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문제 정의
- 뿐만 아니라 蜂毒의 성분별로 어느 성분의 蜂毒 약침액이 어떤 세포 독성이 있는지에 대한 연구도 매우 적은 실정이다.⑸ 이에 著者는 蜂毒 藥緘液 중 어떠한 성분이 어느 농도에서 세포독성이 있는지 알아보기 위하여 crude bee venom과 蜂毒의 대표적 성분 중, me - littin, mast cell degranulating peptide (MCD peptide), apamin 등을 선택하여 비만세포에 투여한 후 3-(4, 5-dimethylthiazol-2 -yl)-2, 5-d iphenyltetrazolium bromide (MTT) 反應 實驗을 시행하여 細胞活性度의 변화를 검토하였던 바 有意 한 결과를 얻었기에 보고하는 바이다.
- 또한 蜂毒의 성분별로 어느 성분느 성분의 蜂毒 藥緘液이 어떤 細胞毒性이 있는지에 대한 연구는 매우 적은 실정이다. 따라서 본 실험에서는 蜂毒의 성분별 細胞毒性 효과를 살펴 보기 위하여 cmde bee venom, m이ittin, MCD P - eptide, apamin 등의 효능을 비교하여 보았다.
제안 방법
- 본 연구에서는 비만세포주에서 세포독성이 있는 농도를 알아보고자, crude bee venom, melittin, MCD peptide, apamin 모두 10”, 10~3 , * *1 0*- *2 , * * 10'1, l“g/双이 되도록 처치하였고, 보다 고농도에서의 세포독성을 평가하기 위해 蜂毒 성분 중 큰 비중을 차지하는 melittine 10"g/i戒 농도로, crude bee venome 10, 20, 102/zg/mi 농도로 처치하였다.
- 蜂毒 藥鐵液 중 蜂毒의 성분별 細胞毒性 효과를 살펴 보기 위하여 crude bee venom, melittin, mast cell degranulating peptide (MCD peptide), apamin 등을 선택하여 비만세포주에 투여한 후, MTT 反應實驗을 시행하여 細胞活性度의 변화를 검토하여 다음과 같은 결과를 얻었다.
- 蜂毒의 고농도에서의 세포독성을 평가하기 위해 crude bee venom과 함께 蜂毒 성분 중 큰 비중을 차지하는 m이ittin에 대해 고농도 처치시험을 시행하였다. 비만세포주에 1시간동안 crude bee venom을 처치하
- 蜂毒의 성분별로 비만 세포주에 대한 농도에 따른 세포독성을 측정하기 위하여, 세포배양에서 생존하는 세포의 수를 측정하는 방법인 MTT실험을 시행하였다. MTT실험 방법은 살아있는 세포의 m- itochodrial dehydrogenase가 기질 MTT를 검푸른 색깔의 formazan으로 변환시키는 작용을 이용하는 것으로, ELISA reader로 595nm에서 측정한 흡광도 (optical density, 이하 0D) 의 값은 살아있는 세포의 수를 반영하며, 세포 독성의 판정은 다음의 산출식에 따라 % viability로 나타낸다.
- 비만세포의 배양은 10% FBS가 포함된 IMDM 용액에 5% CO2, 95% 습도, 371 온도가 유지되는 세포 배양기에서 배양하였고, 배양액은 2일마다 교환하였다 37), 38)
- 실험에 사용한 蜂毒의 성분은 melittin, MCD -peptide, apamin으로 하였는데 蜂毒의 성분 중에서 함유량이 높은 세 가지를 선정한 것이며, 실험목적에 따라 加工한 乾燥蜂毒에 중류수로 농도별로 희석하여 사용하였고 crude bee venom과도 비교하였다. crude bee venom, apamin 및 melittine honey bee에서, MCD-peptide는 yellow hornet 에서 추출한 것이며, 이상의 蜂毒 제제는 모두 SIGMA에서 구입하여 사용하였다.
- 먼저 비만세포를 96 well plate (Corning, USA) 에 well당 배양액 100以에 5X104개의 세포 수가 되도록 serum free 배양액에 분주하고 검액으로 蜂毒을 시간별, 농도별로 처치하여 incubation 하였고, 蜂毒을 처치하지 않은 세포군을 대조군으로흐! 였다. 각 wel!에 MTT labeling reagent 용액을 10成씩 가하여 37t, 5% CO2 배양기에서 4시간 동안 배양한 후 Solubilization solution을 각 well 에 100成씩 첨가한 후 배양기에 20시간 유치시킨 후 ELISA reader (Bio-Tek, USA) 로 690nm를 참고치로 하여 595nm에서 측정하였다.
- 플라스크의 약 50-60% 면적을 차지하도록 細 胞를 배양한 후 serum free 배양액에 아래와 같이 蜂毒으로 처리하고 1시간, 6시간 incubation한 후 細胞의 活性度를 분석하였다%)
대상 데이터
- crude bee venom, apamin 및 melittine honey bee에서, MCD-peptide는 yellow hornet 에서 추출한 것이며, 이상의 蜂毒 제제는 모두 SIGMA에서 구입하여 사용하였다.
- 배양액 Iscove's Modified D니becco's Medium (IMDM), fetal bovine serum (FBS) 등은 Gibco BRL (Gland Island, NY, USA) 에서 구입하였으며, 3-(4, 5-dimethylthiazol-2-yl)-2, 5 -diphenyltetrazolium bromide (MTT)fe- Roche (Germany) 에서 구입하였고, 일반 시약은 SIGMA (USA) 제품을 사용하였다.
데이터처리
- 이용하였다. Student's t-test를 실시하여 각 군간의 통계학적 유의성을 검정하였으며 P 값이 0, 05 미만인 경우에만 통계적으로 유의성이 있는 것으로 인정하였다.
- 모든 실험값은 평균값土표준오차(mean土stan- dard error) 로 하고, 통계학적 분석은 SAS(Stat - istic Analysis System) program을 이용하였다. Student's t-test를 실시하여 각 군간의 통계학적 유의성을 검정하였으며 P 값이 0, 05 미만인 경우에만 통계적으로 유의성이 있는 것으로 인정하였다.
성능/효과
- melittine l"g/nU에서는 유의한 세포독성이 없었으나 10“g/i此에서는 유의한 세포독성이 있는 것으로 나타나, 2.42“M 이하에서는 세포독성이 없다는 기존의 보고와3後 일치하는 양상으로 나타났다.
- 10-4, I。-% IO-2, 1, 10/zg/mi, MCD peptide의 10~4/zg/me 처치군, apamin의 10~4, 10-1/zg/me 처치 군은 1시간 처치시에 비해 유의하게 (p<0.05) 세포 활성이 증가하였고, 다른 처치군에서도 통계적 유의성은 없으나 전반적으로 세포활성이 증가하는 양상을 나타내었다.
- 1. 蜂毒원액을 1(广網/畝, MT昭/戒 1(厂2傩/成, lO—zg/n此 l“g/n化의 저농도로 1시간 처치시 l“g/i戒 에서 대조군에 비해 유의하게 세포활성이 감소하였으며(p<0.01), 6시간 처치시는 대조군에 비해 유의한 차이를 보이지 않았다.
- 4. 蜂毒원액을 10陌砒, 20姻侦七 1。2国血의 고농도로 1시간과 6시간 처치한 결과, 10您㎛, 20昭 M, 10%g/觇에서 모두 유의하게 세포활성이 감소하였다 (p<0.01).
- 5. Melittin을 10“g/成의 고농도로 1시간과 6시간 처치한 결과, 1시간 처치시에는 10陌成에서 대조군에 비해 유의하게 세포활성이 감소하였으나 (P<0.01), 6시간 처치시에는 대조군에 비해 유의한 차이를 보이지 않았다.
- 3±0.6%, IO?您/祖에서는 5.7±1.1%의 세포 활성도를 나타냈으며, 모두 대조군에 비해 유의한 차이를 보였고(p<0.01), melittin을 처치하여 관찰한 결과, 10陽/砒에서는 63.5±13.8%의 세포 활성도를 나타냈으며, 대조군에 비해 유의한 차이를 보였다 (P<0.01). 또한 6시간 처치시에 蜂毒 원액은, 10必 /成에서는 15.
- 01). 또한 6시간 처치시에 蜂毒 원액은, 10必 /成에서는 15.1±8.6%, 20“以砒에서는 9.1±0.4%, I, 陌觥에서는 7.0±1.1%의 세포활성도를 나타냈으며, 모두 대조군에 비해 유의한 차이를 보였고 (p<0.01), melittin을 처치하여 관찰한 결과 10妃 砒에서는 104.1 ±3.2%의 세포활성도를 나타냈으며, 대조군에 비해 유의한 차이가 없었다.
- 또한 전반적으로 蜂毒 및 각 성분은 1시간 처치 시보다 6시간 처치시에 증가된 세포활성을 보여 細 胞毒性이 오래 지속되지 않는 것으로 나타났다. 향후 生體에서의 細胞毒性 평가와, 적절한 농도 및 용량을 알아내는 추가적인 실험 및 연구가 필요할 것으로 사료된다.
- 비만세포주에 1시간 동안 蜂毒을 종류별로 처치한 결과 대조군(100.0±12.0%)에 비해 crude bee venom 처치군은 10%g㎛에서는 95.0±4.8%, 10 「3陌叫에서는 93.7±5.0%, 10-2“g/i戒에서는 10 0.4±8.9%, 10—妳胞I서는 104.7±6.9%, l“g/i戒 에서는 70.0±8.9%의 세포활성도를 나타냈으며 1 鶴/成 처치군은 대조군에 비해 유의한 차이를 보였으나(p<0.01) 다른 세포군은 유의한 차이를 보이지 않았다 (Figure 1).
- 비만세포주에 MTT assay를 시행하여 검사한 결과 crude bee venom과 melittine 10“g/mC 이상의 고농도에서는 유의한 細胞毒性을 가지는 것으로 나타났다. 한편 MCD peptide와 apamine 1시간과 6 시간 처치한 결과, 대조군에 비해 모두 유의성이 없는 것으로 나타났는데, 그 이유는 단일성분의 細胞 毒性 효과보다 복합성분인 crude bee venom의 효과가 더 강하기 때문인 것으로 사려된다.
- 위와 같이 蜂毒과 그 주요 성분이 비만 세포주에 미치는 세포독성을 평가해본 결과, 배양액 100以에 5X10, 개의 세포가 있는 상태에서 1沪~1园砒의농도인 蜂毒 원액, melittin, MCD peptide, apamin 중 蜂毒 원액 1俸/演 1시간 처치군을 제외하고는 대조군에 비해 유의한 활성감소를 보이지 않아서 세포독성이 강하지 않은 것으로 나타났다.
- 요한다고 하겠다. 하지만 본 연구에서는 독성이 오래 지속되지 않는 것으로 나타났으며, 실제로 蜂毒이 넓은 부위로 퍼져나가 저농도로 희석되는 경우에는 유의한 세포독성이 없을 것으로 보인다.
- 하지만 전반적으로 볼 때 1시간 처치시보다 6시간 처치시 세포활성이 증가하는 양상을 보여 蜂 毒 원액 혹은 그 성분의 세포독성이 장시간 지속되지 않는 것으로 나타났다.
- 한편 MCD peptide와 apamine 1시간과 6 시간 처치한 결과, 대조군에 비해 모두 유의성이 없는 것으로 나타났는데, 그 이유는 단일성분의 細胞 毒性 효과보다 복합성분인 crude bee venom의 효과가 더 강하기 때문인 것으로 사려된다. 또 단일성분 중에서도 melittine 다른 두 성분과는 달리 1시간 처치시에는 유의하게 세포활성이 감소했으나 6 시간 처치시는 유의성이 없었던 것으로 보아, 단일성분 중에서도 복합물에 가까운 효과를 지님을 알 수 있으나, 이것의 정확한 기전에 대해서는 추후 심도깊은 논의가 필요할 것으로 보인다.
후속연구
- 한편 MCD peptide와 apamine 1시간과 6 시간 처치한 결과, 대조군에 비해 모두 유의성이 없는 것으로 나타났는데, 그 이유는 단일성분의 細胞 毒性 효과보다 복합성분인 crude bee venom의 효과가 더 강하기 때문인 것으로 사려된다. 또 단일성분 중에서도 melittine 다른 두 성분과는 달리 1시간 처치시에는 유의하게 세포활성이 감소했으나 6 시간 처치시는 유의성이 없었던 것으로 보아, 단일성분 중에서도 복합물에 가까운 효과를 지님을 알 수 있으나, 이것의 정확한 기전에 대해서는 추후 심도깊은 논의가 필요할 것으로 보인다.
- 향후 生體에서의 細胞毒性 평가와, 적절한 농도 및 용량을 알아내는 추가적인 실험 및 연구가 필요할 것으로 사료된다.
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