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문제 정의
- 피조개는 자연채묘가 어려워 인공 종묘생산에 의해 종패를 생산할 필요성이 매우 높은 종입니다. 이런 인공 종묘생산의 문제점을 해결하기 위한 방법의 하나로 피조개의 D형 유생을 냉동보존하기 위한 적합한 첨가제와 동해방지제의 적정농도를 찾고자 합니다. 본 연구에서는 어패류의 배우자 및 유생의 냉동보존시 많이 이용되는 첨가제로 fructose, glucose, sucrose와 동해방지제로 ethylene glycol을 비교 검토하였다.
- 이런 인공 종묘생산의 문제점을 해결하기 위한 방법의 하나로 피조개의 D형 유생을 냉동보존하기 위한 적합한 첨가제와 동해방지제의 적정농도를 찾고자 합니다. 본 연구에서는 어패류의 배우자 및 유생의 냉동보존시 많이 이용되는 첨가제로 fructose, glucose, sucrose와 동해방지제로 ethylene glycol을 비교 검토하였다.
제안 방법
- 실험용 유생을 얻기 위하여 산란기 이전 (4월) 에 채집한 피조개 모패를 음지에서 2시간 동안 공기 노출한 다음, 23℃에서 1시간에 걸쳐 6℃의 수온상승 자극을 주어 채란, 채정하였으며, 부화한 유생을 10 m3 수조에서 사육하면서 먹이로는 Isochrysis galbana와 Chaetoceros calcitrant 주었다. 실험을 위해 발생배의 50% 이상이 초기와 후기 D형 유생에 달한 것을 사용하였다 (Fig.
- 두 단계의 D형 유생을 실온 (23℃)에서 각 용액에 10분 동안 침지한 후 0.5 ml straw (FHK, Japan)에 넣고, 최초 온도가 0℃로 설정되어 있는 프로그램냉동기 (Samwon Freezing Engineering Co., Busan, Korea) 에서 -12℃까지 냉동하였다. 이후 -12℃에서 10분 동안 두면서 식빙 (seeding) 한 다음, 동일한 냉동률 (-1℃/분)로 -35 ℃까지 냉동하였다.
- 2). 1시간 후 25℃의 담수에서 급속해동하여 인공해수로 재희석한 다음, 광학현미경에 의해 섬모운동에 의한 유영과 심장박동 여부로 생존율을 조사하였다.
- 피조개 D형 유생의 외부형태를 파악하고자 주사전자현미경 시료를 제작하였다. 유생을 0.
- 고정이 끝난 시료는 PBS로 세척하고 50-100% 단계의 ethanol에서 10-20분씩 탈수하였다. 탈수가 끝난 시료를 critical point dryer로 건조한 후 ion sputter를 이용하여 gold palladium-coating (15-20 nm) 한 다음, 주사전자현미경 (DMS 940-A, Carl Zeiss, Oberkochen, Germany)으로 관찰하였다.
- 피조개의 D형 유생을 투과전자현미경으로 관찰하기 위해 시료를 제작하였다. 투과전자현미경 시료의 제작과정에서 고정과 탈수는 주사전자현미경 시료의 제작방법과 동일하게 처리하였다.
- 탈수가 끝난 시료는 propylene oxide와 epon (A + B)의 혼합물에 넣어 1-3시간 동안 중합시킨 다음, Epon 812에 포매하였다. 포매한 D형 유생의 시료는 ultramicrotome (LKB, Nova, Sweden)에 의해 두께 0.5-L0 “이로 semithin section한 다음, toluidine blue로 염색하여 관찰할 부위를 결정하였다. 관찰부위가 정해진 시료는 다시 60-90 nm 두께로 박절하여 200 mesh copper grid에 부착하였다.
- 관찰부위가 정해진 시료는 다시 60-90 nm 두께로 박절하여 200 mesh copper grid에 부착하였다. Ultrathin section한 절편은 uranylacetate와 lead citrate 용액으로 이중염색하여 투과전자현미경 (JEM 1200 E-XⅡ,60-80 kv, JEOL, Tokyo, Japan) 으로 관찰하였다.
- 적합한 첨가제를 찾기 위하여 각각 0.2 M과 0.5 M의 fructose, glucose, sucrose에 ethylene glyc이을 첨가하여 최종 농도가 1.0 M과 2.0 M이 되도록 하였다. 여기에 초기 D 형 유생을 침지하여 냉동한 결과, 해동 후 생존율은 Fig.
- 피조개 D형 유생을 냉동보존하기 위한 적절한 첨가제 종류와 농도 및 동해방지제로 적용한 ethylene glycol의 농도에 대한 냉동보존 효과실험을 실시하였다. 유생을 0笆로 설정된 프로그램 냉동기로 옮겨 -1℃/분의 냉동률로 -12℃까지 냉동한 후 10분 동안 유지한 상태에서 식빙하고 -35℃까지 재냉동한 다음, 즉시 액체질소통에 저장하였다.
대상 데이터
- 실험용 유생을 얻기 위하여 산란기 이전 (4월) 에 채집한 피조개 모패를 음지에서 2시간 동안 공기 노출한 다음, 23℃에서 1시간에 걸쳐 6℃의 수온상승 자극을 주어 채란, 채정하였으며, 부화한 유생을 10 m3 수조에서 사육하면서 먹이로는 Isochrysis galbana와 Chaetoceros calcitrant 주었다. 실험을 위해 발생배의 50% 이상이 초기와 후기 D형 유생에 달한 것을 사용하였다 (Fig. 1, Table 1).
- 첨가제는 인공해수 (NaCl 2.7 g, KCl 0.07 g, NaHCO3 0.05 g, CaCl2 0.12 g, MgCl2 0.46 g, 증류수 100 ml) 를 이용하여 만든, 각각 0.2 M, 0.5 M이 되게 한 fructose, glucose, sucrose 용액을 사용하였다. 동해방지제로는 ethylene glycol을 적용하였으며 (Choi and Chang, 1999), 각 첨가제에 각각 0.
데이터처리
- 모든 자료는 SPSS 통계프로그램을 이용하여 probit 분석을 하였고, 통계처리는 one-way ANOVA를 실시하여, 최소유의차검정 (least significant difference test, LSD test) 에 의해 평균간 유의차 유무 (p < 0.05)를 파악하였다.
성능/효과
- 7%로 가장 높았다. 주사 및 투과전자현미경을 이용하여 유생을 관찰한 결과, 냉동 전, 후 유생의 외부형태 및 세 포내 구조의 차이가 인정되지 않았다.
- 0 M이 되도록 하였다. 여기에 초기 D 형 유생을 침지하여 냉동한 결과, 해동 후 생존율은 Fig. 3에서와 같이, 0.2 M fructose, glucose, sucrose가 첨가된 1.0 M ethylene glycol에서 각각 13.9 ± 2.5%, 4.1 ± 0.9%, 2.9 ± 0.2%였다. 2.
- 0% 였다. 0.5 M fructose, glucose, sucrose가 첨가된 L0 M ethylene glycol에서 유생의 생존율 은 각각 11.9 ± 3.1%, 0%, 50.4 ± L3%였고, 2.0 M ethylene glycol에서는 각각 6.0 ± 0.8%, 1.5 ± 0.3%, 51.8 ± L7%였다. 따라서 피조개 D형 유생의 냉동보존시 첨가제로 0.
- 8 ± L7%였다. 따라서 피조개 D형 유생의 냉동보존시 첨가제로 0.5 M sucrose/)- 적합한 것으로 나타났다.
- 첨가제로 0.5 M sucrose가 첨가된 ethylene glycol을 사용하여 냉동하였을 때 생존율이 가장 높았다 (Fig. 4). 이를 토대로 후기 D형 유생을 첨가제로 0.
- 4). 이를 토대로 후기 D형 유생을 첨가제로 0.5 M sucrose, 동해방지제로 ethylene glycol을 농도별로 첨가하여 냉동한 결과, 해동유생의 생존율은 ethylene glycol 농도 1.5 M과 2.0 M에서 각각 50.5 ± 1.3%, 51.9 ± L7%로 높았다. EG에서 2.
- 9 ± L7%로 높았다. EG에서 2.0 M까 지는 농도가 높아질수록 유생의 생존율이 유의하게 높아지는 경향을 보였으나, 2.5 M에서는 생존율이 유의하게 낮아졌다 (p < 0.05).
- 피조개 D형 유생의 외부형태를 주사전자현미경을 이용하여 관찰한 결과, 냉동 전 유생에서는 운동기관인 섬모환 (ciliary band) 과 정상적인 패각의 형태가 관찰되었다 (Fig. 5®). 2.
- 피조개 D형 유생의 내부형태를 투과전자현미경을 이용하여 관찰한 결과, 냉동 전 D형 유생은 핵막과 핵질, 세포 내 소기관들이 편중됨 없이 조밀하게 차 있는 것을 알 수 있었다 (Fig. 6®). 2.
- (1989)은 진주담치의 발생단계 중 2-8세포와 담륜자를 사용한 냉동보존에서 담륜자의 냉동보존이 가능함을 밝혔다. 본 연구에서도 피조개 D형 유생을 이용하여 냉동실험을 실시한 결과, 0.5 M sucrose를 첨가한 1.5 M과 2.0 M의 ethylene glycol을 사용하였을 때, 50% 이상의 생존율을 보여 냉동보존이 가능함을 알 수 있었다.
- 2%였다고 하였다. 본 연구에서는 피조개 D형 유생을 이용하여 첨가제로 fructose, glucose, sucrose 중 0.5 M sucrose, 동해방지제로 2.0 M ethylene glycol을 사용하였을 때, 해동 후 생존율이 가장 높았다. 동해방지제의 높은 삼투질 농도는 발생배의 삼투압과 생화학적 측면에 손상을 입히는 것으로 알려져 있지만 (Renard and Cochard, 1989), 본 연구에 사용한 유생의 생존율에는 큰 영향을 미치지 못하였으며, sucrose와 ethylene glycol을 혼합하여 사용하였을 때 생존율이 높았다.
- 유생을 0笆로 설정된 프로그램 냉동기로 옮겨 -1℃/분의 냉동률로 -12℃까지 냉동한 후 10분 동안 유지한 상태에서 식빙하고 -35℃까지 재냉동한 다음, 즉시 액체질소통에 저장하였다. 1.0 M과 2.0 M ethylene glycol을 동해방지제로 사용하여 첨가제별로 D형 유생을 냉동한 결과, 0.5 M sucrose에서 생존율이 각각 50.5 ± 1.3%, 51.9 ± 1.7%로 가장 좋았다. 0.
- 7%로 가장 좋았다. 0.5 M sucrose를 첨가한 ethylene glycol의 농도별 냉동에서는 2.0 M이 생존율 51.9 ± 1.7%로 가장 높았다. 주사 및 투과전자현미경을 이용하여 유생을 관찰한 결과, 냉동 전, 후 유생의 외부형태 및 세 포내 구조의 차이가 인정되지 않았다.
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