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문제 정의
- 이런 cha perone 분자와의 공발현은 활성형 재조합 단백질의 생산을 증가를 기대할 수 있다. 본 연구에서는 E. coil에서 B. mac- erans 유래 cyclodextrin glucanotransferase (CGTase)의 활성 형 생산에 GroEL/ES chaperone과의 공발현의 효과에 대해 조사하였다. 와 groEL/ES 유전자를 발현하는 pTCGTl 과 pGro7은 각각 T7 promoter와 araB promoter에 의해 조절되고 이들을 E.
제안 방법
- 먼저 GroEL/ES 발현에있어서 L-arabinose의 최적 농도를 결정하였다. CGTase 발현을 위한 IPTG 최적 농도는 1 mM로 결정되었으며, 10 ml LB (20 fig/ml ampicillin과 20 fig/ml chloramphenicol 포함) tube 에서 0.4—0.5 ODsoo 일 때 0〜1 mg/ml 농도의 L-arabinose를, 0.8—1.0 ODwo 일 때 1 mM의 IPTG를 첨가하였다. IPTG 첨가 후 4 시간 동안 유도한 후 균체를 회수 하였다.
- CGTase를 soluble한 형태의 발현을 증가시키기 위해 GroEL/ES와의 공발현을 행하였다. 먼저 GroEL/ES 발현에있어서 L-arabinose의 최적 농도를 결정하였다.
- 각각의 가용성 및 비가용성 분획을 8% SDS-PAGE로 분석하였다. CGTase와 GroEL/ES 단백질은 Coomassie brilliant blue 염색으로 확인하였고, gel은 Image Analyzer (Image Master VDS, Pharmacia Biotech., USA)로 scanning 분석하였다.
- GroEL/ES chaperone의 최적 유도 시간을 결정하기 위해 working volume 80 ml baffled flask 에 접종 후 배양 2 시간 째 0.3 mg L-arabinose/ml을 첨가하고/ 이후 0, 0.5, 1.0, 1.5, 2.0, 2.5 시간 때 각각 1 mM의 IPTG를 첨가하였다. 그 결과, L-arabinose 첨가 후 1.
- 이는 배양 4시간 동안 세포의 성장이 급속히 이루어지면서 6시간 이후로 산물의 생성도 빨라지게 되고, 과잉 생산된 단백질의 응집되는 속도도 빨라지게 되었기 때문이다. L-Arabinose를 첨가하고 1.5 시간 후 IPTG 첨가한 경우, 배양 12 시간 째 가용성 및 비가용성 분획을 전기영동하고 (Fig. 4) CGTase band (70 kDa)를 Image analyzer로 scanning 분석하였다. CGTase 단독 발현에서는 가용성 분획에서 CGTase band 비율이 18.
- pGro7과 pTCGTl 을 E. coli BL21(DE3) 에 co-transform- ation 시켰다. 형질전환된 E.
- 0)에 재현탁하여 비가용성 분획 (insoluble fraction)으로 분리하였다. 각각의 가용성 및 비가용성 분획을 8% SDS-PAGE로 분석하였다. CGTase와 GroEL/ES 단백질은 Coomassie brilliant blue 염색으로 확인하였고, gel은 Image Analyzer (Image Master VDS, Pharmacia Biotech.
- 2A). 그리고 CGTase와 GroEL/ES 단백질의 발현걍상을 알아보기 위해, 균체를 가용성과 비가용성 분획으로 4누어 SD&PAGE를 행하였다. 그 결과 60 kDa의 GroEL은개부분 가용성 분획에서 나타났고, CGTase band는 GroEL/ ES의 공발현에 의해 가용성 분획에서 70 kDa의 뚜렷한 CGTase band를 확인할 수 있었다 (Fig.
- 공발현을 행하였다. 먼저 GroEL/ES 발현에있어서 L-arabinose의 최적 농도를 결정하였다. CGTase 발현을 위한 IPTG 최적 농도는 1 mM로 결정되었으며, 10 ml LB (20 fig/ml ampicillin과 20 fig/ml chloramphenicol 포함) tube 에서 0.
- 02% MgSOQ로 실험하였다. 즉, 숙주세포인 BL21(DE3)과 pTCGTl 단독 발현, pGro7과의 공발현 형질전환체등 3종을 CS 배지 (1 mM IPTG와 1 mg L-ara- binose/ml의 함유 배지)에 도말하여 37 °C 에서 20 시간 배양하여 iodine 증기로 colony 활성 염색을 하였다.
대상 데이터
- E. coli 배양에는 LB medium (1% Bacto-tryptonez 0.5% Bacto-yeast extract, 0.5% NaCl)을 사용하였다. cgt 단독 발현을 위한 배지에는 20 μg/ml ampicillin이 함유된 LB 배지에서 배양하였고, gmEI/ES와 cgt 공발현 배지는 20 μg/ml ampicillin과 20 μg/ml 산Mramphenicol이 함유된 LB 배지에서 배양하였다.
- coli 세포는 20 μg/ml ampicillin (pTCGTl의 선별)과 20 μg/ml chloramphenicol (pGro7의 선별)이 첨가된 LB agar 배지에서 선별하였다. pTCGTl만함 유한 균주는 20 jtzg/ml ampicillin이 첨가된 LB agar배지에서 선별하였다.
- 재조합 단백질의 발현을 위해 E. coli BL21(DE3)[F; ompTr rB; m (DE3)]를 주요 숙주세포로 사용하였다. PET-21 vector에 B.
- coli BL21(DE3) 에 co-transform- ation 시켰다. 형질전환된 E. coli 세포는 20 μg/ml ampicillin (pTCGTl의 선별)과 20 μg/ml chloramphenicol (pGro7의 선별)이 첨가된 LB agar 배지에서 선별하였다. pTCGTl만함 유한 균주는 20 jtzg/ml ampicillin이 첨가된 LB agar배지에서 선별하였다.
이론/모형
- CGTase의 활성은 Leujeune등 [9] 에 의해 제안된 methyl orange 법으로 측정하였다. 이 방법은 낮은 온도 (16℃)와 낮은 pH에서 methyl orange와 CD 사이에 inclusion com- plex를 형성시킴으로써 CGTase의 활성을 유용하게 측정할 수 있는 방법이다.
- 선별된 형질전환체의 전분 가수분해 활성의 검출을 위해 iodine 방법[7]에 의해 전분이 함유된 CS 배지 (1% Soluble starch, 0.5% Bacto-peptone, 0.5% Bacto-yeast extract, 0.1% K2HPO4, 0.02% MgSOQ로 실험하였다. 즉, 숙주세포인 BL21(DE3)과 pTCGTl 단독 발현, pGro7과의 공발현 형질전환체등 3종을 CS 배지 (1 mM IPTG와 1 mg L-ara- binose/ml의 함유 배지)에 도말하여 37 °C 에서 20 시간 배양하여 iodine 증기로 colony 활성 염색을 하였다.
성능/효과
- 4) CGTase band (70 kDa)를 Image analyzer로 scanning 분석하였다. CGTase 단독 발현에서는 가용성 분획에서 CGTase band 비율이 18.8%로 나타났고, GroEL/ES 공발현에서는 27.9% 로 약 32%가 증가하였다 (Table 1). 그리고 단독 발현에서는 CGTase 총 단백질 중 20.
- 25);">600에서 첨가하였을 때 활성형 CGTase의 생산이 증가되었다. GroEL/ES 공발현 조건에서는 가용성 CGTase 활성이 0.7〜 0.73 unit/ml로 단독 발현의 0.36-0.56 unit/ml에 비해 약 1.5 배 정도 증가함을 알 수 있었다. SDS-PAGE 분석에서는 GroEL/ES 공발현 조건에서 총 CGTase의 33.
- 5 배 정도 증가함을 알 수 있었다. SDS-PAGE 분석에서는 GroEL/ES 공발현 조건에서 총 CGTase의 33.6%정도가 가용성 형태로 생산됨을 알 수 있었다.
- 그리고 CGTase와 GroEL/ES 단백질의 발현걍상을 알아보기 위해, 균체를 가용성과 비가용성 분획으로 4누어 SD&PAGE를 행하였다. 그 결과 60 kDa의 GroEL은개부분 가용성 분획에서 나타났고, CGTase band는 GroEL/ ES의 공발현에 의해 가용성 분획에서 70 kDa의 뚜렷한 CGTase band를 확인할 수 있었다 (Fig. 2B). 이것은 과 생산된 GroEL/ES chaperone 단백질이 CGTase 봉입체를 가용화하며, 또한 unfolding 된 CGTase 단백질을 활성형의 3 차 구조로 환원시키는 역할을 한 것으로 사료된다 [14],
- 5 시간 때 각각 1 mM의 IPTG를 첨가하였다. 그 결과, L-arabinose 첨가 후 1.5 시간 유도시킨 후 1 mM IPTG를 첨가하는 것이 0.73 unit/ml로 가장 높게 나타났다 (Fig. 3). 그리고 CGTase 활성은 IPTG 첨가 후 2.
- 3). 그리고 CGTase 활성은 IPTG 첨가 후 2.5 시간 경과 후 (배양 6시간 째) 활성이 최고 수준에 달하고, 그 이후에는 큰 활성의 증가가 없거나 감소하였다. 이는 배양 4시간 동안 세포의 성장이 급속히 이루어지면서 6시간 이후로 산물의 생성도 빨라지게 되고, 과잉 생산된 단백질의 응집되는 속도도 빨라지게 되었기 때문이다.
- 9% 로 약 32%가 증가하였다 (Table 1). 그리고 단독 발현에서는 CGTase 총 단백질 중 20.8%가 가용성 분획으로 전환되었지만, 공발현에서 33.6%가 가용성 분획으로 전환되었다. 이 결과는 GroEL/ES chaperone과의 공발현으로 비가용성 CGTase의 많은 양이 가용성 CGTase 단백질으로 전환되었음을 나타낸다.
- 본 실험에서 사용할 target 단백질은 Bacillus macemns의 cyclodextrin glucanotrasferase (CGTase)로 약 70 kDa의 분자량으로 E. coil에서 비가용성 봉입체 형태로 발현됨을 확인하여 [3, 15] GroEL/ES chaperone과 공발현을 통해 수용성 및 활성형의 CGTase을 발현 . 생산하고자 하였다.
- 숙주세포인 BL21(DE3)과 pTCGTl 단독 발현, pGro7과의 공발현 형 질전환체를 CS 배지 (cgt와 groEVES 유도제를 첨가하지 않은 배지, 1 mM IPTG와 1 mg L-arabinose/ml의 함유 배지)에 도말하여 37 °C에서 20 시간 배양 후 iodine 증기에 의해 colony 활성 염색을 한 결과, 유도제 비 첨가 배지에서는 전분 분해 활성이 전혀 나타나지 않은 반면, 유도체 첨가한 pTCGTl 단독 발현과 pGro7과의 공 발현에서 큰 전분 분해 환을 형성하여 CGTase의 활성을 나타내었다 (Fig. 1A, IB). 이 결과로 CGTase 단독발현과 GroEL/ES 공 발현에서 모두 성공적으로 CGTase가 발현됨을 알 수 있었다.
- 6%가 가용성 분획으로 전환되었다. 이 결과는 GroEL/ES chaperone과의 공발현으로 비가용성 CGTase의 많은 양이 가용성 CGTase 단백질으로 전환되었음을 나타낸다.
- 1A, IB). 이 결과로 CGTase 단독발현과 GroEL/ES 공 발현에서 모두 성공적으로 CGTase가 발현됨을 알 수 있었다. CGTase 단독발현인 경우 생산된 CGTase의 대부분은 비가용성 봉입체로 생산됨은 이미 보고된 바 있다 [3, 15].
- 이상의 결과로부터 CGTase와 GroEL/ES의 공발현계는 CGTase의 용해도 향상 및 활성형 생산에 효과가 큰 있는 것으로 사료된다.
- coli cell에 co-transformation 시켰다. 재조합 E. coil에서 IPTG와 L-arabinose의 최적 농도를 결정하기 위해 행한 결과 1 mM IPTG, 0.3 mg L-arabinose/ml 에서 가장 높은 CGTase 활성을 나타내었다. 그리고 tube에서는 L-arabinose와 IPTG를 각각 0.
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