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문제 정의
- 그러므로, 본 연구에서는 chitosan이 정상 마우스의 일차 체액 성 면역반응과 CY 처리로 억제된 체액성 면역반응을 조절할 수 있는지를 검토하고자, chitosan을 경구적으로 단독투여하거나 CY 와 병용투여하여 비장세포수, 비장세포중 IgM 용혈반 형성 세포 수 깇 혈청중 IgM 항체를 측정하였다.
제안 방법
- 5 mg/kg, 또는 250 mg/kg을 단독 또는 CY와 병용하여경〒투여하였다. CY는 주사직전에 생리식염액에 용해하여 20 mg/k;을 복강내에 주사하였고, 대조군에는 생리식염수만을 동일한 四 법으로 투여하였다.
- Chitosan을 마우스에 SRBC 항원주사 전 또는 항원주사 후에 단독 또는 CY와 병용하여 경구투여하고 비장세포수, SRBC에 대한 IgM 항체 용혈반 생성 세포수 (PFC) 및 혈청 중 IgM 항체 생성 능을 측정하여 chitosan이 정상 및 CY로 억제되는 일차 체액 성 뎐역반응에 미치는 영향을 알아 보았다.
- SRBC 부유액은 냉장보관된 면양혈액을 사용직전에 HBSS용액으로 3회 원심세척(2500 rpm, 5 min, 4°C)한 후 软 揷 cells/mZ의 농도로 부유 시켜 만들었다. SRBC 부유액 0.5 ml, guinea pig complement 0.3 ml, 10% FBS-HBSS용액 2.0 m/를 혼합한 액 50 B와 비장 세포 현탁액 50 B를 혼합하여 microchamber0]] 35 W 씩 주입하고, vaseline과 paraffin(l: 1) 혼액으로 밀봉하여 37°C에서 1시간 방치한 후 형성되는 용혈반 생성 세포수를 현미경하에서 측정하였다. 측정된 PFC수를 비장세포 1()6개중의 IgM 항체 생성 세포 수로 환산하여 나타내었다.
- Anti-mouse IgM phosphatase conjugate 를 blocking buffer 로 500배 희석하여 각 well에 50 B씩 가한 다음 37°C에서 1시간경과 후 세척하였다. 기질 용액(p-nitrophenyl phosphate)을 각 well당 50 以씩 가한 다음 37笆에서 30분 경과한 후 IN-NaOH 를 각 well당 50 B씩 가하여 반응을 종료시키고 microplate reader로 흡광도(405 nm)를 측정하여 실험군과 대조군의 흡광도를 비교하였다.
- 사용하였다. 실험동물실의 온도는 21~24°C, 습도는 40~60%로 유지하였고, 조명은 12시간 간격으로 조정하였다.
- 실헠물질 조제 및 투여 -Chitosan powder를 사용직전에 1% acetic acid에 용해시킨 후 lN-NaOH로 pH를 6.5~7.0으로 조정하& 62.5 mg/kg, 또는 250 mg/kg을 단독 또는 CY와 병용하여경〒투여하였다. CY는 주사직전에 생리식염액에 용해하여 20 mg/k;을 복강내에 주사하였고, 대조군에는 생리식염수만을 동일한 四 법으로 투여하였다.
- 항원주사 전 실험물질을 투여한 경우 -SRBC 항원주사 2일 전 (day-2)에 chitosan(62.5, 250 mg/kg) 또는 CY(20 mg/kg)을 단독투여하거나 CY 20 mg/kg과 chitosan 250 mg/kg을 병용 투여하고, IgM 항체 생성 세포수는 1차 면역 후 4일째에 최고에 달하므로M) 항원주사 후 4일째(day 4)에 비장세포수, 비장세포중의 PFC 수 및 혈청 중의 IgM 항체 생성능을 측정하였다.
- 혈청 중 IgM 항체 측정 - 항원(SRBC)주사 후 4일째에 마우스의 안정맥총에서 혈액을 채취하여 혈청을 분리하였으며, 실험직전에 혈청을 불활성화시킨 후 enzyme-linked immunosorbent assay(ELISA)를 이용하여 혈청 중의 SRBC에 대한 IgM 항체를측정하였다. Anti-mouse IgM을 0.
대상 데이터
- SRBC 는 廿국 메디아에서 구입하였으며, 기타 시약은 세포배양용 및특긑2토 구입하여 사용하였다.
- 비장세포 중의 IgM 항체 생성 세포수 측정 - 비장세포의 IgM 용홀난 생성 세포수(plaque forming cell, PFC)를 측정흐}기 위한 항원 2로 한국메디아에서 구입한 면양혈액을 냉장보관하여 3 주이나에 사용하였다. 사용직전 PBS용액으로 3회 원심세척(2500 rpm.
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실험방법
실험재료 - 실험물질로는 chitosan(이화여대 전동원 교수 제공) 과 cyclophosphamide(CY Alkyloxan®)를 사용하였고, guinea pig complement, anti-mouse IgM(whole molecule), RPMI 1643 medium powder, DMEM powder; FBS, HEPES 등은 Gibe y「의 제품을, Con A, LPS, sodium azide, disodium p- nitroDhenyl phosphate, alkaline phosphatase conjugated anti mouse IgM, MTT 등은 Sigma사의 제품을 사용하였다. SRBC 는 廿국 메디아에서 구입하였으며, 기타 시약은 세포배양용 및특긑2토 구입하여 사용하였다.
- 실헠동물 -3~4주령인 ICR계 암컷 마우스를 유한양행 중앙연구소:로부터 분양받아 고형사료와 물을 자유로이 공급하면서 2~3 주정-三 실험동물실에 적응시킨 후, 체중 23±2 g인 마우스를 실험이 사용하였다. 실험동물실의 온도는 21~24°C, 습도는 40~60%로 유지하였고, 조명은 12시간 간격으로 조정하였다.
데이터처리
- 통계처리 - 각 실험군의 측정값의 평균과 표준편차를 구하고대조군의 실험치와 비교하여 Student's t-test로 유의성을 검증하였으며, chitosan과 CY 병용투여군은 CY 단독투여군의 측정값과도 비교하여 유의성 검증을 하였다.
성능/효과
- CY 투여의 경우에는 대조군에 비하여 PFC 수가 다소 감소되고, CY 처리군에 chitosan을 병용투여시에는 감소된 PFC 수가 대조군과 비슷하게 되었으나 유의성은 없었다. Chitosan 투여에 의하여 혈청 중 IgM 항체 생성능은 대조군에 비해 뚜렷한 변화를 보이지는 않았고, CY 투여군은 대조군에 비해 IgM 항체 생성능이 약간 감소되었으며, chitosan을 병용투여함으로써 CY 투여군에 비해 다소 증가되는양상을 보였으나 유의성은 없었다.
- Chitosan을 항원주사 전에 단독으로 투여시 대조군에 비하여비장세포수, PFC 수 및 혈청 중 IgM 항체 생성능이 다소 증가되는 경향만을 보였으나, 항원주사 후에 chitosan 투여시에는 유의성 있고 뚜렷한 증가현상을 나타내었다. 또한, chitosan을 CY 와 병용투여함으로써 CY로 감소된 비장세포수, PFC 수 및 IgM 항체 생성능이 다소 증가되는 경향을 보여 주었다.
- 그 결과를 Table I에서 보면, 비장세포수는 chitosan의 고용량 투여군에서는 유의성은 없으나 대조군에 비하여 증가하는 경향을 보이고, CY 투여군에서는 약간 감소하였으며, CY와 chitosan을 병용투여한 군은 대조군과 비슷하여졌다. 또한, 비장세포 1()6 개당 SRBC 항원에 대한 PFC 수는 대조군에 비해 chitosan 62.
- 그 결과를 보면, chitosan을 62.5 mg/kg과 250 mg/kg 경구투여시 SRBC에 대한 PFC 수는 대조군에 비해 유의성 있게 (p<0.01) 상당히 증가하였고, CY 투여시에는 현저히 유의성 있게 저하되었다. 이러한 CY의 체액성 면역반응의 저해작용은 이을 병용투여한 경우에는 CY 투여군에 비해 유의성 없이 약간 증가하는 경향만을 보였는데, 이는 CY 투여 후 2일째에 비장을 취하여 실험하였으므로 CY의 세포독성이 최고에此財)달하여 chitosan이 CY의 면역독성을 감소시키지 못한 것으로 생각할 수도 있다.
- 있고 뚜렷한 증가현상을 나타내었다. 또한, chitosan을 CY 와 병용투여함으로써 CY로 감소된 비장세포수, PFC 수 및 IgM 항체 생성능이 다소 증가되는 경향을 보여 주었다.
- 이러한 CY의 체액성 면역반응의 저해작용은 이을 병용투여한 경우에는 CY 투여군에 비해 유의성 없이 약간 증가하는 경향만을 보였는데, 이는 CY 투여 후 2일째에 비장을 취하여 실험하였으므로 CY의 세포독성이 최고에此財)달하여 chitosan이 CY의 면역독성을 감소시키지 못한 것으로 생각할 수도 있다. 또한, chitosan을 단독으로 경구투여시 IgM 항체 생성능도 유의성 있게 현저히 증가하였고, CY 투여군의 경우는 대조군에 비하여 유의성 있게 매우 낮은 항체 생성능을 나타내어 비장세포의 PFC 수에 미치는 영향과 비슷한 결과를 보였으며, CY 처리군에 chitosan을 병용투여한 경우 CY 처리로 감소된 IgM 항체 생성능에 큰 변화는 보이지 않았다. 비장세포수는 chitosan 투여군에서는 대조군에 비하여 유의성은 없으나 다소 증가되는경향을 보이고, CY 투여군의 경우에는 유의성 있게(pvO.
- 보이고, CY 투여군에서는 약간 감소하였으며, CY와 chitosan을 병용투여한 군은 대조군과 비슷하여졌다. 또한, 비장세포 1()6 개당 SRBC 항원에 대한 PFC 수는 대조군에 비해 chitosan 62.5 mg/kg 투여군에서 다소 증가되었으며 , 250 mg/kg 투여군에서는유의성 있게(p<0.05) 증가되었다. CY 투여의 경우에는 대조군에 비하여 PFC 수가 다소 감소되고, CY 처리군에 chitosan을 병용투여시에는 감소된 PFC 수가 대조군과 비슷하게 되었으나 유의성은 없었다.
- 또한, chitosan을 단독으로 경구투여시 IgM 항체 생성능도 유의성 있게 현저히 증가하였고, CY 투여군의 경우는 대조군에 비하여 유의성 있게 매우 낮은 항체 생성능을 나타내어 비장세포의 PFC 수에 미치는 영향과 비슷한 결과를 보였으며, CY 처리군에 chitosan을 병용투여한 경우 CY 처리로 감소된 IgM 항체 생성능에 큰 변화는 보이지 않았다. 비장세포수는 chitosan 투여군에서는 대조군에 비하여 유의성은 없으나 다소 증가되는경향을 보이고, CY 투여군의 경우에는 유의성 있게(pvO.Ol) 저하되었으며, chitosan과 병용투여로 CY 투여군에 비해 유의성 있게(p<0.05) 다소 증가되었다.
후속연구
- 이 상의 실험 결과, chitosan은 마우스의 일차 체액성 면역기능을 층시키고 그 효과는 항원주사 후 투여시에 더욱 뚜렷하였으며 체액성 면역기능을 억제하는 CY의 작용을 다소 경감시키는 경향을 보여 더욱 연구가 진행되어야 할 필요가 있다고 사료된다
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