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문제 정의
- 따라서 본 연구에서는 BAC에 의해 유발된 각막상피 세포의 세포고사에 대한 기전을 조사하고자 하며 B.H를 직접 15분간 처리한 후 2」시간 동안 배양하여 회복 효과 증식 저 배와 형태변화를 관찰하고자 시행하였으며. 또W Fas receptoi를 통한 세포고사와 관련된 immunologic expression 을 조사하고자 시행하였다.
- ' FasL와 Fas는 뽄래 정상 조직에 전반적으로 발현되며 이 시스템은 면역 반응의 조절과 종양세포의 사멸에 관런된 중요한 기전을 제공하고있다. 따라서본 연구에서는 BAC가 각막 상피 세포에서도 FaeL-Fas system을 통해 세포고사가 유도되는지 여부를 확인하기 위하여 Western blot을 시행하여 조사하였다. 또한 세포고사를 확인하는 다양한 기법들.
- H를 직접 15분간 처리한 후 2」시간 동안 배양하여 회복 효과 증식 저 배와 형태변화를 관찰하고자 시행하였으며. 또W Fas receptoi를 통한 세포고사와 관련된 immunologic expression 을 조사하고자 시행하였다.
제안 방법
- 25cm' Flask에 배양한 세포의 중식 정도를 비교하기 위해 배양용기 밑면에 관찰할 부분을 표시하이 BAC용액을처리하기 전과 처리 후에 같은 부위를 도립 위상차 현미경을 이용하여 계속 관찰하였다.
- 그 후 MTT가 50z/g/ml 포함된 배양액을 넣어 3시간 배양한 후 DMSO로 불용성 MTT formazan을 용해하여 5?)nm 에서 흡광도를 측정하였다. 5% 에탄올을 양성 대조군으로 PBS를 음성 대조군으로 처리하여 상대 비교하였다.
- BAC로 0.00055).005% 농도로 처리하여 MTT assay를 시행하였다. 0.
- BAC로 처리된 세포의 세포고사에 대한 생화학적 변화로 DNA가 Fragmentation되는지 여부를 확인하기 위해 Agarose gel로 전기영동을 시행하였다. DNA Ladder Kit (Boehringer Mannheim)을 이용하였는데 <그 과정 올 간단히요약하면 세포로부터 DNA를 추출하여 Lsopropan이을 첨가한 다음 필터를 통해 DNA를 여과한다.
- Benzalkonium chloride (Sigma. USA)를 EMEM 과 HAM FT2를 로 섞은 배지에 0.0001-0.01 %(V/V) 능도로희석하여 15분 동안 세포에 직접 처리하여 새로운 배양액으로 씻은 훈 24시간 동안 다시 배양하여 회복 효과를 관찰하였다
- Biotin blocking reagent) 로 각 15 분씩 blocking 14. Blocking한 세포를 anti-Fas monoclonal Antibody(R&D USA)를 1차 항체로 하여 25网/mi 농도로 37℃에서 2시간 동안 배양하였다 2차 항체로는 Biotinylated secondary antibody를 상온에서 1시간 처리하몄으며 HSS-HRP로 30분간 처리한 후 DAB로 염색하여 Brown으로 염색되면 FAS Protein이 발현되는 것으로 판정하였으며 대조 염색으로 Toluidin blue를 이용하였다. 이렇게 멷색된표본을 400배에서 광학현미경으로 사진 촬영하여 확인하였다.
- Chamber Slide에 배양된 세포를 B3C로 15분 동안 주어진 농도로 처리 후 새로운 배양액으로 교환하여 읰시간 동얀 배양한 후 세포고사의 중요한 Pathway 중 하나인 Fas 경로를 조사하기 위배 세포 수용체인 Fas의 발현 여부를 조사하였다. Immunocytochemistrye- Cell and Tissue siaining Kit(R&D USA)을 이용하였는데 과정을 간단히 정리하면다음과 같다.
- 5시간 동안 건기 영동을 실시하였다. 건기영동이 끝난 gel을 Ethidium bromide로 DNA와 반응시켜 UV조명에서 DNA Ladder를 확인하여 폴라로이드 카메라로 사진 활영하였다. 세포 고사가 있는 세포는 일정한 크기로 DNA가 절단되므로 특징적인 Ladder형태가 나타난다、
- 5% BSA로 Blocking 하고 PBST로 세척한 후 일차항체로 Anti-Fas monoclonal antibody를 이용하여 37℃에서 1시간 동안 배양하였다. 다시 PBST로 Washing 한 후 2차 항체로 1시간 처리하여 반응액으로 반응시켜 필름에 노출시킨 후 현상 인화하여 Fas의 발현여부를 조사하였다.
- 또한 Slide chamber에 배양한 세포를 90% 메탄올로 고정한 후 Toluidin Blue로 엄색하여 세포가 응축되거나 각은세포고사 소체를 갖는 진하게 엄색된 세포를 광학현미경으로 관찰하여 사진 촬영하였다.
- 세포 독성 평가를 위해 MTT assay를 김 둥(2001)의 방법으로 변형하여 이용하였다.:] 각막세포롤 24well plate에 분주하여 70% 정도 채워질 때까지 배양한 BAC를 0.
- 세포고사의 중요한 기전 중의 하나인 Fas-Fas Ligand system의 관여 여부를 in situ로 확인하기 위해 Inimuno- cytmhemistry를 시행하여 BAC에 의해 배양 각막상피 세포에 Fas가 발헌하는지 어부를 조사한 결과. PBS를 처리한 옴성 대조군에서도 각막 상피세포에 전체적으로 DAB 염색이 나타나 정상 각막 상피세포에서도 Fas가 존재하는것올 알 수 있었다.
- 세포를 25cm: Flask에 배양하여 BAC를 주어진 농도로 15분 동안 처리한 군과 양성 대조군으로 5% 에탄올로 처리한 군 그리고 PBS로 처리한 음성 대조군의 세포를 세척하여 새로운 배양액으로 교환하여 21시간 후에 수확하여냉장 보관된 70% 에탄올로 고정하여 2〃g/ml의 Hoechst 33342(Sigma. USA)용액으로 형광 염색하여 형광 현미경 400배에서 관찰하여 세포고사의 형태학적 특징을 나타낸세포를 계수하였다. Apoptosis율은 전체 세포 약 500개에대한 세포고사의 특징을 보인 세포수의 비율을 백분율로나타내었다.
- 시료를 10% SDS-PAGE Gel로 전기 영동하이 분리된 단백질을 0.45“m polyvinylidene difluoride membrane에 Blotting하여 Blocking 과정을 거쳐 Membrane에 Electrotransfer 하였다. 5% BSA로 Blocking 하고 PBST로 세척한 후 일차항체로 Anti-Fas monoclonal antibody를 이용하여 37℃에서 1시간 동안 배양하였다.
- DNA Ladder Kit (Boehringer Mannheim)을 이용하였는데 <그 과정 올 간단히요약하면 세포로부터 DNA를 추출하여 Lsopropan이을 첨가한 다음 필터를 통해 DNA를 여과한다. 이렇게 모은 DNA 를 70℃에서 Elution buffed 미ution하여 TBE buffed 사용하여 1% Agarose-DNA Gel로 75V에서 1.5시간 동안 건기 영동을 실시하였다. 건기영동이 끝난 gel을 Ethidium bromide로 DNA와 반응시켜 UV조명에서 DNA Ladder를 확인하여 폴라로이드 카메라로 사진 활영하였다.
대상 데이터
- 본 연구에 이용된 세포는 SV-40 immortalized HCE 세포로 EMENKEarlse Minimum Essential 니ediq)과 HAM F-12를 1 : 1로 섞은 배지에 5% FBS와 cholera toxin, ins비in. epidermal growth factor, gentamicin.
이론/모형
- 즉 형광엄색. D\A Fragmentation 확인, DNA Ladder 등의 방법을 시행하였다.
성능/효과
- 장기간 반응을 시켜야 발색된다."이 따라서 본 연구에서도 세포고사가 유도된 세포의 핵은 응축되고 작은 소체로 나누어진 상태로 보다 진하게 형광을 발산하는 것을 확인할 수 있었으며 이와 같은 특징을 갖는 세포를 산정하여 세포 고사 율로 나타내었는데 0.001%에서 가장 높은 세포 고사율을 나타냈다. 결막세포를 이용한 연구에서 0.
- 7%. 0.001% 에서는 9;%로 농도에 따라 점점 세포고사율이 증가하는것으로 나타났으며 PBS처리군 3%보다 높게 나타나 Apoptosis가 유도되는 것을 확인할 수 있었다(표 2. 그림 1).
- BAC로 15분 동안 주어진 농도로 처리 후 새로운 배양액으로 교환하여 24시간 동안 배양한 각막상피세포를 Hoechst 33342로 형광 염색하여 세포고사의 특징을 보인세포 수를 산정한 결과 0.005% 이상에서는 세포괴사로 세포고사 율 산정이 어려웠으며 0.0005%에서는 5.7%. 0.
- PBS를 처리한 옴성 대조군에서도 각막 상피세포에 전체적으로 DAB 염색이 나타나 정상 각막 상피세포에서도 Fas가 존재하는것올 알 수 있었다. BAC를 처리한 군에서 DAB 염색이 더욱 강하게 나타나 진한 갈색을 보여 Fas가 많이 발현하는 것으로 확인되었다.
- PBS로 처리한 음성 대조군에서는 Ladder 패턴이 나타나지 않았으나 BAC 0.0005%로 처리한 군에서는 뚜렷하게 확인되지 않았으나 0.001%로 처리한 군에서 DNA Fragmentation 을 나타내 전형적인 DNA Ladder가 관찰되어 생화학적 변화도 확인되었다(그림 2).
- 001%에서 가장 높은 세포 고사율을 나타냈다. 결막세포를 이용한 연구에서 0.001 ~ 0.0001%에서 낮은 농도의 BAC 처리 군에서 비교적 낮은 강도의 DNA laddering을 나타냈으나'” 본 연구에서는 0.0005%에서 낮은 강도로 0.001 %에서 비교적 현저한 DNA laddering을 보였다.
- 도렵 위상차 현미경으로 BAC 0.0005-0.005^ 농도로 처리하여 용액을 처리하기 전과 처리 후에 같은 부위를 계속 관찰한 결과 기시간 회복 동안 0.005% 이상 처리한 군에서는 세포가 즉시 사멸하는 세포괴사를 보였으나 0.001% 이 하 처리한 군에서는 세포의 응축과 세포고사 소체로 보이는 부유 세포들이 관찰되었다. 또한 Toluidin Blue로 염색하여 광학현미경으로 관찰한 결과 0.
- 001% 이 하 처리한 군에서는 세포의 응축과 세포고사 소체로 보이는 부유 세포들이 관찰되었다. 또한 Toluidin Blue로 염색하여 광학현미경으로 관찰한 결과 0.001 %로 처리한 군에서 진하게 염색된 작은 소체를 포함하고 있는 세포들이 다수 관찰되었다.
- 일반적으로 각막상피세포의 세포고사가 일어나는 과정이 Fas-Fas Ligand system의 경로를 취하는 경우가 많아 BAC에 의해 유도된 세포고사도 이 경로를 취하는지 알아보기 위해 Anti-Fas monoclonal antibody를 이용하여 세포막의 수용체인 Fas의 발현여부를 조사한 결과, 대조군에서도 수용체인 Fas가 발현하는 것으로 나타났으며 특히 0.001% BAC 처리 군에서 매우 강하게 Fas가 발현된 것을 확인하였다(그림 3).
후속연구
- 본 연구의 결과를 종합해 보면 BAC가 각막상피세포에영향을 주어 0侦)1% 이상의 농도에서는 세포종식을 저해하고 세포고사도 유발하는 것으로 판명되었으므로 점안약의대표적인 보존제인 BAC의 활용에 따른 부작용에 대한 각막세포 사원의 연구가 필요할 것으로 사료된디.
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