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문제 정의
- Anderson 등6)은 ACEI 투여가 사구체압을 낮추어 신손상을 예방한다고 하였으나 Yoshida 등22)은 사구체 비후를 방지하여 신손상을 예방한다고 하였다. 본 연구에서는 ACEI 투여군에서 혈압 조절 효과와 함께 단백뇨와 사구체 비후도 대조군과 CCB 투여군에 비하여 유의하게 적었다.
- 본 연구에서는 부분 신절제술을 이용한 동물실험에서 두 가지 상이한 기전의 항고혈압제, 즉 ACEI (enalapril)와 CCB (nicardipine) 을 투여하여 신부전의 진행에 미치는 영향을 조사하였다. 두 약물 투여군 모두에서 신절제 후에도 정상 혈압이 유지되었으나 단백뇨와 형태학적 변화는 상이하여 혈압 조절 이외의 다른 약리 작용이 신장기능 및 병변에 작용하는 것으로 생각된다.
가설 설정
- 은 같은 동물 모델에서 연속적인 micropucture 실험을 통해 이러한 혈류동태학적 변화가 사구체 경화의 정도에 미치는 영향에 대하여 조사하였다. 이 실험에서 신단위 사구체 여과율, 사구체압 등의 혈류동 태학적 변화가 사구체 경화의 정도와 유의한 상관관계가 없어 혈류동태학적 요인 이외의 인자가 작용할 것이라고 하였다.
제안 방법
- 부분 절제 후 thrombin을 절단면에 도포하고 손가락으로 눌러 지혈한 후 복강을 봉합하였다. 1주일 후 우측 옆구리를 절제한 후 신동맥을 묶고 우측 신장을 제거하였다. 수술 전, 후 단백질이 18.
- 5% glutaraldehyde 용액에 고정하여 전자현미경 표본을 만들었 다. Epon에 포매된 조직을 1 μm 두께로 박절하여 toluidine blue로 염색 후 실험 동물 1 마리 당 3개의 사구체를 찾아낸 후 75μm로 초박절하여 uranyl acetate와 lead citrate로 염색한 후 JEM-1200 EX 전자현미경으로 관찰하였다. 각 사구체 단면을 전자현미경 시야에서 좌상방부터 무작위로 시작하여 체계적으로(systematic random sampling)13) 일정한 간격으로 촬영을 하였다.
- 또한 Weibel-Gomez 방법을 사용하여 평균 사구체 용적을 측정하였다. Kramer XM 160 투사 광학현미경을 사용하여 150배의 배율에서 사구체 총맥(tuft)의 면적을 측정하였다. 각 환자의 표본에서 계측 가능한 모든 사구체 단면 의 평균 면적(mean glomerular area: MGA)을 이용하여 다음의 공식에서 평균 사구체 용적(mean glomerular volume: MGV)을 계산하였다15).
- Epon에 포매된 조직을 1 μm 두께로 박절하여 toluidine blue로 염색 후 실험 동물 1 마리 당 3개의 사구체를 찾아낸 후 75μm로 초박절하여 uranyl acetate와 lead citrate로 염색한 후 JEM-1200 EX 전자현미경으로 관찰하였다. 각 사구체 단면을 전자현미경 시야에서 좌상방부터 무작위로 시작하여 체계적으로(systematic random sampling)13) 일정한 간격으로 촬영을 하였다. 사구체 단면 전체에서 사구체 크기에 따라 10-20장의 전자현미경 사진을 촬영하여 사구체 단면의 약 20% 에 해당하는 부분을 촬영하였다.
- Kramer XM 160 투사 광학현미경을 사용하여 150배의 배율에서 사구체 총맥(tuft)의 면적을 측정하였다. 각 환자의 표본에서 계측 가능한 모든 사구체 단면 의 평균 면적(mean glomerular area: MGA)을 이용하여 다음의 공식에서 평균 사구체 용적(mean glomerular volume: MGV)을 계산하였다15). MGV = MGA3/2x 1.
- 대상 및 방법 : 백서에서 5/6 신절제술로 만성신부전을 유발시킨 후 무작위로 대조군, enalapril 투여군(E군), nicardipine 투여군(N군)으로 나누어 4주 간격으로 꼬리 동맥압을 측정하고 12주째 24시간 소변 단백량과 crea- tinine 배설량, 혈청 creatinine을 측정한 후 희생시켜 신조직을 광학현미경과 전자현미경으로 관찰하여 사구체의 형태학적 소견을 조사하였다.
- 체중 200-250 gm의 수컷 Sprague-Dawley rat 21마리에서 한쪽 신장을 적출하고 반대쪽 신장의 2/3를 절제하는 부분 신절제를 시행하였다. 부분 신절제는 ether 마취하에 복강을 중앙 절개하여 좌측 신장의 피막을 제거하고 신장의 상, 하극을 부분 절제하였다. 신절제 시 신동맥을 일시적으로 묶어 혈액 손실을 최소화하였으며 신동맥을 묶은 시간은 1분 이내였다.
- 사구체 기저막의 표면적에 대한 사구체 여과 극의 길이밀도는 사구체 기저막의 단위 면적에 대한 여과세극의 길이를 표시하는 수학적 개념으로 격자선과 사구체 기저막과의 교차점(1)과 사구체 기저막 위에서 관찰되는 여과 세극의 수(Qs)를 세어 다음의 공식에서 구하였다16). Ls Filtration slit/PGBM = (Qs x magnification) / (I x h)μm/μm2 위 공식에서 h는 격자선의 간격(본 실험에서는 10,000 μm)이다.
- 각 사구체 단면을 전자현미경 시야에서 좌상방부터 무작위로 시작하여 체계적으로(systematic random sampling)13) 일정한 간격으로 촬영을 하였다. 사구체 단면 전체에서 사구체 크기에 따라 10-20장의 전자현미경 사진을 촬영하여 사구체 단면의 약 20% 에 해당하는 부분을 촬영하였다. 촬영 후 약 30,000배의 최종 배율로 현상, 인화하였으며 정확한 최종 배율은 전자현미경 사진 상의 1 μm 계측자의 길이를 측정하여 계산하였다.
- 사구체 상피세포 족돌기의 융합 정도를 측정하기 위하여, 최종 배율 30, 000배의 전자현 미경 사진 상에서 사구체 기저막의 표면적에 대한 사구체 여과세극의 길이 밀도 (length density of the filtration slit to PGBM surface: Ls Filtration slit/PGBM)를 산정하였다. 전자 현미경 사진 위에 투명한 acetate지에 그려진 실험격자(test grid)를 덧씌워 사용하였는데, 실험격자는 5cm 간격의 격자점과 1 cm 간격의 격자선으로 이루어져 있다.
- 1주일 후 우측 옆구리를 절제한 후 신동맥을 묶고 우측 신장을 제거하였다. 수술 전, 후 단백질이 18.5% 포함된 정상 쥐 사료를 먹이로 하였으며 식수는 자유롭게 섭취하도록 하였다11).
- 신절제 수술 1주일 후 만성신부전을 유발시킨 백서를 무작위로 대조군(C) 7마리, enalapril 투여군(E) 7마리, nicardipine 투여군(N) 7마리로 3군으로 나누어, enalapril 투여군은 enalapril (Renitec, 태진제약)을 쥐의 식수에 50 mg/liter의 농도로 섞어 섭취토록 하고 nicardipine (Perdipine, 동아제약)은 enalapril 투여군과 동일한 정도로 혈압이 떨어지도록 식수에 80 mg/liter의 농도로 섞어 희생 직전까지 투여하였다. 대조군은 아무 약물도 투여 하지 않았다.
- 신절제 후 12주에 metabolic cage를 이용하여 24시간 소변을 모은 후 24시간 요단백량과 creatinine 배설량을 spectrophotometer 4010 (Germany)과 Hitachi 7150 autochemistry analyzer (Japan)를 사용하여 측정하였다. 신절제 후 12주가 경과한 후 ether 마취 하 에 백서를 희생하여 심장에서 혈액을 채취하여 혈청 creatinine을 측정하였다. 희생된 백서에서 남아있는 신장을 떼어내어 무게를 측정하고, 신조직을 광학현미경과 전자현미경으로 관찰하였다.
- 신절제 후 12주에 metabolic cage를 이용하여 24시간 소변을 모은 후 24시간 요단백량과 creatinine 배설량을 spectrophotometer 4010 (Germany)과 Hitachi 7150 autochemistry analyzer (Japan)를 사용하여 측정하였다. 신절제 후 12주가 경과한 후 ether 마취 하 에 백서를 희생하여 심장에서 혈액을 채취하여 혈청 creatinine을 측정하였다.
- 이에 본 연구자들은 백서에서 신절제술을 이용해 만성신부전을 유발하고, 이 실험동물 들에 작용기전이 다른 항고혈압제인 ACEI와 calcium channel blocker (CCB)를 투여한 후 전자현미경과 광학현미경을 이용하여 신조직의 형태학적 연구를 시행하였다. 특히 사구체 상피세포의 형태학적 변화를 조사하여, 만성 신부전에서의 상피세포의 변화를 관찰하고, 작용기전이 다른 항고혈압제를 투여하였을 때 이들이 사구체 상피세포의 형태학적 변화에 미치는 영향의 차이를 관찰하였다.
- 만성신부전의 진행을 지연시킬 수 있는 인자 중 혈압조절이 중요한 것으로 알려져 있다. 저자들은 부분 신절제를 이용하여 만성신부전을 유발시킨 후 항고혈 압제로 enalapril과 nicardipine을 투여하여 만성신부전의 진행에 미치는 영향을 조사하였다.
- 사구체 단면 전체에서 사구체 크기에 따라 10-20장의 전자현미경 사진을 촬영하여 사구체 단면의 약 20% 에 해당하는 부분을 촬영하였다. 촬영 후 약 30,000배의 최종 배율로 현상, 인화하였으며 정확한 최종 배율은 전자현미경 사진 상의 1 μm 계측자의 길이를 측정하여 계산하였다.
- 이에 본 연구자들은 백서에서 신절제술을 이용해 만성신부전을 유발하고, 이 실험동물 들에 작용기전이 다른 항고혈압제인 ACEI와 calcium channel blocker (CCB)를 투여한 후 전자현미경과 광학현미경을 이용하여 신조직의 형태학적 연구를 시행하였다. 특히 사구체 상피세포의 형태학적 변화를 조사하여, 만성 신부전에서의 상피세포의 변화를 관찰하고, 작용기전이 다른 항고혈압제를 투여하였을 때 이들이 사구체 상피세포의 형태학적 변화에 미치는 영향의 차이를 관찰하였다.
- 신절제 후 12주가 경과한 후 ether 마취 하 에 백서를 희생하여 심장에서 혈액을 채취하여 혈청 creatinine을 측정하였다. 희생된 백서에서 남아있는 신장을 떼어내어 무게를 측정하고, 신조직을 광학현미경과 전자현미경으로 관찰하였다.
대상 데이터
- 신생검 조직의 일부는 포르말린에 고정하여 파라핀에 포매한 후 3 μm 두께로 박절하여 Hematoxylin and Eosin 염색 및 Periodic Acid-Schiffper iodic acid Schiff (PAS) 염 색을 시행하여 광학현미경 표본으로 사용하였다. 조직의 다른 일부는 '2.
- 실험 동물 한 마리 당 최소 50개 이상의 사구체를 관찰하였다. Mesangial expansion score (MES)는 mesangium의 확장 정도에 따라 25%까지는 1, 25-50%까지는 2, 50-75%까지 는 3, 75%이상은 4로 분류하여 등급을 매겨 그 합을 관찰한 사구체 수로 나누었다").
- 체중 200-250 gm의 수컷 Sprague-Dawley rat 21마리에서 한쪽 신장을 적출하고 반대쪽 신장의 2/3를 절제하는 부분 신절제를 시행하였다. 부분 신절제는 ether 마취하에 복강을 중앙 절개하여 좌측 신장의 피막을 제거하고 신장의 상, 하극을 부분 절제하였다.
데이터처리
- 각 군간의 자료 분석은 Student's t-test를 사용하였고, 사구체의 구조-기능적 상관관계 는 최소자승법을 사용하여 변수들간의 상관성을 검증하였다. 결과는 평균과 정규 분포의 합(mean士SD)으로 표시하였으며, P<0.
- 각 군간의 자료 분석은 Student's t-test를 사용하였고, 사구체의 구조-기능적 상관관계 는 최소자승법을 사용하여 변수들간의 상관성을 검증하였다. 결과는 평균과 정규 분포의 합(mean士SD)으로 표시하였으며, P<0.05인 경우 통계적으로 유의하다고 간주하였다.
이론/모형
- The course of systolic blood pressure after final surgical procedure in 3 groups of rats. Blood pressure was measured by tail cuff method. * P<0.
- Mesangial expansion score (MES)는 mesangium의 확장 정도에 따라 25%까지는 1, 25-50%까지는 2, 50-75%까지 는 3, 75%이상은 4로 분류하여 등급을 매겨 그 합을 관찰한 사구체 수로 나누었다"). 또한 Weibel-Gomez 방법을 사용하여 평균 사구체 용적을 측정하였다. Kramer XM 160 투사 광학현미경을 사용하여 150배의 배율에서 사구체 총맥(tuft)의 면적을 측정하였다.
- 혈압은 신절제 2주 후부터 2주 간격으로 tail plethymography (rat tail manometertachometer system, KN-210, Natsume Seisa- kusho Co., Ltd., Japan)를 사용하여 tail-cuff method로 측정하였다(2).
성능/효과
- 신절제 후 대조군은 지속적으로 혈압이 증가하였으나 E군과 N군에서는 정상 혈압이 유지되었다. 2. 12주째 E군에서 요단백량은 대조군과 N군에 비하여 유의하게 적었다. 3.
- 24시간 요단백량은 대조군에서 74 + 16 mg 으로 E군에서의 51 ± 8 mg 보다 유의하게 많 았으나 N군에서의 65 ±14 mg과는 유의한 차이가 없었다. E군에서 N군에 비해 유의하 게 요단백량이 감소되어 있었다.
- 12주째 E군에서 요단백량은 대조군과 N군에 비하여 유의하게 적었다. 3. 12주째 조사한 신장의 형태계측학적 검사에서 E군과 N군 모두에서 mesangium의 증식이 대조군에 비하여 유의하게 적었으나 사구체 용적은 E군에서만 대조군에 비하여 적었다. 4.
- 12주째 조사한 신장의 형태계측학적 검사에서 E군과 N군 모두에서 mesangium의 증식이 대조군에 비하여 유의하게 적었으나 사구체 용적은 E군에서만 대조군에 비하여 적었다. 4. 대조군, E군, N군간의 상피세표 족돌기의 형태학적 변화의 차이는 없었다. 결론 : 부분 신절제로 유발한 만성신부전 백서에서 enalapril, nicardipine 모두 고혈압을 예방하였으나 enalpril 투여군에서 단백뇨의 감소와 신병변 발생 예방 효과가 우수하였으며, 상피세포 족돌기의 변화에는 차이가 없었다.
- 결과 : 1. 신절제 후 대조군은 지속적으로 혈압이 증가하였으나 E군과 N군에서는 정상 혈압이 유지되었다. 2.
- E군에서 대조군이나 N군에 비하여 24시간 요단백량이 감소하였다. E군과 N군 모두에서 대조군에 비하여 mesa- ngium의 증식은 감소하였으나 E군에서만 사구체 용적의 증가가 대조군에 비하여 유의하게 감소하였다. 사구체 기저막의 표면적에 대한 사구체 여과세극의 길이밀도로 측정한 상피세포 족돌기의 융합 정도는 3군 간의 차이가 없었다.
- . Ikoma 등⑼은 ACEI를 혈압 조절 용량보다 대량으로 투여 한 동물 실험에서 사구체 경화가 개선될 뿐 아니라 이미 형성된 사구체 경화가 호전되는 결과를 보였으며 angiotensin type 1 receptor antagonist (AIIRA)E. 비슷한 효과를 보였다 고 하며 puromycin을 사용한 동물 실험에서 도 ACEI 또는 AIIRA 투여시 사구체 경화가 호전되었다는 보고가 있다 21),
- 대조군, E군, N군간의 상피세표 족돌기의 형태학적 변화의 차이는 없었다. 결론 : 부분 신절제로 유발한 만성신부전 백서에서 enalapril, nicardipine 모두 고혈압을 예방하였으나 enalpril 투여군에서 단백뇨의 감소와 신병변 발생 예방 효과가 우수하였으며, 상피세포 족돌기의 변화에는 차이가 없었다.
- 2 mL/min 이었다. 대조군에서 E 군과 N 군에 비하여 creatinine 여과율이 감소되어 있었으며 3군 모두에서 기간이 경과함에 따라 서서히 만성 신부전으로 진행되었으며 말기신부전증으로 진행한 예는 없었다. (Table 1).
- 본 실험에서 약물을 투여하지 않은 대조군에서 신절제 후 고혈압, 단백뇨, mesangium 의 증식 등이 나타났으나 12주까지 말기신부 전증은 보이지 않았다. 신절제 후 수축기 혈압은 대조군에서 지속적으로 증가하여 실험 8주째부터 약물 투여군에 비하여 유의하게 높았으나, E군과 N군에서는 실험 기간 중 정상 혈압이 유지되었다.
- 은 부분 신절제를 시행한 쥐에서 사구체 상피세포의 비대와 족돌기의 융합이 나타나며, ACEI 투여군에서 CCB 투여군에 비하여 이러한 상피세포의 변화를 예방할 수 있었다고 하였으나 이 연구에서는 광학현미경을 사용하여 관찰했으며, 정량적 형태계측학적 방법이 아닌 정성적 관찰을 하여 실험 방법이 정확하지 않았다고 사료된다. 본 연구에서 Enalprile 단백뇨, 사구체 비후, mesangium의 증식을 예방하였으며, nic- ardipinee 단백뇨와 사구체 비후에는 영향이 없었으나 mesangium의 증식은 대조군에 비하여 유의하게 감소시켰다. 또한 대조군에서 항고혈압제 투여군에 비하여 심한 상피세포 족돌기의 변화는 없었으며, E군과 N군에서도 유의한 차이를 발견하지 못했다.
- (Table 2). 사구체 기저막의 표면적에 대한 사구체 여과세극의 길이밀도는 대조군과 약물 투여군간의 차이가 없었으며, E군과 N군간에도 유의한 차이가 없었다. (Table 2).
- 신절제 후 12주에 측정한 mesangial expansion score는 대조군에서 2.29 ±0.09로 항고혈압제 투여군(E군 1.96 ±0.04, N군 1.96 ±0.01)에 비하여 유의하게 증가되었다. E군과 N군간의 차이는 없었다.
- 신절제 후 2주 간격으로 측정한 수축기 혈압은 대조군에서 지속적으로 증가하여 실험 8주 째부터 약물 투여군에 비하여 유의하게 높았으며, enalapril 투여군과 nicardipine 투여군에서는 실험 기간 중 정상 혈압이 유지되었다 (Fig. 2).
- 본 실험에서 약물을 투여하지 않은 대조군에서 신절제 후 고혈압, 단백뇨, mesangium 의 증식 등이 나타났으나 12주까지 말기신부 전증은 보이지 않았다. 신절제 후 수축기 혈압은 대조군에서 지속적으로 증가하여 실험 8주째부터 약물 투여군에 비하여 유의하게 높았으나, E군과 N군에서는 실험 기간 중 정상 혈압이 유지되었다. E군에서 대조군이나 N군에 비하여 24시간 요단백량이 감소하였다.
- 신절제 후 실험동물들은 모든 군에서 비슷한 양의 사료와 식수를 섭취하였고, 실험 기간 중 지속적인 체중 증가를 보였다. 각 군간의 일일 사료 섭취량(12주, C군 39.
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