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문제 정의
- 이병의 방제는 주로 합성 화학 살균제에 의존하고 있으나 이에 따른 문제점으로 인해 생물학적 방제 연구가 최근 국내외에서 이루어지고 있다. 따라서 본 연구에서는 P. aphanidermatum의 생물학적 방제를 위해 분리된 B. stearothermophilus YC4194에 의한 in vitro와 in vivo에서의 억제효과를 확인하고자 하였다.
제안 방법
- 모 잘록병 방제효과는 실내 식물 생육상실험에서 기주 식물로 오이(신젠타종묘(주), 청미삼척)를 이용하였다. 1X105개/ml의 P. aphanidermatum 유주자낭을 시중에서 판매되는 원예용 상토 1/에 100ml씩 접종하고 polyvinyl bag 내에서 잘 섞어 30℃로 2일간 둔 후 75 mm 사각 플라스틱 pot에 파종하여 10일 동안 재배하였으며, 이 때 상토가 마르지 않도록 하였다. 그리고 각제제별로 상토 1 H 10 g을 섞어 주었다(Shen, 2002a).
- 제제와 병원균을 섞은 상토에 오이를 파종한직후 현재 시중에서 판매 중인 화학 살균제 dimethomorph (주식회사 동방아그로), metalaxyl(주식회사 경농), ethaboxam (주식회사 미성)을 생산자의 사용 추천 농도에 맞게 희석하여 pot에 각각 5 m/씩 분주하였다. 30℃ 온실에서 10 일 동안 재배하면서 방제효과를 비교하였다.
- 1 Z) 전면에 골고루 도말하였다. 30℃에서 3일 동안 배양한 후 투명 환이 형성된 colony수를 세어 대조구와 밀도를 비교하였다(Singh, 1999).
- 길항균 제제 및 방제효과. B. stearothermophilus YC4194 균주를 0.5 TSB 50 mZ에 접종하여 30℃에서 24시간 동안 진탕 배양한 것을 seed culture로 사용하였고, 본 배양은 2 I Erlenmeyer flask에 0.5 TSB 500 mL를 넣어 30℃ 로 3일간 진탕배양(180rpm)하였다. 배양액을 7, 000 rpm 에서 15분간 원심분리하여 상등액을 제거한 후 가라앉은 균체를 수확하였다.
- 1M MgSO4 solution에 현탁시키고 108 cfu/ml이 되도록 하여 현탁액 3 ml을 살균수와 함께 처리하였다. 그리고, 상등액은 현탁액과 같은 방법으로 3 m/을 처리하여 유주자낭 형성을 유도하였고, 2시간 간격으로 24시간 관찰하였다(Shen, 2002b). 형성 비율은 살균수 처리 24시간 후를 100으로 하여 결정하였다
- 근권에서의 밀도변화 오이를 파종한 후 3일 간격으로 근권의 상토를 채취하여 밀도조사를 하였다(Fig. 5). 길항균 제제만 처리한 곳에서는 9일 후 lOZfu/g으로 유지되던 것이 12일 후 lO'cfu/g으로 줄어들었고, 15일째는 106 cfu/g으로까지 그 밀도가 줄었다.
- 화학 살균제와의 효과 비교. 길항균 제제를 상토 1 I 에 10 g을 병원균과 함께 처리한 후 오이를 파종하고 화학 살균제인 dimethomorph, metalaxyl, ethaboxam을 분주하여 발병 억제효과를 관찰하였다(Fig. 4). 길항균 제제만 처리했을 때 59%의 방제가를 보였고, 화학살균제도 이와 비슷한 방제가를(50~62%) 나타내었다.
- 화학살균제와 방제효과 비교. 길항균은 talc와 bentonite 로 제제화 한 것을 병원균 접종 시 상토 1 l에 10 g을 접종하였다. 제제와 병원균을 섞은 상토에 오이를 파종한직후 현재 시중에서 판매 중인 화학 살균제 dimethomorph (주식회사 동방아그로), metalaxyl(주식회사 경농), ethaboxam (주식회사 미성)을 생산자의 사용 추천 농도에 맞게 희석하여 pot에 각각 5 m/씩 분주하였다.
- aphanidermatum-^: 수술용 칼로 약 8 mm 크기의 균사절편을 만들어 5개씩 petri dish에 나누고 살균수를 첨가한 후 형광등 아래에서 유주자낭 형성을 유도하였다. 길항세균의 작용을 알아보기 위해 0.5 TSB 배지에 3일간 배양한 길항균을 0.1M MgSO4 solution에 현탁시키고 108 cfu/ml이 되도록 하여 현탁액 3 ml을 살균수와 함께 처리하였다. 그리고, 상등액은 현탁액과 같은 방법으로 3 m/을 처리하여 유주자낭 형성을 유도하였고, 2시간 간격으로 24시간 관찰하였다(Shen, 2002b).
- 900 m/)에 배양하면서 사용하였다. 높은병원성을 유지하기 위하여 발병된 줄기를 채취하여 표면살균 후 병원균을 V8 agar 배지 상에서 재분리하여 사용하였다.
- 근권 토양의 길항균 밀도 변화. 오이를 파종한 후 0, 3, 6, 9, 12, 15일 동안 재배 후 오이 뿌리와 근처에 있는 흙을 조심스럽게 30℃에서 30분간 진탕한 후 토양 한천 희석평판법으로 희석하여 희석액 0.1 m/을 swollen chitin 배(MgSO4-7H2O 0.5 g, FeSO4-7H2O 0.01 g, ZnSO4 0.001 g, MnCl2 0.001 g, K2HPO4 0.7 g, KH2PO4 0.3 g, swollen chitin 0.1%(w/v), pH 7.0, Agar 15 g, D.W. 1 Z) 전면에 골고루 도말하였다. 30℃에서 3일 동안 배양한 후 투명 환이 형성된 colony수를 세어 대조구와 밀도를 비교하였다(Singh, 1999).
- 길항균 제제의 방제효과. 제제 종류별로 talc, zeolite,bentonite, talc + zeolite, talc + bentonite, zeolite+bentonite로 만들어 병원균과 함께 섞어 오이를 파종하여 방제효과를 관찰하였다. 그 결과 talc, zeolite, bentonite는 45-55% 의 방제가를 보인 반면, 두 보조제를 섞어서 사용한 talc+ zeolite, talc + bentonite, zeolite + bentonite는 58~70%의방제가를 보였다.
- 길항균은 talc와 bentonite 로 제제화 한 것을 병원균 접종 시 상토 1 l에 10 g을 접종하였다. 제제와 병원균을 섞은 상토에 오이를 파종한직후 현재 시중에서 판매 중인 화학 살균제 dimethomorph (주식회사 동방아그로), metalaxyl(주식회사 경농), ethaboxam (주식회사 미성)을 생산자의 사용 추천 농도에 맞게 희석하여 pot에 각각 5 m/씩 분주하였다. 30℃ 온실에서 10 일 동안 재배하면서 방제효과를 비교하였다.
- 피낭포자 현탁액 (104 spores/mZ) 발아 억제효과는 유리 slide 에 세균 현탁액 (IO** cfu/m/), 상등액과 동일양으로 처리하였고, 발아를 촉진하기 위하여 영양분으로 이ucose 100 ppm을 첨가하기도 하였다. 30℃에서 습도가 유지되도록하여 배양하였으며, 2시간 간격으로 발아율을 관찰하였다(Shen, 2002b).
- 화학 살균제와의 효과 비교. 길항균 제제를 상토 1 I 에 10 g을 병원균과 함께 처리한 후 오이를 파종하고 화학 살균제인 dimethomorph, metalaxyl, ethaboxam을 분주하여 발병 억제효과를 관찰하였다(Fig.
- 화학살균제와 방제효과 비교. 길항균은 talc와 bentonite 로 제제화 한 것을 병원균 접종 시 상토 1 l에 10 g을 접종하였다.
대상 데이터
- 이때 제제 1 g당 균 밀도는 109 집락수(colony forming unit)정도였다. 모 잘록병 방제효과는 실내 식물 생육상실험에서 기주 식물로 오이(신젠타종묘(주), 청미삼척)를 이용하였다. 1X105개/ml의 P.
- 1 TSA에서 30℃, 24시간 배양하였다. 병원균 Pythium aphanidermatum은 경상대학교 농생물학과에서 분리하여 보관 중인 균주를 분양받아 V8 agar 배지(V8 juice 100 ml, CaCO3 1 g, agar 18 g, D.W. 900 m/)에 배양하면서 사용하였다. 높은병원성을 유지하기 위하여 발병된 줄기를 채취하여 표면살균 후 병원균을 V8 agar 배지 상에서 재분리하여 사용하였다.
데이터처리
- 그리고 각제제별로 상토 1 H 10 g을 섞어 주었다(Shen, 2002a). 발병 정도는 발아 비율과 발아된 식물의 감염비율로 조사하였으며, 유의성은 Duncan's multiple range tests로 결정하였다.
성능/효과
- Bacillus stearothermophilus YC4194는 in vitro와 in vivo 에서 병원균 Pythium aphanidermatum에 대한 억제 효과를 보였다. In vitro 실험에서 P.
- 보였다. In vitro 실험에서 P. aphanidermatum의 유주포자낭 형성과 피낭포자 발아를 억제하였을 뿐 아니라 식물체에 적접 길항균 제제 처리 시 50% 이상의 방제가를 보였다. 그리고 다른 화학 살균제와 비슷한 방제효과를 보여 미생물 제제로서의 개발 가능성을 보여주었다.
- 제제 종류별로 talc, zeolite,bentonite, talc + zeolite, talc + bentonite, zeolite+bentonite로 만들어 병원균과 함께 섞어 오이를 파종하여 방제효과를 관찰하였다. 그 결과 talc, zeolite, bentonite는 45-55% 의 방제가를 보인 반면, 두 보조제를 섞어서 사용한 talc+ zeolite, talc + bentonite, zeolite + bentonite는 58~70%의방제가를 보였다. 그러나, 제제 종류별로 유의성 있는 차이를 보이지는 않았다(Fig.
- ap/ianidemWum의 피낭포자 발아 억제도 유주자낭 형성 억제와 유사하였다. 살균수만 처리한 대조구에서는 2시간 후 약 60%, 6시간 후에는 90% 이상 발아되었으나 YC4194를 직접 처리한 곳과 상등액을 처리한 곳에서는 12시간이 지나도 5% 내외로 발아가 현저하게 억제되었다. YC4194와 glucose 100ppm을 함께 처리한 곳에서 2시간 후 약 20%가 발아되었지만 그 후 시간이 지나도 더 이상 발아되지 않았다(Fig.
후속연구
- aphanidermatum의 유주포자낭 형성과 피낭포자 발아를 억제하였을 뿐 아니라 식물체에 적접 길항균 제제 처리 시 50% 이상의 방제가를 보였다. 그리고 다른 화학 살균제와 비슷한 방제효과를 보여 미생물 제제로서의 개발 가능성을 보여주었다.
- 이것은 병균 처리 시 기주 식물에서의 영양분 누출에 의해 길항균의 밀도가 높게 유지되는 것으로 생각되었다. 본 밀도 조사 및 발병 억제 실험은 상토에서 수행되었으므로 향후 미생물제제로서의 개발 가능성을 보다 확실히 알기 위해 포장에서의 실험을 수행할 필요가 있다.
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