으며, 투여 개시 시점에서의 주령은 51주령이었고, 체중은 285.58-334.78 g이었다. 한편 순화기간 중 일반증상을 관찰하여 건강한 동물만 난소적출 시술을 실시하였다.
데이터처리
- 얻어진 자료에 대한 대조군과 투여군간의 비교는 일반적으로 t-test에 의하여 분석하였다.
이론/모형
- 이렇게 선택된 동물들은 군별 10마리씩 체중이 균등하게 분배되도록 순위화한 체중을 이용하여 무작위법으로 분배하였다. 동물의 개체식별은 포화 피크릭산을 이용한 피모 색소표식법 및 개체 식별 카드 표시법으로 실시하였다.
- 분리된 혈청은 -70℃로 보관하였다가 동물 임상검사센터인 한국 동물병원협회 부설 동물임상연구소에서 1470 wizard / counter (Perkin Elmer Life Science)를 사용하여 검사하였다. 이때 에스트로겐의 검사는 RIA 방법을 이용하였으며 단위는 ng/mL로 하였다(9).
- 우선, 순화기간 중 건강하다고 판정된 동물의 체중을 측정한 후 5 g 간격으로 구분하여 각각의 평균 체중에 가까운 동물 30 마리를 선택하였다. 이렇게 선택된 동물들은 군별 10마리씩 체중이 균등하게 분배되도록 순위화한 체중을 이용하여 무작위법으로 분배하였다. 동물의 개체식별은 포화 피크릭산을 이용한 피모 색소표식법 및 개체 식별 카드 표시법으로 실시하였다.
성능/효과
- 또한 난소의 흑색의 낭포가 대조군에서는 관찰되지 않았으나 100 ㎎/㎏ 투여군에서는 2마리, 1000 ㎎/㎏ 투여군에서는 1 마리가 관찰되었다. 1000 ㎎/㎏ 투여군에서 자궁의 팽 대가대조군에 비해 통계학적으로 유의하게 증가하였다{Table 2).
- 효과를 확인하였다. 가장 고전적인 효과인 생식기 조직의 재생 효과를 확인하였고, 혈중 에스트로겐 농도의 증가도 관찰되었다. 따라서 본 실험을 통해 확인된 여성호르몬 대체효과를 가지는 식물 추출물 FGF2기이 추가의 연구를 통해 여성들이 인생의 1/3에 해당되는 폐경기를 즐겁고 안정된 삶으로 보낼 수 있도록 되기를 바란다.
- 본' 시험에서 선택한 시험물질의 양은 사람에서의 임상예정양의 약 3배와 30배였다. 본 시험결과 체중의 변화, 일반증상의 변화, 체온, 성주기 등에 있어서 시험물질의 투여와 관련된 변화는 관찰되지 않았다.
- 본 시험에서 혈청 중의 estrogen 농도가 통계학적으로 유의한 변화는 아니었지만 시험물질 투여군에서 다소 증가한 것이 관찰되었다. 이는 장기중량에서 자궁의 중량이 증가한 것과 병리조직학적인 검사에서 자궁의 내강 확장과 기타 증식성 변화가 대조군에 비하여 비교적 높은 빈도로 관찰된 것과 일관성 있는 변화로서 시험물질의 투여에 의한 변화로 생각되었다.
- 이상의 결과로 보아 본 시험에서 FGF2기의 나이든 암컷랫드에서의 경구적인 적용은 혈중의 에스트로겐의 농도를 높이는 경향이 관찰되었고 이에 따른 난소와 자궁의 변화를 유발한 것으로 생각되었다.
- 였다. 자궁의 점막하직층 자궁선의 낭화는 대조군, 100 및 1000 ㎎/㎏ 투여군 순으로 각각 5, 8 및 8마리에서, 자궁점막상피세포의 증생은 각 투여군 순으로 3, 7 및 4마리에서, 자궁의 내강확장이 각 투여군 순으로 1, 2 및 6마리, 질의 점막상피세포의 증생은 각 투여군 순으로 5, 6 및 7마리에서, 난소의 낭포 확장에 의한 낭화는 3, 5 및 4마리에서 관찰되었다. 1000 ㎎/㎏ 투여군에서 자궁내강의 확장이 통계학적으로 유의하게 인정되었다(Table 5).
- 장기중량에서는 자궁의 중량이 대조군의 경우 0.6901 g (상대중량 0.2425%), 100 ㎎/㎏ 투여군의 경우 0.6663 g (상대 중량 0.2370%), 1000 ㎎/㎏ 투여군의 경우 0.8181 g (상대 중량 0.2857%)으로 관찰되어 1000 ㎎/㎏ 투여군에서 증가하는 경향이 인정되었다(Figure 2&3). 자궁이외의 장기들의 경우 유의적인 변화는 없었다(Table 3 & 4),
- 혈청중의 estrogen 농도는 대조군 135.6 pg/mL, 100 ㎎/㎏ 투여군 158.7 pg/mL 및 1000 ㎎/㎏ 투여군 160.9 ㎎/㎏ 으로 관찰되어 시험물질 투여군에서 증가하는 경향이 관찰되었다 (Figure 1).
후속연구
- 가장 고전적인 효과인 생식기 조직의 재생 효과를 확인하였고, 혈중 에스트로겐 농도의 증가도 관찰되었다. 따라서 본 실험을 통해 확인된 여성호르몬 대체효과를 가지는 식물 추출물 FGF2기이 추가의 연구를 통해 여성들이 인생의 1/3에 해당되는 폐경기를 즐겁고 안정된 삶으로 보낼 수 있도록 되기를 바란다.
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