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문제 정의
- 본 실험은 원시난포의 체외배양 체계를 확립할 수 있는 가능성을 검토하기 위해 0, 5, 10, 15 및 20일령 마우스에서 분리한 난소를 20, 15, 10, 5 및 일 동 안 organ cuture 하여 난소의 성장률, 난자의 회수율과 성장률 및 난자의 핵 성숙 단계를 조사하여, 비교, 검토하였다. 그 결과를 요약하면 다음과 같다.
- 본 연구는 원시난포의 체외배양체계를 확립할 수 있는 가능성을 검토하기 위해 신생 마우스에서 분리한 각 일령별 난소를 organ culture 하여 난소의 성장율, 난자의 회수율과 성장율 및 난자의 핵 성숙 단계를 조사하여 비교 검토하였다
제안 방법
- Juvenile mouse에서 분리한 난소의 organ culture가 가능한지를 검토하기 위해 배양한 난소의 크기, 난자의 회수율과 성장율 및 난자의 핵 성숙 정도를 다음과 같이 조사하였다.
- 23 mM pyruvic acid, 50 mg/ I streptomycine sulfate, 75 mg/ I penicillin G, 3 mg/ml BSA, 5 ng/ml FSH, 1 ng/ml EGF와 10%의 fetal bovine serum(FBS)를 첨가한 것을 기 본배 양액 으로, 난소 배 양은 기 본배 양액 을 이용하였고, 난자 성숙배양에는 EGF를 첨가하지 않은 기본배양액에 100 ng/ml FSH와 1 ng/ml hCG를 첨가하였다. 각 배양액은 사용 직전에 FSH, EGF 및 FSH 등을 첨가하였다.
- 공시동물은 ICR 계통의 마우스로 암컷 마우스는 2.5 IU의 PMSG와 hCG를 48시간 간격으로 복 강 주사하고, 수컷 마우스와 24시간 동안 합사하여 vaginal plug 확인 후 17일 되었을 때 각 cage에 분리 하여 사육하였다. 난소의 기관배양(organ culture)을 위한 실험에는 태어난 날을 0일로 하여 0, 5, 10, 15 및 20일령의 마우스를 이용하였다.
- 1 ml의 M2 배양액에서 3회, 5분간씩 세정하여 반응하지 않는 DAPI분자를 제거하였다. 깨끗하게 닦은 slide glass 위에 wax:vaseline spot을 만든 후 배양시킨 난자를 올리고 coverslip을 가볍게 누른 후 형광현미경을 사용하여 난자의 핵 성숙 단계를 비교. 관찰하였다.
- 난소 내의 난자가 어느 정도 성숙하였는지를 확인하기 위해 0, 5, 10, 15일령 마우스의 난소를 20, 15, 10, 5일 동안 각각 배양하여 20일령으로 맞추고, organ culture를 완료한 난소에서 분리한 난자를 18시간 동안 체외배양한 후 염색하여 난자의 핵 성숙 단계를 Germin히 vesicle(GV), Germin이 vesicle breakdown(GVBD), Metaphase I (M I), Anaphase I(A I), Metaphase H(M ) 및 Degeneration(Deg)으로 나누어 각 일령별로 난자의 핵 성숙 단계를 비교하였다.
- 난소 내의 난자가 어느 정도 성장하였는지를 확인하기 위해 0, 5, 10, 15일령 마우스의 난소를 20, 15, 10, 5일 동안 각각 배양하여 20일령으로 맞추고, organ culture를 완료한 난소에서 난자를 회수하여 난자의 회수율을 조사하고, 모든 공시 난자는 현미 경하에서 투명 대를 제외한 난자의 직경을 6회 반복해서 측정하여 면적을 계산하고 각 일령별로 난자의 성장율을 비교하였다
- 난소와 난자를 체외배양할 목적으로 사용한 배양액은 Way mouth MB752/1에 0.23 mM pyruvic acid, 50 mg/ I streptomycine sulfate, 75 mg/ I penicillin G, 3 mg/ml BSA, 5 ng/ml FSH, 1 ng/ml EGF와 10%의 fetal bovine serum(FBS)를 첨가한 것을 기 본배 양액 으로, 난소 배 양은 기 본배 양액 을 이용하였고, 난자 성숙배양에는 EGF를 첨가하지 않은 기본배양액에 100 ng/ml FSH와 1 ng/ml hCG를 첨가하였다. 각 배양액은 사용 직전에 FSH, EGF 및 FSH 등을 첨가하였다.
- 5 IU의 PMSG와 hCG를 48시간 간격으로 복 강 주사하고, 수컷 마우스와 24시간 동안 합사하여 vaginal plug 확인 후 17일 되었을 때 각 cage에 분리 하여 사육하였다. 난소의 기관배양(organ culture)을 위한 실험에는 태어난 날을 0일로 하여 0, 5, 10, 15 및 20일령의 마우스를 이용하였다.
- 난소의 성장 여부를 확인하기 위해 0, 5, 10, 15일령 마우스의 난소는 20, 15, 10, 5일 동안 각각 배양하여 20일령으로 맞추고, 모든 공시 난소는 일 령별로 장축과 단축을 7회 반복 측정하여 면적을 4/ 장축X단축으로 계산하였고, 각 일령별로 배 양 전과 배양 후의 각 난소의 크기를 비교 분석하였다.
- 난자의 핵형분석을 위하여 DNA-특이 형광염료인 4, 6-diamidino-20phenylindole (DAPI)를 최종농도 lOOz/m/ml로 하여 5분간 37℃에서 반응시켰다. 1 ml의 M2 배양액에서 3회, 5분간씩 세정하여 반응하지 않는 DAPI분자를 제거하였다.
- 생후 0, 5, 10, 15, 20일령의 마우스를 경추 탈골 법으로 도살하여, 복부를 절개하고 난소를 적출한 후 주위의 결합조직을 26 G 주사바늘을 사용하여 제거하였다. 분리한 난소는 M2+BSA 배양액으로 3회 세척하고 난소배양액으로 2회 세척하여 난소의 배양에 사용하였다.
- 22 "m millipore filter를 올리고, 밖의 well에는 autoclave 된 증류수를 담고 하나의 dish 당 난소를 4개씩 felter 위에 올려 배양하였다. 이때 배양액은 난소의 표면에 얇은 배 양액막을 형 성할 정도로 조절하여 0, 5, 10, 15일령 마우스의 난소는 20, 15, 10, 5일 동안 20일이 될 때까지 5% CO2 Incubator에서 배양하였고, 20일령의 난소는 대조 구로 이용하였다(Fig. 1). 배양액은 2일마다 1/2씩 교환하였다.
이론/모형
- 난소와 난자의 세척에는 4 mg/ml BSA가 첨가된 M2 배양액 (M2+BSA, Whittingham, 1971)을 사용하였고, 난자 분석 등의 목적으로 4 mg/ml BSA가 첨가된 phosphate buffer solution(PBS+BSA, Ninomiya 등, 1989)을 사용하였다. 각 배양액 및 PBS는 stock solution을 조제해 일정량씩 혼합하여 warking solution을 만들고 millipore filter(0.
성능/효과
- 0, 5, 10, 15 및 20일령의 마우스에서 분리한 난 소를 organ culture 한 후 회수한 난자를 18시간 동안 체외배양 시켜 핵 성숙 단계를 관찰한 결과는 Table 3에서 보는 바와 같이 0일령은 MI 2.6%, 5일령은 GVBD 0.5%와 MI 2.8%, 10일령은 MI 7.8%, AI 1.1%와 Mil 0.6%, 15일령은 MI 11.6%, AI 0.9%와 Mil 0.6%, 20일령은 MI 14.1%와 Mil 9.3%로 일령이 증가할수록 GVBD 이상으로 성숙 된 난자가 증가하였으며 Ⅱ는 20일령에서 가장 많이 관찰되었다.
- 1. Organ culture 전과 후의 각 일령에 따른 난소의 면적 차이는 0일령 35.9%, 5일령 8.7%, 10일령 1.2% 및 15일령 14.4%로 15일령을 제외하고는 배양일령이 증가할수록 면적 차이는 감소하였다.
- 2. Organ culture 후 난자의 회수율과 난자의 직 경은 배양일령이 증가할수록 증대되었다.
- 3. GV기 이상의 핵 성숙은 organ culture 후 배양 일령이 증가할수록 진행되는 단계에 있는 것으로 나타났다.
- Plate 1의 A는 0일령의 배양 난소이며, B, C는 5일과 10일령의 배양 난소로 둘 다 난포 강은 관찰되지 않았으나, 다른 일령보다 더 큰 난포가 관찰되었다. 각 일령이 증가할수록 배 양 난소의 크기가 커진 것을 알 수가 있었고(Table 1, Fig. 4, Plate 1~2), 또한 배양 난소의 표면에서 관찰되어지는 난포가 점점 더 커지는 것을 관찰할 수 있었다.
- 1%로 나타났다. 난소는 배양 일령이 증가할수록 각 일령 간에 있어서 배양 난소 간의 면적 차이는 작은 것으로 나타났다.
- 5%였다. 따라서 난소는 체내에서 0일에서 10일까지는 급격히 발달되었다가 10일에서 20일까지는 발달의 증 가 비율이 둔화되는 것을 관찰할 수 있었다. 또한 20일령과 0일령 난소의 면적은 약 2배의 차이가 있었다.
- 4%로 나타났다. 배양일령에 따른 면적증가 비율은 감소하였으나, 15일령에서는 5일 및 10일령보다는 증가한 것으로 나타났다.
- 본 실험에서 난소의 organ culture 후 난자를 회수하였을 때 소수의 난자를 제외한 대부분의 난자 가 GV기인 것을 확인하였는데, 본 실험의 배양체 계에서는 meiosis-arresting 물질을 첨가하지 않았으므로 난소를 구성하고 있는 물질의 endogenouse 한 생리적인 기작에 의해 meiotic arrest를 유지한 것으로 추정된다. 아직까지 meiotic arrest를 유지 시키는 생화학적 경로는 규명되지 않았으나, Tsafriri 등(1982)은 granulosa cell에서 분비되는 purine 또는 oocyte maturation inhibitor(DHI) 등의 형태인 물질로 추측된다고 하였고, 많은 연구자들이 난포 벽과 난자와의 관계에서 볼 때 난포 벽에서 meiotic arrest factor가 분비되는 것으로 생각된다고 보고하였다.
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