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문제 정의
- 쥐노래미는 우리나라 연안역에 널리 서식하는 주요 해산 품종으로서 산란 유도가 비교적 쉽고, 알의 크기가 매우 크고, 배 발생 단계별 자세한 유전자 발현 관찰이 용이함에 따라 발생 유전학적 형질전환 연구모델로서 많은 장점을 갖고 있을 뿐만 아니라 최근 들어 양식 개발 대상으로서도 그 가치를 인정받고 있다. 따라서 본 연구에서는 쥐노래미를 해산어 분자육종 모델로 개발하기 위한 연구의 일환으로 본 종으로부터 성장 및 성숙 관련 발현 정보를 다량 포함하고 있으리라 판단되는 뇌하수체 조직으로부터 발현하는 유전자 정보를 library 화하고 성장호르몬 cDNA 유전자를 발굴하고자 하였다.
- 특히 본 어종은 그 알의 크기가 크고, 한 개체에서 생산된 난의 부화율이 비교적 일양 하며 또한 수온을 이용한 장시간에 걸친 발생속도 조절이 가능함에 따라 자세한 발생 과정의 추적과 배 발생과 관련한 유전자 발현 조사가 유리한 점 둥 발생 유전학 및 형질전환 연구 모델로서 많은 장점을 갖고 있다. 이에 본 연구는 쥐노래미를 해산어 유전자 조작 및 형질전환 모델로 개발하기 위한 유전육종학적 연구의 일환으로 본 어종으로부터 성장호르몬 유전자 cDNA를 탐색, 발굴하고 이들의 염기서열 구 조, 및 발현 특성을 분석하고자 하였다.
제안 방법
- Expressed sequence tag를 수행하기 위해 증폭된 cDNA library로부터 무작위로 선발한 재조합 플라스미드들의 insert 길이를 제한 효소 (Apal 및 Sacl) 처리를 통해 확인하고 어류 성장호르몬 유전자가 속하리라 예상되는 700~1,200bp 범위의 insert 길이를 포함하는 클론 192개를 선발하여 single pass sequencing을 수행하였다. Sequencing primer는 insert의 5'쪽에 vector 상에 위치하는 SK primer (5'-CGCTCTAGAACTAGTGGATC-3')를 이용하였다.
- 이용하였다. Filter hybridization 후 클론의 정확한 선발을 용이하게 하기 위해 cDNA library로부터 mass excision에 의해 얻은 재조합 clone들을 대상으로 25cmX 25cm 내에 등간격의 2, 500개(50X50)의 박테리아 클론 배열을 만들어 분석하였다. 총 7, 500개의 클론들을 대상으로 filter hybri- dization-g- 수행하였으며 hybridization 및 detection의 전 과정은 Roche 사의 Non-radioactive Labeling and Detection Kit를 이용하였다.
- 조직은 간 (liver), 뇌하수체 (pituitary), 장 (intestin), 위 (gut), 근육 (muscle), 표피 (skin), 신장 (kidney) 및 비장 (spleen)을 대상으로 하였으며 조 직별로 분리된 total RNA에 DNase를 (10U/俸 RNA) 처리하여 DNA 오염을 제거시킨 후 분석에 이용하였다. RT-PCRe 분리된 1 佬의 조직별 total RNA를 이용하여 Titan One-tube RT-PCR kit (RocheX 이용하였으며 dot blote 2俸의 RNA를 nylon membrane에 고정화시킨 후 상기 HexaGH IF 및 1R primer로 증폭된 PCR product-i- probe로 이용하여 hybridization-8- 수행하였다.
- 본 염기서열을 바탕으로 성장호르몬 cDNA 단편 약 350bp가 증폭되도록 RT-PCR을 수행하였다. RT-PCRe 쥐노래미 뇌하수체 total RNA 1您을 대상으로 Titan One Tube RT-PCR kit (Roche)를 이용하여 수행하였으며 제조사의 방법대로 5(定에서 30분간 역전사 반응을 수행 후 곧 94t lmin, 55t 30 sec 및 72t Imin의 30회 순환 증폭 반응을 수행하였다. 증폭된 PCR 산물을 대상으로 nest PCR 방법을 통해 PCR 산물을 11-digoxygenin- dUTP로 표지하여 probeS.
- cDNA library제 작은 Lambda Zap cDNA synthesis kit (Stratagene, USA)를 이용하여 수행하였다. Reverse transcription 반응을 통해 cDNA st- rand들을 합성하였고 합성된 cDNA pool로부터 600bp 이상의 cDNA 분자들만을 선택적으로 회수하기 위해 spin column (CHROMAMOO, Clonetech, USA)을 수행하였다. 분리된 cDNA 분획을 UniZap XL1 vector (Stratagen USA)°fl ligation 시켰으며 ligation 된 반응물을 lambda phage 내로 packaging 하였다.
- 재조 합 박테리아로부터 플라스미드들을 분리하고 상기 SK primer 이외 에 T3(5'-ATTAACCCTCACTAAAGGA-3') 및 T7(5」TAATA- CGACTCACTATAGGG-3') sequencing primer들의 조합을 이용하여 상기의 조건대로 염기서열을 결정하였다. Sequencher 프로그램을 이용하여 contig 작성 및 transcript들 간의 염기서열 변이 검색을 수행하였으며 (Nam et al., 2002) 아울러 5'-upstream의 보존 여부, 정확한 open reading frame(ORF)의 존재 여부 및 3'- downstream의 보존 여부 등을 조사하였다. 또한 transcript들간 single nucleotide polymorphism의 여부 역시 검색하였고 각 클론 당 최소 3 반복 염기서열을 양방향으로 분석하였다.
- cDNA library를 제작하기 위해 뇌하수체 조직으로부터 Total RNA를 분리하였다. Total RNA 분리는 Tripure Reagent RNA Isolation Kit (Roche Molecular Biomedicals, Germany) ■& 이용 하였으며 조직 1 g당 10mL의 Tripure reagent를 첨가한 후 조직을 균질화시키고 chloroform 2mL와 혼합 후 원심 분리를 통하여 RNA를 포함하는 상등액, 단백질 계 면충 및 DNA를 포함하는 유기 용매충으로 분리하였다.
- 5 jug/ 의 농도로 mRNA를 녹여 실험에 이용하였다. cDNA library제 작은 Lambda Zap cDNA synthesis kit (Stratagene, USA)를 이용하여 수행하였다. Reverse transcription 반응을 통해 cDNA st- rand들을 합성하였고 합성된 cDNA pool로부터 600bp 이상의 cDNA 분자들만을 선택적으로 회수하기 위해 spin column (CHROMAMOO, Clonetech, USA)을 수행하였다.
- , 2002) 아울러 5'-upstream의 보존 여부, 정확한 open reading frame(ORF)의 존재 여부 및 3'- downstream의 보존 여부 등을 조사하였다. 또한 transcript들간 single nucleotide polymorphism의 여부 역시 검색하였고 각 클론 당 최소 3 반복 염기서열을 양방향으로 분석하였다.
- 클론들의 염기서열 분석은 BigDye terminator sequencing kit (ABI, USA)를 이용하여 수행하였으며 primer extension 반웅을 위한 열 순환 반응은 96t에서 10초, 501에서 5초 및 60龙에서 4분간으로 설정하여 25회 반복하였다. 반응이 완료된 extension 산 물에서 잔여 primer 및 ddNTP들을 제거하기 위해 spin column (CHROMA-100, Clonetech, USA)을 수행하였고 최종 반응 산물 3nL를 취하여 ABI 377 자동 염기서열 분석기를 통해 염기서열 단 편에 관한 정보를 수집하였다. 수집된 1차 염기서열 정보를 대상으로 염기서열 편집 프로그램인 Sequencher (ver.
- 본 염기서열을 바탕으로 성장호르몬 cDNA 단편 약 350bp가 증폭되도록 RT-PCR을 수행하였다. RT-PCRe 쥐노래미 뇌하수체 total RNA 1您을 대상으로 Titan One Tube RT-PCR kit (Roche)를 이용하여 수행하였으며 제조사의 방법대로 5(定에서 30분간 역전사 반응을 수행 후 곧 94t lmin, 55t 30 sec 및 72t Imin의 30회 순환 증폭 반응을 수행하였다.
- Reverse transcription 반응을 통해 cDNA st- rand들을 합성하였고 합성된 cDNA pool로부터 600bp 이상의 cDNA 분자들만을 선택적으로 회수하기 위해 spin column (CHROMAMOO, Clonetech, USA)을 수행하였다. 분리된 cDNA 분획을 UniZap XL1 vector (Stratagen USA)°fl ligation 시켰으며 ligation 된 반응물을 lambda phage 내로 packaging 하였다. 제작된 primary library의 titer를 조사한 후 plate method를 이용하여 phage들을 증폭시켰으며 in vivo mass excision 방법을 통해 pB- luescript SK plasmid 벡터 내로 cDNA 들을 클로닝 하였다다.
- Total RNA 분리는 Tripure Reagent RNA Isolation Kit (Roche Molecular Biomedicals, Germany) ■& 이용 하였으며 조직 1 g당 10mL의 Tripure reagent를 첨가한 후 조직을 균질화시키고 chloroform 2mL와 혼합 후 원심 분리를 통하여 RNA를 포함하는 상등액, 단백질 계 면충 및 DNA를 포함하는 유기 용매충으로 분리하였다. 분리된 상등액에 동일량의 isopropanol을 로부터 무작위로 선발한 재조합 플라스미드들의 insert 길이를 제한 효소 (Apal 및 Sacl) 처리를 통해 확인하고 어류 성장호르몬 유전자가 속하리라 예상되는 700~1, 200bp 범위의 insert 길이를 포함하는 클론 192개를 선발하여 single pass sequencing을 수행하였다. Sequencing primer는 insert의 5'쪽에 vector 상에 위치하는 SK primer (5'-CGCTCTAGAACTAGTGGATC-3') 를 이용하였다.
- 성장호르몬 cDNA transcript들의 뇌하수체 특이적 발현 분포 양상을 확인하기 위해 다양한 조직을 대상으로 RT-PCR 및 RNA dot blot을 수행하였다. 염기서열 정보를 바탕으로 약 630bp의 RT-PCR 산물을 증폭시킬 수 있는 primer set를 합성하였으며 (HexaGH IF 5'-CCAGAAGTGATCCCAGACCAGCCA-3' 및 HexaGH 1R 5'-GGGCTACAGGGTGCAGTTGGC「3') 이들을 이용하여 조직별로 분리된 total RNA들을 대상으로 reverse-transcription PCR 및 RNA dot bot-8- 수행하였다.
- 암 . 수 각 6마리로부터 해부학적 기법을 통해 뇌하수체 조직을 적출하여 cDNA library제 작에 이용하였다.
- 암 . 수 뇌하수체 조직으로부터 각각의 cDNA library를 제작하였다.
- 반응이 완료된 extension 산 물에서 잔여 primer 및 ddNTP들을 제거하기 위해 spin column (CHROMA-100, Clonetech, USA)을 수행하였고 최종 반응 산물 3nL를 취하여 ABI 377 자동 염기서열 분석기를 통해 염기서열 단 편에 관한 정보를 수집하였다. 수집된 1차 염기서열 정보를 대상으로 염기서열 편집 프로그램인 Sequencher (ver. 4.0; Gene Codes Co. USA)를 이용하여 염기서열을 분석하였으며 NCBI의 Gen- Bank (http://www.ncbi.nlm.nih.gov)내 포함되어 있은 데이터■베 이스를 대상으로 BLAST search를 수행함으로써 성장호르몬 유전자와 유사성을 갖는 transcript들을 확보하였다.
- 성장호르몬 cDNA transcript들의 뇌하수체 특이적 발현 분포 양상을 확인하기 위해 다양한 조직을 대상으로 RT-PCR 및 RNA dot blot을 수행하였다. 염기서열 정보를 바탕으로 약 630bp의 RT-PCR 산물을 증폭시킬 수 있는 primer set를 합성하였으며 (HexaGH IF 5'-CCAGAAGTGATCCCAGACCAGCCA-3' 및 HexaGH 1R 5'-GGGCTACAGGGTGCAGTTGGC「3') 이들을 이용하여 조직별로 분리된 total RNA들을 대상으로 reverse-transcription PCR 및 RNA dot bot-8- 수행하였다. 조직은 간 (liver), 뇌하수체 (pituitary), 장 (intestin), 위 (gut), 근육 (muscle), 표피 (skin), 신장 (kidney) 및 비장 (spleen)을 대상으로 하였으며 조 직별로 분리된 total RNA에 DNase를 (10U/俸 RNA) 처리하여 DNA 오염을 제거시킨 후 분석에 이용하였다.
- 우리나라 주요 해산 어종인 쥐노래미 (Hexagrammos otakii)로부터 성장호로몬 유전자 cDNA를 클로닝하고 이의 염기서열과 발현 특성을 분석하였다. 뇌하수체 조직으로부터 cDNA library를 제작하였으며 membrane filter hybridization 및 expressed sequence tag기술을 이용하여 성장호르몬 cDNA transcript들을 대량발굴하였다, 총 확보된 full-length clone 39개 중 31개가 동일한 형태로 나타났으나 나머지 클론들에서는 5'쪽의 염기서열 변이, ORF내의 염기서열 삽입, 3'쪽의 염기서열의 변이 등이 검출되었다.
- 확보된 클론들의 insert 전체 염기서열 분석을 수행하였다. 재조 합 박테리아로부터 플라스미드들을 분리하고 상기 SK primer 이외 에 T3(5'-ATTAACCCTCACTAAAGGA-3') 및 T7(5」TAATA- CGACTCACTATAGGG-3') sequencing primer들의 조합을 이용하여 상기의 조건대로 염기서열을 결정하였다. Sequencher 프로그램을 이용하여 contig 작성 및 transcript들 간의 염기서열 변이 검색을 수행하였으며 (Nam et al.
- 분리된 cDNA 분획을 UniZap XL1 vector (Stratagen USA)°fl ligation 시켰으며 ligation 된 반응물을 lambda phage 내로 packaging 하였다. 제작된 primary library의 titer를 조사한 후 plate method를 이용하여 phage들을 증폭시켰으며 in vivo mass excision 방법을 통해 pB- luescript SK plasmid 벡터 내로 cDNA 들을 클로닝 하였다다. 암 .
- 제작된 뇌하수체 cDNA library들로부터 성장호르몬 유전자와 유사성을 갖는 transcript들을 확보하기 위해 두 가지 방법을 병행하였다. 첫째, 기존에 보고되어 있는 어류 성장호르몬 유전자의 염기서열 분석을 바탕으로 어류 성장호르몬 유전자 내 보존적인 염기서열에 대한 degeneracy primer를 제작, probe로 사용할 RT- PCR product를 합성하여 high-density filter hybridization을 수행하였고 둘째, 자동화 염기서열 분석기를 이용하여 random clone 들을 대상으로 expressed sequence tag를 수행, 어류 성장호르몬 유전자와 유사성을 보이는 clone들을 발굴하였다.
- 염기서열 정보를 바탕으로 약 630bp의 RT-PCR 산물을 증폭시킬 수 있는 primer set를 합성하였으며 (HexaGH IF 5'-CCAGAAGTGATCCCAGACCAGCCA-3' 및 HexaGH 1R 5'-GGGCTACAGGGTGCAGTTGGC「3') 이들을 이용하여 조직별로 분리된 total RNA들을 대상으로 reverse-transcription PCR 및 RNA dot bot-8- 수행하였다. 조직은 간 (liver), 뇌하수체 (pituitary), 장 (intestin), 위 (gut), 근육 (muscle), 표피 (skin), 신장 (kidney) 및 비장 (spleen)을 대상으로 하였으며 조 직별로 분리된 total RNA에 DNase를 (10U/俸 RNA) 처리하여 DNA 오염을 제거시킨 후 분석에 이용하였다. RT-PCRe 분리된 1 佬의 조직별 total RNA를 이용하여 Titan One-tube RT-PCR kit (RocheX 이용하였으며 dot blote 2俸의 RNA를 nylon membrane에 고정화시킨 후 상기 HexaGH IF 및 1R primer로 증폭된 PCR product-i- probe로 이용하여 hybridization-8- 수행하였다.
- 제작된 뇌하수체 cDNA library들로부터 성장호르몬 유전자와 유사성을 갖는 transcript들을 확보하기 위해 두 가지 방법을 병행하였다. 첫째, 기존에 보고되어 있는 어류 성장호르몬 유전자의 염기서열 분석을 바탕으로 어류 성장호르몬 유전자 내 보존적인 염기서열에 대한 degeneracy primer를 제작, probe로 사용할 RT- PCR product를 합성하여 high-density filter hybridization을 수행하였고 둘째, 자동화 염기서열 분석기를 이용하여 random clone 들을 대상으로 expressed sequence tag를 수행, 어류 성장호르몬 유전자와 유사성을 보이는 clone들을 발굴하였다. Filter hybridizatione probe 합성을 위해 사용한 degeneracy primer의 염기서 열은 다음과 같다.
- Filter hybridization 후 클론의 정확한 선발을 용이하게 하기 위해 cDNA library로부터 mass excision에 의해 얻은 재조합 clone들을 대상으로 25cmX 25cm 내에 등간격의 2, 500개(50X50)의 박테리아 클론 배열을 만들어 분석하였다. 총 7, 500개의 클론들을 대상으로 filter hybri- dization-g- 수행하였으며 hybridization 및 detection의 전 과정은 Roche 사의 Non-radioactive Labeling and Detection Kit를 이용하였다.
- 최종 탐색 선발된 43개의 성장호르몬 유사 transcript들을 대상으로 전체 염기서열 분석을 양방향으로 반복 분석함으로써 양쪽 끝의 cloning site의 보존 유무, 5' 叩stream 부위, 개시코돈 및 종결코돈을 포함한 open reading frame, 3' downstream 부위 및 poly (A) tail의 보존 유무를 분석하였다. 분석된 43개 중 39개 클론들이 상기 부위들 모두를 잘 보존하고 있는 것으로 나타났으나 모두 동일한 염기 서열을 갖고 있지는 않았다.
- 클론들의 염기서열 분석은 BigDye terminator sequencing kit (ABI, USA)를 이용하여 수행하였으며 primer extension 반웅을 위한 열 순환 반응은 96t에서 10초, 501에서 5초 및 60龙에서 4분간으로 설정하여 25회 반복하였다. 반응이 완료된 extension 산 물에서 잔여 primer 및 ddNTP들을 제거하기 위해 spin column (CHROMA-100, Clonetech, USA)을 수행하였고 최종 반응 산물 3nL를 취하여 ABI 377 자동 염기서열 분석기를 통해 염기서열 단 편에 관한 정보를 수집하였다.
- 확보된 클론들의 insert 전체 염기서열 분석을 수행하였다. 재조 합 박테리아로부터 플라스미드들을 분리하고 상기 SK primer 이외 에 T3(5'-ATTAACCCTCACTAAAGGA-3') 및 T7(5」TAATA- CGACTCACTATAGGG-3') sequencing primer들의 조합을 이용하여 상기의 조건대로 염기서열을 결정하였다.
대상 데이터
- 부산 남천동 민락 활어 시장 및 경남 통영의 활어시장으로부터 쥐노래미 성어(200-350g) 암수를 구입하여 부경대학교 양식학과 연구실로 옮겨 실험에 사용하였다. 암 .
이론/모형
- 첨가하여 RNA를 침전시켰으며 최종 분리된 total RNA 500 陽으로 부터 poly (A) tail을 지닌 mRNA만을 다시 분리하였다. mRNA 분리는 magnetic particle을 이용하여 역시 Roche 사의 mRNA isolation 방법대로 수행하였으며 DEPC가 처리된 증류수에 0.5 jug/ 의 농도로 mRNA를 녹여 실험에 이용하였다. cDNA library제 작은 Lambda Zap cDNA synthesis kit (Stratagene, USA)를 이용하여 수행하였다.
성능/효과
- 3A). Digoxygenin으로 표지된 성장호르몬 cDNA probe를 이용한 RNA dot blot 분석에서도 역시 뇌하수체 조직에서만 hybridiztion 양성 반응이 검출되어 본 연구에서 탐색된 transcript들이 뇌하수체 특이적인 성장호르몬 cDNA 유전자임을 잘 보여주고 있다. (Fig.
- RT-PCR 분석 결과, 본 연구에서 탐색된 성장호르몬 transc- ript들은 뇌하수체 특이적인 발현양상을 나타내는 것으로 관찰되었다. 간 조직을 포함한 총 8종류의 조직을 대상으로 한 RT-PCR 반응에서 오직 뇌하수체에서만 증폭된 산물이 검출되었으며 증폭된 산물의 전기영동상 길이 역시 예상되는 transcript 길이와 정확히 일치하는 것으로 나타났다 (Fig.
- 뇌하수체 조직으로부터 cDNA library를 제작하였으며 membrane filter hybridization 및 expressed sequence tag기술을 이용하여 성장호르몬 cDNA transcript들을 대량발굴하였다, 총 확보된 full-length clone 39개 중 31개가 동일한 형태로 나타났으나 나머지 클론들에서는 5'쪽의 염기서열 변이, ORF내의 염기서열 삽입, 3'쪽의 염기서열의 변이 등이 검출되었다. RT-PCR과 RNA dot blot 분석을 수행한 결과 본 연구에서 얻어진 쥐노래미 성장호르몬 transcript들은 뇌하수체 특이적인 전형적인 어류 성장호르몬 발현 특성을 나타내었다.
- RT-PCR 분석 결과, 본 연구에서 탐색된 성장호르몬 transc- ript들은 뇌하수체 특이적인 발현양상을 나타내는 것으로 관찰되었다. 간 조직을 포함한 총 8종류의 조직을 대상으로 한 RT-PCR 반응에서 오직 뇌하수체에서만 증폭된 산물이 검출되었으며 증폭된 산물의 전기영동상 길이 역시 예상되는 transcript 길이와 정확히 일치하는 것으로 나타났다 (Fig. 3A). Digoxygenin으로 표지된 성장호르몬 cDNA probe를 이용한 RNA dot blot 분석에서도 역시 뇌하수체 조직에서만 hybridiztion 양성 반응이 검출되어 본 연구에서 탐색된 transcript들이 뇌하수체 특이적인 성장호르몬 cDNA 유전자임을 잘 보여주고 있다.
- 특성을 분석하였다. 뇌하수체 조직으로부터 cDNA library를 제작하였으며 membrane filter hybridization 및 expressed sequence tag기술을 이용하여 성장호르몬 cDNA transcript들을 대량발굴하였다, 총 확보된 full-length clone 39개 중 31개가 동일한 형태로 나타났으나 나머지 클론들에서는 5'쪽의 염기서열 변이, ORF내의 염기서열 삽입, 3'쪽의 염기서열의 변이 등이 검출되었다. RT-PCR과 RNA dot blot 분석을 수행한 결과 본 연구에서 얻어진 쥐노래미 성장호르몬 transcript들은 뇌하수체 특이적인 전형적인 어류 성장호르몬 발현 특성을 나타내었다.
- 2X106pfu/mL로서 뇌하수체에서 발현할 수 있는 다양한 유전정보를 포함하고 있음을 알 수 있었으며 또한 amplified library 및 excised library 역시 재조합 클론 함유 비율이 98% 이상으로 높게 나타났다. 무작위로 선발된 cDNA 클론들의 insert 평균 길이를 조사한 결과 1.6kb 이상으로 나타남으로 full-length 클론들이 다수 함유되어 있음을 알 수 있었다 (Table 1).
- 최종 탐색 선발된 43개의 성장호르몬 유사 transcript들을 대상으로 전체 염기서열 분석을 양방향으로 반복 분석함으로써 양쪽 끝의 cloning site의 보존 유무, 5' 叩stream 부위, 개시코돈 및 종결코돈을 포함한 open reading frame, 3' downstream 부위 및 poly (A) tail의 보존 유무를 분석하였다. 분석된 43개 중 39개 클론들이 상기 부위들 모두를 잘 보존하고 있는 것으로 나타났으나 모두 동일한 염기 서열을 갖고 있지는 않았다. 최종 선발된 39개의 클론들의 염기서열은 3가지 형태의 변이를 나타내었다.
- 상기 filter hybridization 방법과 병행하여 수행한 EST 검색에서 총 192개의 클론들을 대상으로 염기서열 표지를 수행한 결과 4개의 EST 클론들이 성장호르몬 유전자와 유사성을 갖는 것으로 나타났고 이들 모두 5'쪽 upstream region과 ATG 개시 코돈이 보존된 full-length cDNA clone의 가능성을 나타내었다. 아울러 성장호르몬 EST 클론들 이외에도 다양한 EST 정보들이 확보되었으며 성 성숙 관련, DNA 복저】, 전사 등과 관련된 염기서열들이 탐색 되었다 (data not shown).
- 최종 선발된 39개의 클론들의 염기서열은 3가지 형태의 변이를 나타내었다. 전체 39개 중 79%에 해당하는 31개 클론들이 동일한 염기서열을 갖고 있어 가장 높은 빈도의 대표성을 띄고 있었으며 (Fig. 1) 본 cDNA clone들은 70bp의 5'-upstream 부위, 203개의 아미노산을 포함하는 609 bp의 ORF, TAG 종결 코돈, 266 bp의 poly (A) tail을 포함하는 3'-downstream 부위로 구성되어 있었다. 해당 염기서열을 여타 어종들 (연어류, 틸라피아, 농어류, tuna 류, 가자미류 등)의 성장호르몬 cDNA들과 유사성을 비교한 결과 무지개송어 및 연 어종들과는 66~67 % , 농어류와는 85~87%, 틸라피아류와는 87~ 88%, tuna류와는 87~92%의 유사성이 펩타이드 수준에서 관찰되었다.
- 쥐노래미 뇌하수체로부터 제작된 cDNA library들의 특징을 Table 1에 나타내었다. 제작된 cDNA primary library의 크기는 1.1~1.2X106pfu/mL로서 뇌하수체에서 발현할 수 있는 다양한 유전정보를 포함하고 있음을 알 수 있었으며 또한 amplified library 및 excised library 역시 재조합 클론 함유 비율이 98% 이상으로 높게 나타났다. 무작위로 선발된 cDNA 클론들의 insert 평균 길이를 조사한 결과 1.
- 제작된 membrane array를 이용하여 총 7, 500개의 클론들을 검색한 결과 각 2, 500개의 무작위 클론을 포함하는 membrane ar- ray당 19개, 14개 및 11개의 클론들이 degeneracy primer로 제작한 probe와의 hybridization에서 강력한 양성반응을 보였으며 이들의 단편 염기서열을 분석한 결과 각각 19개 (100%), 14개 (100%) 및 10(91%)개의 클론들이 성장호르몬 유전자와 유사성을 갖는 것으로 나타났다.
- 쥐노래미 뇌하수체에서는 최소 3종류의 성장호르몬 transcript들 간 변이가 관찰되었으며 가장 높은 빈도(79%)로 발현하는 대표성 transcript 형태 외에도 5'- 및 3' 쪽의 염기서열 변이와 결실들은 물론 단일 염기서열 변이 역시 검출되어 흥미로운 결과를 나타내었다. 이는 기존의 어류 성장호르몬 염기서열을 보고하는 다른 논문들과는 달리 본 연구에서 성장호르몬 유전자 transcript들을 다량 확보함으로써 얻어진 결과로서 어류 성장호르몬 유전자의 발현 조절과 관련해서 흥미로운 연구 방향을 제공할 수 있다고 판단된다.
- 1) 본 cDNA clone들은 70bp의 5'-upstream 부위, 203개의 아미노산을 포함하는 609 bp의 ORF, TAG 종결 코돈, 266 bp의 poly (A) tail을 포함하는 3'-downstream 부위로 구성되어 있었다. 해당 염기서열을 여타 어종들 (연어류, 틸라피아, 농어류, tuna 류, 가자미류 등)의 성장호르몬 cDNA들과 유사성을 비교한 결과 무지개송어 및 연 어종들과는 66~67 % , 농어류와는 85~87%, 틸라피아류와는 87~ 88%, tuna류와는 87~92%의 유사성이 펩타이드 수준에서 관찰되었다. 한편 대표형 GH transcript외에도 검출된 다른 GH transc- ript들은 5'쪽의 염기서열 결손 및 변이, frame-shift 현상을 나타낼 수 있는 ORF 내의 염기서열 삽입, 3'쪽의 단일 염기서열의 변이 등을 나타내었다 (Fig.
후속연구
- 특히 본 연구에서 관찰된 ORF 내에 frame-shift 현상은 매우 드문 경우로서 cDNA 클로닝 과정 중 발생한 오류일 수도 있으나 실제 쥐노래미 뇌하수체에서 유도된 alternative splicing의 산물일 경우, translation을 통해 3'쪽 아미노산 배열에 심각한 변화를 야기시키고 생물학적 기능을 손실하거나 또는 다른 기능을 갖는 단백질의 합성이 예상된다. 따라서 이들 변이에 대한 보다 자세한 추적을 위해 genomic fragment의 PCR typing, in vitro translation 및 proteome 주적 등에 관한 실험이 뒤따라야 할 것으로 판단된다. Alternative splicing에 의한 유전자 발현은 proteome을 포함한 생체 내 발현 산물의 다양성을 극대화하기 위한 기작으로 알려지면서 최근 많은 관심이 집중되고 있다.
- 그러나 alternative splicing 가능성 이외에도 본 연구의 GH transcripts들간 변이가 mRNA가 아닌 gDNA 수준에서 야기되었을 가능성 역시 완전히 배제할 수는 없다. 본 연구에서 사용된 실험 어, 쥐노래미가 연어종처럼 배수화 (i.e. genome tetraploidization) 를 통해 진화해온 종은 아니나 틸라피아의 경우에서처럼 진화과정 중 유전체 (genome) 내에서 성장호르몬 유전자의 duplication 등이 일어났을 가능성 (Ber and Daniel, 1993) 또는 잉어에서처럼 두 개의 성장호르몬 gDNA 유전자에 의한 서로 다른 GH mRNA들 이 생산되었을 가능성 역시 향후 연구를 통해 규명해야만 할 것이다 (Chiou et al., 1990). 뿐만 아니라 본 연구에서 검출된 성장 호르몬내 단일 염기 변이성 (single nucleotie polymorphism)과 관련해서는 이들 변이 형태가 개체 간 변이 인지 또는 개체 내 transcript들간 변이인지를 규명함으로써 유전자 표지로서 활용 가능성 여부를 타진해야 할 것이다.
- 본 연구에서 얻어진 쥐노래미 성장호르몬 유전자의 정보를 바탕으로, 성장호르몬 유전자 genomic clone의 분리 및 구조 해석, 발현 기작 규명, 형질전환 벡터 개발 등이 가속화될 것으로 판단되며 아울러 다양한 변이형태를 갖는 쥐노래미 transcript들의 생물학적 미세기능 추적 그리고 이들의 유전 체내 존재 양상 등을 분석함으로써 쥐노래미 분자육종 기술 개발에 유용한 자료로 활용될 수 있을 것이다.
- , 1990). 뿐만 아니라 본 연구에서 검출된 성장 호르몬내 단일 염기 변이성 (single nucleotie polymorphism)과 관련해서는 이들 변이 형태가 개체 간 변이 인지 또는 개체 내 transcript들간 변이인지를 규명함으로써 유전자 표지로서 활용 가능성 여부를 타진해야 할 것이다. (Gallo et al.
- 쥐노래미 뇌하수체에서는 최소 3종류의 성장호르몬 transcript들 간 변이가 관찰되었으며 가장 높은 빈도(79%)로 발현하는 대표성 transcript 형태 외에도 5'- 및 3' 쪽의 염기서열 변이와 결실들은 물론 단일 염기서열 변이 역시 검출되어 흥미로운 결과를 나타내었다. 이는 기존의 어류 성장호르몬 염기서열을 보고하는 다른 논문들과는 달리 본 연구에서 성장호르몬 유전자 transcript들을 다량 확보함으로써 얻어진 결과로서 어류 성장호르몬 유전자의 발현 조절과 관련해서 흥미로운 연구 방향을 제공할 수 있다고 판단된다. 이러한 성장호르몬 transcript들간 다양성은 일반적으로 여타 다른 유전자들과 마찬가지로 하나의 성장호르몬 유전자 (genomic gene)에서 pre-mRNA가 합성된 후 post-transcriptional modification/editing 과정에서 형성된 alternative splicing의 산물로 판단되나 (Brett et al.
- 이는 기존의 어류 성장호르몬 염기서열을 보고하는 다른 논문들과는 달리 본 연구에서 성장호르몬 유전자 transcript들을 다량 확보함으로써 얻어진 결과로서 어류 성장호르몬 유전자의 발현 조절과 관련해서 흥미로운 연구 방향을 제공할 수 있다고 판단된다. 이러한 성장호르몬 transcript들간 다양성은 일반적으로 여타 다른 유전자들과 마찬가지로 하나의 성장호르몬 유전자 (genomic gene)에서 pre-mRNA가 합성된 후 post-transcriptional modification/editing 과정에서 형성된 alternative splicing의 산물로 판단되나 (Brett et al., 2000)이들 서로 다른 transcript들이 어떠한 다른 생물학적인 미세 기능을 담당하는지에 대해서는 향후 많은 연구가 이루어져야 할 것이다. 특히 본 연구에서 관찰된 ORF 내에 frame-shift 현상은 매우 드문 경우로서 cDNA 클로닝 과정 중 발생한 오류일 수도 있으나 실제 쥐노래미 뇌하수체에서 유도된 alternative splicing의 산물일 경우, translation을 통해 3'쪽 아미노산 배열에 심각한 변화를 야기시키고 생물학적 기능을 손실하거나 또는 다른 기능을 갖는 단백질의 합성이 예상된다.
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