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문제 정의
- 특히 버섯이 지닌 생리적 효과는 영지, 양송이, 표고, 팽이 등(M)의 버섯에서만 알려져 있을 뿐 만가닥버섯의 항암효과 등 다양한 생리효능이 기대되고 있으나 유효성분에 대한 연구는 아직 이루어진 바 없다. 본 연구에서는 시료를 신속하고 효율적으로 추출할 수 있는 잇점을 지니고 있을 뿐만 아니라 추출용매와 에너지를 절약할 수 있으며 추출 대상으로는 수분을 함유한 모든 천연물 시료가 가능한 (5-11) 마이크로웨이브 추출 (microwave-assisted extraction, MAE)을 이용하여 만가닥버섯의 생리활성을 측정하고 그것들의 적정 추출조건을 설정하고자 하였다. 즉, microwave power 및 추출시간에 따른 용매별 만가닥버섯의 추출물에 대한 총 폴리페놀 함량, 전자공여작용, tyrosinase 저해작용, 아질산염 소거작용을 측정하여가장 효율적인 MAE 조건을 설정하고자 하였다.
제안 방법
- 마이크로웨 이브 추출은 마이크로웨이브 추출장치(MAP, Soxwave-100, Prolabo, France)를 사용하였으며 에너지 용량(watts)과 추출시간(min)을 달리하여 상압의 밀폐형 추출관에서 추출하였다.
- 2 여과지를 사용하여 여과하였다. 이 과정을 3회 연속 반복하였으며 회전 감압 증발기(Rotavapor R-123, Buchi, Swizerland)로 감압 농축한 후 추출액과 동량인 증류수를 가하여 생리활성을 측정하는데 사용하였다.
- 즉, 희석액 5ml에 Folin reagent 5 ng을 가하고 3분간 정치한 다음 5 ml의 10% NazCQj용액을 가하였다. 이 혼합액을 1시간 동안 정치한 후 분광광도계 (UV/VIS Spectrophotometer, Jasco, Japmn) 를 사용하여 760 nm에서 흡광도를 측정하고 (+)catechin을 이용하여 작성한 표준곡선으로부터 총 폴리페놀 함량을 구하였다.
- 0으로 달리하여 반응용액의 부피를 10 mL로 하였다. 이를 37°C에서 1시간 동안 반응시킨 다음 반응액을 1ml씩 취하고 여기에 2% 초산 5ml Griess 시약(acetic acid에 1% sulfanylic acid와 1% naphthylamine을 1 : 1 비율로 혼합) 0.4 ml를 가하여 잘 혼합시켜 15분간 실온에서 방치시킨 후 분광광도계를 사용하여 520 nm에서 흡광도를 측정하여 잔존하는 아질산염량을 구하였다. 그리고 대조구는 Griess 시약 대신 증류수 0.
- 물 추출물의 경우 전자공여능은 microwave power에 상관없이 다른 용매 추출물에 비해 가장 높았는데 90 W에서는 99% 에탄올 추출물과 비슷하였다. 이에 따라 가장 적절하다고 생각되는 90 W로 power를 고정하여 추출 시간을 1〜15분으로 증가시키면서 전자공여작용을 측정하였다. Fig.
- 전자공여작용(electron donating abilities, EDA) 은 강 등(13)의 방법을 변형하여 각각의 추출물에 대한 DPPH(a, a-diphenyl- picrylhydrazyl)의 전자공여효과로 각 시료의 환원력을 측정하였다. 즉, 추출물 0.
- 방법으로 측정하였다. 즉, 1 mM 아질산나트륨 용액 1ml에 각각의 추출물을 2 ml을 가하고 여기에 0.1 N 염산(pH 1.2) 및 0.2 N 구연산 완충용액(pH 3.0, 4.2 및 pH 6.0)을 7 가하여 반응용액의 pH를 각각 1.2, 3.0, 4.2 및 6.0으로 달리하여 반응용액의 부피를 10 mL로 하였다. 이를 37°C에서 1시간 동안 반응시킨 다음 반응액을 1ml씩 취하고 여기에 2% 초산 5ml Griess 시약(acetic acid에 1% sulfanylic acid와 1% naphthylamine을 1 : 1 비율로 혼합) 0.
- 본 연구에서는 시료를 신속하고 효율적으로 추출할 수 있는 잇점을 지니고 있을 뿐만 아니라 추출용매와 에너지를 절약할 수 있으며 추출 대상으로는 수분을 함유한 모든 천연물 시료가 가능한 (5-11) 마이크로웨이브 추출 (microwave-assisted extraction, MAE)을 이용하여 만가닥버섯의 생리활성을 측정하고 그것들의 적정 추출조건을 설정하고자 하였다. 즉, microwave power 및 추출시간에 따른 용매별 만가닥버섯의 추출물에 대한 총 폴리페놀 함량, 전자공여작용, tyrosinase 저해작용, 아질산염 소거작용을 측정하여가장 효율적인 MAE 조건을 설정하고자 하였다.
- Microwave power 60 W에서 총 폴리페놀 함량은 50% 에탄올 주줄물이 가장 높게 나타났으나 90 W 이상에서는 물 추출물이 가장 높게 나타났다. 추출시간에 따른 만가닥버섯의 용매별 추출물의 총 폴리페놀 함량을 알아보기 위해 microwave power를 90 W로 고정하여 측정하였다. 그 결과 Table 2에서 보는 바와 같이 물 추출물의 경우 총 폴리페놀 함량은 추출시간 2분에서 5분 사이에 급격히 증가하여 5분추출시 거의 평형에 이르렀다.
- 0)에 용해하여 사용하였다. 효소활성의 측정은 10 mM catechol 용액 2.8 mL에 tyrosinase 조효소액 0.2 mL, 추출액 0.1 mL를 가하고 분광 광도게를 사용하여 420 nm에서 흡광도 변화를 측정하였다. Tyrosinase에 대한 효소 활성 저해 효과는 단위시간당 변화된 초기흡광도의 변화값을 측정하여 다음의 식에 의해 계산하였다.
대상 데이터
- 본 실험에 사용한 만가닥버섯(Lyop/jyllum ulmarium)은 수향농산에서 구입하여 깨끗이 수세한 후 표면의 물기를 제거하여 약 40 mesh로 다져서 사용하였다. 추출용매로는 물, 50% 에탄올, 99% 에탄올을 사용하였다.
- 약 40 mesh로 다져서 사용하였다. 추출용매로는 물, 50% 에탄올, 99% 에탄올을 사용하였다.
데이터처리
- Means with the same lettered superscripts in a column are not significantly different at p <0.05 level by Duncan's multiple range test.
- Means with the same lettered superscripts in a same row are not significantly different at p <0.05 level by Duncan's multiple range test.
이론/모형
- Tyrosinase 저해 효과 측정은 Wong 등(14)의 방법에 따라 측정하였으며 tyrosinase 조효소액은 mushroom tyrosinase (Sigma, T7755, 110 units/ml)를 50 mM sodium phosphate buffer(pH 7.0)에 용해하여 사용하였다. 효소활성의 측정은 10 mM catechol 용액 2.
- 아질산염 소거작용(nitrite-scavenging effect)는 Gray 등(15)의 방법으로 측정하였다. 즉, 1 mM 아질산나트륨 용액 1ml에 각각의 추출물을 2 ml을 가하고 여기에 0.
- 총 폴리페놀 함량(total polyphenol content)은 Fol ins-Denis방법(12)으로 측정하였으며, 각각의 추출조건에 따라 제조된 만가닥버섯 추출물의 1/2 희석액을 사용하였다. 즉, 희석액 5ml에 Folin reagent 5 ng을 가하고 3분간 정치한 다음 5 ml의 10% NazCQj용액을 가하였다.
성능/효과
- 물 추출물, 50% 에탄올 추출물, 99% 에탄올 추출물은 추출시간 5분과 10분 사이에 급격히 증가하였으며 10분에서는 세 가지 추출물 모두 평형에 이르렀다. 15분 추출 시 물 추출물, 50% 에탄올 추출물, 99% 에탄올 추출물의 전자공 능은 각각 7.43%, 6.44%, 6.85%으로 가장 높은 값을 나타내었다. 용매별로 살펴본 만가닥버섯의 전자공여 능이 물 추출물에서 높게 나타난 결과는 김 등"이 보고한 마늘 추출물의 전자공여능에서도 유사한 경향을 나타내었다.
- 그 결과 Table 2에서 보는 바와 같이 물 추출물의 경우 총 폴리페놀 함량은 추출시간 2분에서 5분 사이에 급격히 증가하여 5분추출시 거의 평형에 이르렀다. 50% 에탄올 추출물과 99% 에탄올 추출물의 총 폴리페놀 함량은 추출시간을 5분까지는 증가하는 경향을 보이다가 그 이상에서는 약간 감소하는 경향을 나타내었다. 99% 에탄올 추출물 경우는 50% 에탄올 추출물보다 완만히 증가하는 경향을 나타내었다.
- 50% 에탄올 추출물과 99% 에탄올 추출물의 총 폴리페놀 함량은 추출시간을 5분까지는 증가하는 경향을 보이다가 그 이상에서는 약간 감소하는 경향을 나타내었다. 99% 에탄올 추출물 경우는 50% 에탄올 추출물보다 완만히 증가하는 경향을 나타내었다. 물 추출물은 추출시간 1분과 2분에서는 50% 에탄올 추출물과 99% 에탄올 추출물에 비해 낮은 값을 나타내었으나 5분 이상에서는 가장 높은 값을 나타내어 15분 추출시에는 2.
- 이에 따라 가장 적절하다고 생각되는 90 W로 power를 고정하여 추출 시간을 1〜15분으로 증가시키면서 전자공여작용을 측정하였다. Fig. 2에서 보는 것과 같이 용매별 만가닥버섯 추출물의 전자공여능은 추출시간을 증가시킴에 따라 증가하는 경향을 나타내었다. 물 추출물, 50% 에탄올 추출물, 99% 에탄올 추출물은 추출시간 5분과 10분 사이에 급격히 증가하였으며 10분에서는 세 가지 추출물 모두 평형에 이르렀다.
- 또한 50% 에탄올 추출물과 99% 에탄올 추출물 의총 폴리페놀 함량은 물 추출물에 비해 그 증가가 완만하였다. Microwave power 60 W에서 총 폴리페놀 함량은 50% 에탄올 주줄물이 가장 높게 나타났으나 90 W 이상에서는 물 추출물이 가장 높게 나타났다. 추출시간에 따른 만가닥버섯의 용매별 추출물의 총 폴리페놀 함량을 알아보기 위해 microwave power를 90 W로 고정하여 측정하였다.
- 50% 에탄올 추출물과 99% 에탄올 추출물의 경우 아질산염 소거능은 뚜렷한 pH에 의존적인 경향을 보인 반면에 물 추출물은 pH 증가에 크게 영향을 받지 않았다. pH 1.2에서 물 추출물은 50% 에탄올 추출물과 99% 에탄올 추출물의 아질산염 소거능보다 확연히 낮은 값을 나타내었다. 팽이버섯의 아질산염 소거능은 추출용매 중에 물을 사용하였을 경우 가장 효율적이라고 하였는데 만가닥버섯의 경우에는 99% 에탄올을 사용하였을 경우에 가장 효율적으로 나타났다.
- 0 이상에서는 microwave power를 증가시킴에 따라 매우 완만한 감소경향을 나타내었다. pH 12에서 99% 에탄올 추출물은 물 추출물에 비해 약 5배의 높은 값을 나타내었다. Microwave power를 90 W로 고정하여 추출시간에 따른 아질산염 소거능을 측정하였으며 그 결과를 Table 3에 나타내었다.
- 3에 나타내었다. 그 결과 microwave power를 증가시킴에 따라 tyrosMse 저해능은 증가하는 경향을 나타내었는데, 90 W 이상에서는 매우 급격히 증가하였다 물 추출물과 50% 에탄올 추출물의 경우에 tyrosinase 저해능은 큰 차이를 나다내지 않았으며 99% 에탄올 추출물의 tyrosinase 저해능은 특히 다른 추출물들에 비해 높았다. 추출시간 증가에 따른 만가닥버섯의 용매별 추출물의 tyrosinase 저해능을 측정하여 Fig.
- 26 mg%로 60 W보다 크게 증가하였고 120 W에서는 거의 평형에 이르렀다. 또한 50% 에탄올 추출물과 99% 에탄올 추출물 의총 폴리페놀 함량은 물 추출물에 비해 그 증가가 완만하였다. Microwave power 60 W에서 총 폴리페놀 함량은 50% 에탄올 주줄물이 가장 높게 나타났으나 90 W 이상에서는 물 추출물이 가장 높게 나타났다.
- 26 mg% 이었다. 만가닥 버섯의 총 폴리페놀 함량이 microwave power 90 W 이상에서와 추출시간 5분 이상에서 추출용매를 물로 하였을 경우에 가장 높았다. 그러나 섬쑥부쟁이의 물 추출물이 3.
- Microwave power를 90 W로 고정하여 추출시간에 따른 아질산염 소거능을 측정하였으며 그 결과를 Table 3에 나타내었다. 물 추출물과 99% 에탄올 추출물의 아질산염 소거능은 추출시간에 거의 영향을 받지 않았으며 50% 에탄올 추출물은 매우 완만하게 증가하는 경향을 나타내었다. 50% 에탄올 추출물과 99% 에탄올 추출물의 경우 아질산염 소거능은 뚜렷한 pH에 의존적인 경향을 보인 반면에 물 추출물은 pH 증가에 크게 영향을 받지 않았다.
- 99% 에탄올 추출물 경우는 50% 에탄올 추출물보다 완만히 증가하는 경향을 나타내었다. 물 추출물은 추출시간 1분과 2분에서는 50% 에탄올 추출물과 99% 에탄올 추출물에 비해 낮은 값을 나타내었으나 5분 이상에서는 가장 높은 값을 나타내어 15분 추출시에는 2.26 mg% 이었다. 만가닥 버섯의 총 폴리페놀 함량이 microwave power 90 W 이상에서와 추출시간 5분 이상에서 추출용매를 물로 하였을 경우에 가장 높았다.
- 물 추출물의 경우에 전자공여능은 microwave power를 증가시킴에 따라 증가하는 경향을 나타내었다. 이에 반해 50% 에탄올 추출물과 99% 에탄올 추출물의 경우에 전자공여능은 증가하다가 90 W에서 평형에 이르렀다. 물 추출물의 경우 전자공여능은 microwave power에 상관없이 다른 용매 추출물에 비해 가장 높았는데 90 W에서는 99% 에탄올 추출물과 비슷하였다.
- 그 결과 microwave power를 증가시킴에 따라 tyrosMse 저해능은 증가하는 경향을 나타내었는데, 90 W 이상에서는 매우 급격히 증가하였다 물 추출물과 50% 에탄올 추출물의 경우에 tyrosinase 저해능은 큰 차이를 나다내지 않았으며 99% 에탄올 추출물의 tyrosinase 저해능은 특히 다른 추출물들에 비해 높았다. 추출시간 증가에 따른 만가닥버섯의 용매별 추출물의 tyrosinase 저해능을 측정하여 Fig. 4에 나타내었다 물 추출물과 50% 에탄올 추출물의 경우 tyrosinase 저해능은 추출시간을 5분이상으로 증가시키면서부터 완만하게 증가하는 경향을 나타내었다 99% 에탄올 추출물의 경우에 tyrosinase 저해능은 물추즐물과 50% 에탄올 추출물에 비하여 월등히 높았으며 추출 시간을 증가시킴에 따라 점진적인 속도로 증가하는 경향을 나타내었다. 김등(8)은 마늘의 tyrosinase 저해능에서도 위와 유사한 경향을 나타낸다고 하였으므로, 추출용매로서 99% 에탄올을 사용할 경우 tyrosinase 효소활성 억제에 매우 유용할 것으로 생각된다.
- 추출용매에 관계없이 만가닥버섯 추출물의 총 폴리페놀 함량은 microwave power를 증가시킴에 따라 증가하는 경향을 나타내어 90 W에서 물 추출물, 50% 에탄올 추출물, 99% 에탄올 추출물은 각각 2.26 mg%, 1.98 mg%, 1.26 mg%로 60 W보다 크게 증가하였고 120 W에서는 거의 평형에 이르렀다. 또한 50% 에탄올 추출물과 99% 에탄올 추출물 의총 폴리페놀 함량은 물 추출물에 비해 그 증가가 완만하였다.
- 2에서 물 추출물은 50% 에탄올 추출물과 99% 에탄올 추출물의 아질산염 소거능보다 확연히 낮은 값을 나타내었다. 팽이버섯의 아질산염 소거능은 추출용매 중에 물을 사용하였을 경우 가장 효율적이라고 하였는데 만가닥버섯의 경우에는 99% 에탄올을 사용하였을 경우에 가장 효율적으로 나타났다. 만가닥버섯의 아질산염 소거능이 가장 두드러지게 나타난 pH 1.
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