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문제 정의
- 특히 암이 악성화될수록 검출되는 횟수가 80% 이상으로 확인되어 혈청을 이용한 진단체계의 확립은 암 관련 질병의 정확한 진단에 필요한 연구이다. 본 연구에서는 환자의 혈청에 존재하는 S100A6단백질을 소량으로도 검출할 수 있는 sandwich ELISA 방법에 사용되는 특정 epitope을 인식하는 항체 및 인체의 각종 조직에서 어느 정도로 발현되며 또 어떻게 분포되어 있는가를 명확히 측정하여 임상적으로 보다 정확한 병변의 확인에 따른 체계적인 연구의 기초를 제공할 수 있는 항체를 제공하고자 하였다. 이에 관한 연구는 실용적인 면에서도 암을 진단하기 위한 정확하고 유용한 표식자로 활용할 수 있어 인체 S100A6 단백질에 대해 특이적으로 반응하는 단일클론 항체와 이 항체를 생산하는 하이브리도마 세포주의 제작은 높은 활용가치가 있다.
- 따라서 본 연구에서는 우선 인체 S100A6 유전자를 이용하여 S100A6 재조합 단백질을 생산한 후 이 단백질에 대한 단일클론 항체를 분비하는 융합세포주(Hybridoma)을 제조하고 생산된 단일클론 항체의 S100A6 단백질에 대한 특이성을 재조합단백질의 절단체(deletion mutants)들을 이용한 epitope 결정으로 증명하고자 하였다.
- 본 연구에서는 인체의 치명적인 질병의 하나인 암과 밀접한 관련이 있는 S100A6 단백질의 특정 부위를 인식하는 단일클론 항체를 제조하는 융합세포주와 그 항체를 생산하여 인체에 발생하는 수종의 암 조직에서 특이적으로 과발현하는 인체 S100A6 단백질을 인식하여 정상세포로부터 암세포를 식별할 수 있는 표식자로서의 활용가능성을 지닌 항체를 제시함을 목적으로 하였다. 실제 인체 S100A6는 흑색종양의 진전을 나타내는 표식자(7)로 알려져 있지만 전이성이 높은 세포주에서 그 발현정도가 더 높은 것으로 미루어보아 암세포의 전이과정에도 관련성이 있을 것으로 추정된다(11).
제안 방법
- 인체 S100A6 유전자(GenBank accession number, M18981)의 open reading frame (ORF) 전체 염기서열을 얻기 위해 인간 태아 간 cDNA library를 주형으로 하여 primer 5'-CGGGATCCATGGCATGCCCCTGGATCAGG-3'과 5'-CGGAATTCTCAGCCCTTGA GGGCTTCAT-3' 사용하여 PCR로 증폭시킨 후, 이를 제한효소인 BamHI과 EcoRI으로 절단하여 pGEX2T (Amersham Pharmacia Biotech) vector와 ligation시켜 GST-S100A6 발현벡터를 DH5α 대장균에 형질전환시켰다. 또한 제조한 단일클론항체의 epitope 결정을 확인하기 위하여 S100A6 재조합 단백질의 여러 C-terminal 절단체를 제조하였다. 우선 전체 90개의 아미노산으로 이루어진 C-terminal로부터 특정수의 아미노산 잔기를 절단한 변이체들을 각각 GST-S100A6 deletion mutant 1 (GST-SD1), GST-SD2, GST-SD3, GST-SD4와 GST-SD5라고 명명하였으며 이들 S100A6 절단변이체들의 primer들은 Table I에서 제시하였다.
- 우선 전체 90개의 아미노산으로 이루어진 C-terminal로부터 특정수의 아미노산 잔기를 절단한 변이체들을 각각 GST-S100A6 deletion mutant 1 (GST-SD1), GST-SD2, GST-SD3, GST-SD4와 GST-SD5라고 명명하였으며 이들 S100A6 절단변이체들의 primer들은 Table I에서 제시하였다. 증폭한 산물들을 제한효소 BamHI과 EcoRI으로 절단하여 각각 pGEX4T-1 발현벡터(Amersham Pharmacia Biotech)에 접합시켜 모두 대장균에 형질전환시켰다.
- GST-S100A6 재조합단백질과 절단변이체들의 발현vector들을 대장균 내에서 37℃로 배양한 후 1 mM IPTG로 각각의 재조합 단백질을 유도하였다. 우선 단일클론 항체를 제조하기 위한 항원으로 사용될 S100A6 단백질은 대량의 GST-S100A6 재조합 단백질을 유도시킨 배양액을 원심분리하여 균체를 회수한 후 초음파로 파쇄하여 세포조액(cell lysates)의 상등액에 존재하는 GST-S100A6 재조합 단백질을 GST affinity column (Amersham Pharmasia Biotech)을 이용하여 제품사의 지시사항에 따라 분리·정제하였다.
- GST-S100A6 재조합단백질과 절단변이체들의 발현vector들을 대장균 내에서 37℃로 배양한 후 1 mM IPTG로 각각의 재조합 단백질을 유도하였다. 우선 단일클론 항체를 제조하기 위한 항원으로 사용될 S100A6 단백질은 대량의 GST-S100A6 재조합 단백질을 유도시킨 배양액을 원심분리하여 균체를 회수한 후 초음파로 파쇄하여 세포조액(cell lysates)의 상등액에 존재하는 GST-S100A6 재조합 단백질을 GST affinity column (Amersham Pharmasia Biotech)을 이용하여 제품사의 지시사항에 따라 분리·정제하였다. 정제된 GST-S100A6 재조합 단백질은 thrombin (Sigma)으로 재조합된 GST 단백질을 절단하여 S100A6 단백질만 gel elution 방법으로 다시 분리하여 농축하였다.
- 최종 농축된 단백질의 량은 Bradford법으로 측정한 결과 100μg/ml이었다. 분리·정제된 단백질들은 15% SDS-polyacrylamide gel로 전기영동하여 확인하였다. 반면에 S100A6 절단변이체들은 위와 동일한 방법을 사용하여 1mM IPTG로 각각의 재조합 단백질의 생산을 유도하였고 각각의 세포조액을 12% SDS-PAGE로 분리하여 coomassie blue 염색과 GST 항체를 이용한 immunoblotting으로 생산된 절단변이체들을 확인하였다.
- 분리·정제된 단백질들은 15% SDS-polyacrylamide gel로 전기영동하여 확인하였다. 반면에 S100A6 절단변이체들은 위와 동일한 방법을 사용하여 1mM IPTG로 각각의 재조합 단백질의 생산을 유도하였고 각각의 세포조액을 12% SDS-PAGE로 분리하여 coomassie blue 염색과 GST 항체를 이용한 immunoblotting으로 생산된 절단변이체들을 확인하였다.
- 융합세포주(hybridoma)의 제작에 필요한 면역화된 백서를 얻기 위하여 Harlow와 Lane(24)이 제시된 방법에 따라 PBS 용액에 용해된 인체 S100A6 재조합 단백질(10μg/100μl)을 보조항원(adjuvant, Sigma)과 함께 섞어 생후 6주된 백서의 복강 내에 3～4차례 주사하였다. 면역화가 일어난 백서의 혈액을 소량 채취하여 96 well microtiter plate (Falcon)에 well당 1μg의 재조합 단백질을 부착시켜 ELISA 방법으로 항체의 역가를 확인하고 융합 세포주를 제조하는 단계로 진행하였다.
- 융합세포주(hybridoma)의 제작에 필요한 면역화된 백서를 얻기 위하여 Harlow와 Lane(24)이 제시된 방법에 따라 PBS 용액에 용해된 인체 S100A6 재조합 단백질(10μg/100μl)을 보조항원(adjuvant, Sigma)과 함께 섞어 생후 6주된 백서의 복강 내에 3～4차례 주사하였다. 면역화가 일어난 백서의 혈액을 소량 채취하여 96 well microtiter plate (Falcon)에 well당 1μg의 재조합 단백질을 부착시켜 ELISA 방법으로 항체의 역가를 확인하고 융합 세포주를 제조하는 단계로 진행하였다. 단일클론 항체를 분비하는 융합세포주를 제조하는데 거치는 세포융합(cell fusion), 융합세포의 선별과정, 단일클론 항체의 대량생산방법은 특허(등록번호, 330311) 내용에 따라 실시하였다.
- 이후 PVDF 막을 PBST 용액으로 3회 세척하고 2차 항체로 anti-mouse IgM-HRP (Sigma)을 상온에서 30분간 반응시켰다. 항원-항체반응을 나타내는 발색과정은 HRP (Horse radish peroxidase)의 기질로 사용되는 0.018% chloro-1-naphtol (Sigma)와 0.045% H2O2을 사용하여 반응시켰다. 단일클론 항체의 epitope 결정을 확인하기 위하여 절단변이체들을 단일클론 항체와 반응시키는 방법은 위의 과정과 동일하다.
- 반면에 서로 유사한 구조를 지니는 인체 S100 family 중 S100A1, S100A2, S100A4 단백질들과 단일클론 항체와의 반응성을 확인하여 인체 S100A6 단백질에 대한 특이성을 검증하였다. 이 과정은 GST-S100A1, GST-S100A2, GST-S100A4와 GST-S100A6 재조합 단백질을 96 well microtiter plate에 well당 각각 1μg씩 부착시킨 후 anti-S100A4와 anti-S100A6 항체를 각각 103과 104으로 희석하여 1시간 반응시키고 PBST 용액으로 충분히 세척한 후 anti-mouse IgG-HRP (Sigma)와 anti-mouse IgM-HRP을 가하여 1시간 반응시킨 다음 PBST 용액으로 충분히 세척하였다.
- 1A, lane 3). 과발현된 GST-S100A6 단백질의 가용성을 확인하기 위하여 재조합 단백질의 생산을 유도시킨 균체를 PBS용액에서 초음파로 파쇄하여 세포조액의 상등액을 SDS- PAGE로 분리하여 본 결과 과발현된 재조합 단백질의 90% 이상이 가용성 단백질로 확인되었고 이를 affinity column으로 분리한 단백질을 gel상에서 확인하였다(Fig. 1A, lane 4). S100A6 단백질에 특이적인 항체를 생산하기 위하여는 GST-S100A6 재조합 단백질의 GST 부분을 제거하여 S100A6 단백질만을 항원으로 사용하는 것이 좋은 결과를 유도할 수 있으므로 thrombin 효소의 인식부분을 지니는 재조합 단백질을 효소와 반응시켜 그 반응정도를 확인해 본 결과 50% 정도만이 GST- S100A6 단백질에서 GST (약 28 kDa)와 S100A6 (약 10 kDa)로 절단되었다(Fig.
- 1A, lane 5). 절단된 S100A6 단백질을 SDS-PAGE 상에서 전기적인 방법으로 추출하여 농축한 것도 동일한 gel상에서 확인하였다(Fig. 1A, lane 6).
- 2A). 그리고 이 단일클론 항체가 세포 내 존재하는 S100A6 단백질을 인지하는가를 인체 여러 암 조직에서 유래한 세포주의 세포조액을 6～15% gradient SDS-PAGE로 분리한 후 immunoblotting 방법으로 확인하였다. 그 결과, 약 9 kDa 크기의 S100A6 단백질들이 인체 간암 세포 유래의 세포주인 Hep3B와 인체 대장암 세포 유래의 세포주인 KM12와 HT29에서 확인되었다(Fig.
- 본 연구실에서 생산한 단일클론 항체가 S100A6 단백질의 어느 특정 부위를 인식하는가를 규명하는 일은 기존에 보고된 항체와의 차별을 확인할 수 있으며 전체 단백질의 부위별 인식을 요하는 실험에 도움을 주는 기반이 된다고 판단하여 GST-S100A6 전체 재조합 단백질의 카르복시기 말단부분을 특정 수 정도 절단한 5 종류의 변이체를 제작하여(Fig. 3A) GST-S100A6 재조합 단백질을 생산할 때와 동일한 조건으로 각각을 과발현시켰다(Fig. 3B, upper panel). 과발현된 재조합 단백질들은 예상되는 크기의 단백질로 발현됨을 확인할 수 있었으나 GST-SD5 재조합 단백질의 크기가 전체 S100A6를 포함하는 GST-S100A6 재조합 단백질보다 크게 확인되었다.
- 이는 앞서 ‘재료 및 방법'에서 언급하였듯이 GST-SD5 재조합 단백질은 pGEX 4T-1 vector와, GST-S100A6는 pGEX 2T vector에 cloning된 것으로 이로부터 생성된 재조합 단백질의 크기가 약간 차이가 나는 것으로 판단된다. 과발현된 GST 재조합 단백질의 절단 변이체들은 anti-GST 항체로 그 발현정도와 크기를 재차 확인하였다(Fig. 3B, middle panel). 확인된 절단 변이체들을 포함한 세포조액을 S100A6 단백질에 대한 단일클론항체로 반응성을 확인해 본 결과 GST-SD4 변이체부터 항원-항체 반응이 이루어짐을 확인할 수 있었다(Fig.
- 인체 S100A6 유전자(GenBank accession number, M18981)의 open reading frame (ORF) 전체 염기서열을 얻기 위해 인간 태아 간 cDNA library를 주형으로 하여 primer 5'-CGGGATCCATGGCATGCCCCTGGATCAGG-3'과 5'-CGGAATTCTCAGCCCTTGA GGGCTTCAT-3' 사용하여 PCR로 증폭시킨 후, 이를 제한효소인 BamHI과 EcoRI으로 절단하여 pGEX2T (Amersham Pharmacia Biotech) vector와 ligation시켜 GST-S100A6 발현벡터를 DH5α 대장균에 형질전환시켰다. 또한 제조한 단일클론항체의 epitope 결정을 확인하기 위하여 S100A6 재조합 단백질의 여러 C-terminal 절단체를 제조하였다.
대상 데이터
- 융합세포주의 제작에 필요한 면역화된 생쥐를 얻기 위하여 생후 6～8주가 된 Balb/c 백서를 사용하였고 이들 실험 동물들은 한국생명공학연구원(Korea Research Institute of Bioscience and Biotechnology) 내의 실험동물센타로부터 분양 받아 항온항습실에서 사육하면서 실험하였다. 세포 융합 시 모세포(parent cell)로 사용되는 Sp2/0·Ag14 세포주는 American Type Culture Collection (ATCC, Rockville, Maryland)으로부터 분양받아 10% fetal bovine serum (FBS, Gibco-BRL, Grand Island, NY)을 함유하는 RPMI1640 (Gibco-BRL, Grand Island, NY) 배지에서 배양하였다.
- 융합세포주의 제작에 필요한 면역화된 생쥐를 얻기 위하여 생후 6～8주가 된 Balb/c 백서를 사용하였고 이들 실험 동물들은 한국생명공학연구원(Korea Research Institute of Bioscience and Biotechnology) 내의 실험동물센타로부터 분양 받아 항온항습실에서 사육하면서 실험하였다. 세포 융합 시 모세포(parent cell)로 사용되는 Sp2/0·Ag14 세포주는 American Type Culture Collection (ATCC, Rockville, Maryland)으로부터 분양받아 10% fetal bovine serum (FBS, Gibco-BRL, Grand Island, NY)을 함유하는 RPMI1640 (Gibco-BRL, Grand Island, NY) 배지에서 배양하였다. 본 실험실에서 제조한 단일 클론 항체의 세포 내 S100A6 단백질에 대한 반응성을 확인하고자 인체 정상 간과 간암 세포주인 Chang liver, HepG2, Hep3B 그리고 대장암 세포주인 KM12, Colo205, HT29, SW620, HCT116들을 ATCC로부터 분양받아 10% FBS를 포함하는 DMEM (Gibco-BRL)과 RPMI1640 배지에서 배양하였다.
- 세포 융합 시 모세포(parent cell)로 사용되는 Sp2/0·Ag14 세포주는 American Type Culture Collection (ATCC, Rockville, Maryland)으로부터 분양받아 10% fetal bovine serum (FBS, Gibco-BRL, Grand Island, NY)을 함유하는 RPMI1640 (Gibco-BRL, Grand Island, NY) 배지에서 배양하였다. 본 실험실에서 제조한 단일 클론 항체의 세포 내 S100A6 단백질에 대한 반응성을 확인하고자 인체 정상 간과 간암 세포주인 Chang liver, HepG2, Hep3B 그리고 대장암 세포주인 KM12, Colo205, HT29, SW620, HCT116들을 ATCC로부터 분양받아 10% FBS를 포함하는 DMEM (Gibco-BRL)과 RPMI1640 배지에서 배양하였다.
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인체 S100A6 재조합 단백질을 생산하는 발현벡터의 제조.
- 또한 제조한 단일클론항체의 epitope 결정을 확인하기 위하여 S100A6 재조합 단백질의 여러 C-terminal 절단체를 제조하였다. 우선 전체 90개의 아미노산으로 이루어진 C-terminal로부터 특정수의 아미노산 잔기를 절단한 변이체들을 각각 GST-S100A6 deletion mutant 1 (GST-SD1), GST-SD2, GST-SD3, GST-SD4와 GST-SD5라고 명명하였으며 이들 S100A6 절단변이체들의 primer들은 Table I에서 제시하였다. 증폭한 산물들을 제한효소 BamHI과 EcoRI으로 절단하여 각각 pGEX4T-1 발현벡터(Amersham Pharmacia Biotech)에 접합시켜 모두 대장균에 형질전환시켰다.
- 3B, lower panel). 이러한 결과로 미루어 보아 Fig. 4에서 보여주는 모식도에서 같이 본 실험에 사용한 단일클론 항체는 S100A6 단백질의 47번 아미노산 서열부터 61번 아미노산 서열 사이의 특정 아마노산 서열을 인식함을 나타낸다.
- 본 연구실에서 제조한 인체 S100A6 단백질에 대한 단일클론 항체는 현재 보급되고 있는 Sigma사의 anti-S100A6 항체(clone CACY-100)와는 항체 아형의 종류와 S100A6 단백질을 인식하는 인식부위가 다른 항체이다. 본 연구실에서 제조한 단일클론 항체는 인체 S100A6 단백질의 46번 아미노산 서열부터 61번 아미노산 서열 사이를 인식하는 반면에 Sigma사의 항체는 31번부터 46번 사이의 아미노산 서열을 인지하는 특성을 지닌다(특허 등록번호, 330311). 따라서 인체 S100A6 단백질만을 특이적으로 인식하며 각각 다른 인식 부위를 나타내는 항체를 확보함으로써 환자들의 혈액에서의 sandwitch ELISA 체계를 구축할 수 있다.
이론/모형
- 면역화가 일어난 백서의 혈액을 소량 채취하여 96 well microtiter plate (Falcon)에 well당 1μg의 재조합 단백질을 부착시켜 ELISA 방법으로 항체의 역가를 확인하고 융합 세포주를 제조하는 단계로 진행하였다. 단일클론 항체를 분비하는 융합세포주를 제조하는데 거치는 세포융합(cell fusion), 융합세포의 선별과정, 단일클론 항체의 대량생산방법은 특허(등록번호, 330311) 내용에 따라 실시하였다. 또한 생산된 단일클론항체의 immunoglobulin의 아형은 immunodiffusion 방법(25)에 따라 확인하였다.
- 단일클론 항체를 분비하는 융합세포주를 제조하는데 거치는 세포융합(cell fusion), 융합세포의 선별과정, 단일클론 항체의 대량생산방법은 특허(등록번호, 330311) 내용에 따라 실시하였다. 또한 생산된 단일클론항체의 immunoglobulin의 아형은 immunodiffusion 방법(25)에 따라 확인하였다.
- 분리·정제된 단일클론 항체의 인체 S100A6 재조합 단백질에 대한 특이성은 immunoblotting과 ELISA 방법으로 확인하였다. 우선 immunoblotting 방법을 이용한 경우, 항원을 준비하는 과정의 GST-S100A6 재조합 단백질과 GST를 절단시킨 S100A6 단백질을 15% SDS-PAGE에 분리하여 PVDF 막(Millipore)에 단백질들을 옮긴 후 5% skim milk로 막을 차단하고 1차 항체로 준비된 단일클론 항체(1μg/μl)를 1,000배 희석하여 상온에서 2시간 결합시켰다.
- 앞에서 확인한 정제된 10 kDa의 S100A6 단백질을 항원으로 생후 6주된 3마리의 백서를 면역화시킨 후 이미 보고한 방법(특허 등록번호, 330311)에 따라 단일클론 항체를 분비하는 융합세포주를 선별하여 한국생명공학연구원 유전자원센타에 기탁하였다(기탁번호, KCTC 0447BP). 이 융합세포주에서 분비되는 단일클론 항체의 항원 특이성을 확인하기 위하여 GST만 유도시킨 세포 조액과 GST-S100A6, 정제된 GST-S100A6, gel 상에서 추출된 S100A6 단백질에 단일클론 항체를 이용하여 immunoblotting을 수행한 결과 GST 만을 유도한 세포조액과 GST-S100A6를 유도시키지 않은 세포조액에서는 항체의 반응이 일어나지 않았으며 GST-S100A6과 순수 S100A6 단백질에는 모두 항원-항체 반응이 일어났음을 확인하였다(Fig.
- S100A6 재조합 단백질을 항원으로 하여 생산된 단일클론 항체는 인체 S100A6 단백질만을 특이적으로 인식하는가를 검증하는 한 방법으로 S100A6 단백질과 유사한 구조를 지니는 S100 family 중에서 S100A1 S100A2, S100A4 재조합 단백질을 발현시켜 확보한 후 단일클론 항체가 S100A6 단백질에만 항원-항체 반응을 나타내는지 ELISA 방법으로 확인하였다. 그 결과 S100A1, S100A2, S100A4 그리고 대조군으로 bovine serum albumin (BSA)가 부착된 microtiter plate의 well들은 anti-S100A6 단일클론 항체에 반응하지 않았고 비교실험으로 본 연구실에서 제조한 anti-S100A4 단일클론 항체는 S100A4 재조합 단백질에만 그 특이성을 나타내고 있다(Fig.
성능/효과
- 인간 태아간 cDNA로부터 얻은 인체 S100A6 유전자의 전체 ORF 지역을 포함하는 pGEX4T-1-S100A6 발현벡터를 형질전환시킨 대장균을 1 mM IPTG로 S100A6 재조합 단백질을 유도시킨 후 15% SDS-PAGE로 확인해 본 결과, 분자량이 약 38 kDa에 해당하는 GST-S100A6 단백질이 전체 단백질의 30% 정도로 과발현되었다(Fig. 1A, lane 3). 과발현된 GST-S100A6 단백질의 가용성을 확인하기 위하여 재조합 단백질의 생산을 유도시킨 균체를 PBS용액에서 초음파로 파쇄하여 세포조액의 상등액을 SDS- PAGE로 분리하여 본 결과 과발현된 재조합 단백질의 90% 이상이 가용성 단백질로 확인되었고 이를 affinity column으로 분리한 단백질을 gel상에서 확인하였다(Fig.
- 1A, lane 4). S100A6 단백질에 특이적인 항체를 생산하기 위하여는 GST-S100A6 재조합 단백질의 GST 부분을 제거하여 S100A6 단백질만을 항원으로 사용하는 것이 좋은 결과를 유도할 수 있으므로 thrombin 효소의 인식부분을 지니는 재조합 단백질을 효소와 반응시켜 그 반응정도를 확인해 본 결과 50% 정도만이 GST- S100A6 단백질에서 GST (약 28 kDa)와 S100A6 (약 10 kDa)로 절단되었다(Fig. 1A, lane 5). 절단된 S100A6 단백질을 SDS-PAGE 상에서 전기적인 방법으로 추출하여 농축한 것도 동일한 gel상에서 확인하였다(Fig.
- 앞에서 확인한 정제된 10 kDa의 S100A6 단백질을 항원으로 생후 6주된 3마리의 백서를 면역화시킨 후 이미 보고한 방법(특허 등록번호, 330311)에 따라 단일클론 항체를 분비하는 융합세포주를 선별하여 한국생명공학연구원 유전자원센타에 기탁하였다(기탁번호, KCTC 0447BP). 이 융합세포주에서 분비되는 단일클론 항체의 항원 특이성을 확인하기 위하여 GST만 유도시킨 세포 조액과 GST-S100A6, 정제된 GST-S100A6, gel 상에서 추출된 S100A6 단백질에 단일클론 항체를 이용하여 immunoblotting을 수행한 결과 GST 만을 유도한 세포조액과 GST-S100A6를 유도시키지 않은 세포조액에서는 항체의 반응이 일어나지 않았으며 GST-S100A6과 순수 S100A6 단백질에는 모두 항원-항체 반응이 일어났음을 확인하였다(Fig. 1B). 단일클론 항체의 아형의 종류는 immunodiffusion 방법으로 확인한 결과 IgM 종류임을 확인하였다(결과를 제시하지 않음).
- 1B). 단일클론 항체의 아형의 종류는 immunodiffusion 방법으로 확인한 결과 IgM 종류임을 확인하였다(결과를 제시하지 않음).
- 그리고 이 단일클론 항체가 세포 내 존재하는 S100A6 단백질을 인지하는가를 인체 여러 암 조직에서 유래한 세포주의 세포조액을 6～15% gradient SDS-PAGE로 분리한 후 immunoblotting 방법으로 확인하였다. 그 결과, 약 9 kDa 크기의 S100A6 단백질들이 인체 간암 세포 유래의 세포주인 Hep3B와 인체 대장암 세포 유래의 세포주인 KM12와 HT29에서 확인되었다(Fig. 2B). 위의 결과로 보면 본 연구실에서 제조한 S100A6에 대한 단일클론 항체는 여러 유사한 S100 family 중에서 S100A6에 특이성을 지님을 알 수 있었다.
- 2B). 위의 결과로 보면 본 연구실에서 제조한 S100A6에 대한 단일클론 항체는 여러 유사한 S100 family 중에서 S100A6에 특이성을 지님을 알 수 있었다.
- 3B, upper panel). 과발현된 재조합 단백질들은 예상되는 크기의 단백질로 발현됨을 확인할 수 있었으나 GST-SD5 재조합 단백질의 크기가 전체 S100A6를 포함하는 GST-S100A6 재조합 단백질보다 크게 확인되었다. 이는 앞서 ‘재료 및 방법'에서 언급하였듯이 GST-SD5 재조합 단백질은 pGEX 4T-1 vector와, GST-S100A6는 pGEX 2T vector에 cloning된 것으로 이로부터 생성된 재조합 단백질의 크기가 약간 차이가 나는 것으로 판단된다.
- 3B, middle panel). 확인된 절단 변이체들을 포함한 세포조액을 S100A6 단백질에 대한 단일클론항체로 반응성을 확인해 본 결과 GST-SD4 변이체부터 항원-항체 반응이 이루어짐을 확인할 수 있었다(Fig. 3B, lower panel). 이러한 결과로 미루어 보아 Fig.
후속연구
- 이 연구에서는 전체 S100 family 단백질 중 어떤 종류인지 확인되지 않은 상태이며 혈액에서 검출 방법에 사용한 항체 또한 정확한 규명이 이루어지지 않은 상태이다. 따라서 현재까지 인체 수종의 암 분화 및 조절에 관련이 있는 S100A6 단백질을 관련 암 환자의 혈액이나 조직에서 이 단백질에 특이적인 반응을 가지는 항체로 검증하여 진단 표식자로서 활용가능성을 제시한다면 그 이용가치가 높다고 판단된다. 이 때 혈액에서 sandwich ELISA 방법에 사용할 수 있는 항체는 동일한 하나의 항원에 대해 각각 다른 인식 부위를 가지는 두 가지 항체가 필요하게 된다.
- 기존에 사용하고 있는 암 세포를 진단하는 표식자들은 carcinoembryonic antigen (CEA), epithelial membrane antigen (EMA), 여러 가지 cytokeratin 종류들(26,27)이 있는데 실제 단 한 가지만의 표식자로 정확한 진단을 한다는 것은 모순된 생각이다. 따라서 가능한 한 많은 진단 표식자를 확보하여 활용한다면 임상적으로 정확한 병변의 확인에 따른 체계적인 연구를 수행하는 기초를 제공할 것이다.
- 관련 신호전달 및 세포의 성장과 분화와 밀접한 관련이 있을 것으로 추정하나 그 정확한 기능이 밝혀져 있지 않다. 앞으로 본 연구에서 제시한 단일 클론 항체가 실용적인 면에서 암을 진단하기 위한 유용한 표식자로서 활용할 수 있을 뿐만 아니라 아직까지 밝혀지지 않은 세포 내 기전을 연구하는 데 기초를 제공할 것으로 생각한다.
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