[논문]광대싸리잎의 Acetylcholinesterase 활성 저해성분

장춘희; 은재순; 박혜원; 서선미; 양재헌; 임강현; 오석흥; 오찬호; 백남인; 김대근

문제 정의

⁸⁾ 중국에서는 일엽추(一葉萩)라 하여 活血舒筋, 建脾益腎, 强筋骨 등의 효능을 이용하여 風濕腰痛, 四肢麻木, 陽萎, 顏面神經麻痺 등에 사용하고 있다.⁹⁾본 연구는 광대싸리잎의 methanol 추출물을 시료로 bioassay-guided fractionation에 따라 실험을 진행하여 alkaloid 화합물 1종을 분리하여 물리화학적 성상과 spectral data를 이용하여 그 구조를 동정하였으며, 이 화합물의 AChE활성 저해효과를 측정한 결과 농도 의존적으로 유의성 있는 효과를 나타내어 이를 보고하고자 한다.
있었다. 따라서 광대싸리에 대한 문헌조사에서 alkaloid 성분을 많이 함유되는 있는 식물임을 확인하고 잎의 total MeOH 추출물을 일반적인 alkaloid 추출 방법에 따라 분획을 실시한 다음, 각 분획에 대하여 AC₁hE활성 저해효과를검토한 결과 조alkaloids분획에서 저해효과가 관찰되어 이분획에서 AChE활성 저해성분을 단리하고자 하였다(Table Ⅰ). 몇 가지 chromatography를 실시하여 가장 활성이 강한 소분획에서 화합물 1을 단리하였다.
그러나 이들 약물들은 ACh의 분해를 막아 ACh의 농도를 유지시킴으로써 저하된 인지기능을 개선시키는 효과를 가지고 있지만, 간독성이나 낮은 생체내 이용률 등의 문제가 야기되어 이러한 약물보다 선택적으로 뇌의 AChE에 작용하면서 부작용이 적은 새로운 AChE 저해제의 개발이 요구되고 있다. 이에 본연구는 새로운 AChE 저해제를 Ellman 법⁷⁾을 이용하여 국내에 자생하고 있는 식물 중에서 활성을 검색하던 중 광대싸리잎의 methanol 추출물이 유의성 있는 활성이 나타나 실험에 착수하였다.

제안 방법

산성 수층에 CHCl₃을 동량 넣어 2회 반복 추출하여 탈지한 다음, 10% NH₄OH로 alkali성이 될 때까지 가하고, 다시 CHCl₃으로 추출하여 조alkaloids 분획 13g을 얻었으며, 나머지는 수층으로 하였다. Ellman법에 의한 AChE활성 저해효과검색 결과 저해활성이 더 강한 조alkaloids분획 엑스 15 g을 n-hexane : CHCl₃: MeOH(10 : 1: 1)를 유출용매로 silica gel column chromato-graphy를 실시하여 TLC 양상에 따라 7개의 분획으로 나누었다. 각 분획 중 AChE활성 저해효과가 가장 강하게 확인된 5번 분획에 대하여 dragendorff 시액에 강하게 양성을 나타낸 부분을 n-hexane: CHCl₃: Acetone(l: 1: 2)를 유출 용매로 Lobar-A Lichroprep Si 60(Merck) column과 Sephadex LH-20 column chromatography를 반복 실시하여 1 종의 화합물을 분리하였다.
Ellman법에 의한 AChE활성 저해효과검색 결과 저해활성이 더 강한 조alkaloids분획 엑스 15 g을 n-hexane : CHCl₃: MeOH(10 : 1: 1)를 유출용매로 silica gel column chromato-graphy를 실시하여 TLC 양상에 따라 7개의 분획으로 나누었다. 각 분획 중 AChE활성 저해효과가 가장 강하게 확인된 5번 분획에 대하여 dragendorff 시액에 강하게 양성을 나타낸 부분을 n-hexane: CHCl₃: Acetone(l: 1: 2)를 유출 용매로 Lobar-A Lichroprep Si 60(Merck) column과 Sephadex LH-20 column chromatography를 반복 실시하여 1 종의 화합물을 분리하였다.
국내 자생 식물 중 Ellman법을 이용하여 AChE 저해제를 검색하던 중 광대싸리(Securinega suffruticosa Rehder)잎의 methanol 주출물이 유의성 있는 활성이 나타나 bioassay- guided fractionation에 따라 실험을 진행하여 alkaloid 화합물 1종을 분리하였다. 기기분석 결과 dihydrosecurinine으로 동정 된 이 화합물은 AChE의 활성을 농도 의존적으로 저해시켰으며, IC%값이 18.
따라서 광대싸리에 대한 문헌조사에서 alkaloid 성분을 많이 함유되는 있는 식물임을 확인하고 잎의 total MeOH 추출물을 일반적인 alkaloid 추출 방법에 따라 분획을 실시한 다음, 각 분획에 대하여 AC₁hE활성 저해효과를검토한 결과 조alkaloids분획에서 저해효과가 관찰되어 이분획에서 AChE활성 저해성분을 단리하고자 하였다(Table Ⅰ). 몇 가지 chromatography를 실시하여 가장 활성이 강한 소분획에서 화합물 1을 단리하였다. 화합물 1은 황색의 고체로 EIMS에서 분자량이 219임을 확인할 수 있었으며, ¹H-NMR spectrum에서 85.
추출빙법은 1 M NaCl, 50 mM MgCl2 및 1% Triton X-100이 포함되어 있는 10 mM Tris-HCl(pH 7.2)를 PC12 세포 5 배량을 넣고 균질하게 homogenation한 후에 10,000xg에서 30분간 원심분리하고 상층액을 분리하였다.¹⁰⁾완충액은 50 mM, 인산완충액(phosphate buffer, pH 8.
3회 온침 추출하였다. 추출액을 여과한 후에 수욕상에서 감압농축하여 MeOH 엑스 140 g을 얻었으며, 이 MeOH 엑스에 0.1 N HCl 1 l를 가하여 용해시킨 다음 상법에 따라 조alkaloids를 분획하였다. 산성 수층에 CHCl₃을 동량 넣어 2회 반복 추출하여 탈지한 다음, 10% NH₄OH로 alkali성이 될 때까지 가하고, 다시 CHCl₃으로 추출하여 조alkaloids 분획 13g을 얻었으며, 나머지는 수층으로 하였다.
6 μM)보다는 낮은 억제활성을 나타냈으나 AChE의 활성을 농도의존적으로 저해시켰다. 화합물 1의 작용 양상 중 기질인 acetylthiochoUne (ATCh)과의 경쟁 관계를 알아보기 위하여 농도를 달리하면서 그 반응속도를 측정하여 Lineweaver-Burk plot을 작성하여 본 결과 Fig. 3과 같이 나타났다. 화합물 1은 MichaeHs-Menten 상수인 K_m은 일정하게 유지시켰으나 V_m는 농도 의존적으로 감소시켜 AChE의 활성을 비경쟁적으로 저해시킴¹⁴⁾을 알 수 있었다.

대상 데이터

- 본 실험에 사용한 광대싸리(Secwi/iegasuffruticosa Rehder)는 2001년 8월에 전북 순창군에 자생하는 것을 직접 채취하였다. 위 식물은 정확이 감정한 후에 음건한 다음 세절하여 실험에 사용하였으며, 표품(WSU-01- 07)은 우석대학교 약학대학 생약표본실에 보관되어 있다.
1H-NMR 및 ¹³C-NMR은 Jeol JMN-EX 400 spectrometer(Japan)를 EI-MS는 VG70-VSEQ(UK)로 측정하였다. 추출 및 분획용 시약은 1급 용매를 사용하였으며, TLC 및 column용 시약 등은 1급 용매를 재증류하여 사용하거나,특급시약을 사용하였다.
추출 및 분획용 시약은 1급 용매를 사용하였으며, TLC 및 column용 시약 등은 1급 용매를 재증류하여 사용하거나,특급시약을 사용하였다. Column chromatography용 silica gel은 Kiesel gel 60(Art. 1.07734, Merck)으로 230- 400 mesh를, molecular sieve solumn chromatography packing materia은 Sephadex LH-20(Pharmacia)을 사용하였다. TLC plate 는 Kiesel gel 60 F₂₅₄ precoated plate(Art.
07752, Merck), low pressure liquid chromatography (LPLC) 용 column은 Lobar-A Lichroprep Si 60(Merck) column을 사용하였다. 발색시약으로는 10% H₂SO₄(in EtOH) 분무시액과 Dragendorff 분무시액을 사용하였다. 효소반응의 기질로 사용한 acetylthiocholine iodide(ATCh), coupling agent로 사용한 5, 5-dithiobis-2-nitrobenzoic acid(DTNB)는 Sigma Chemical Co에서 구입하여 사용하였다.
발색시약으로는 10% H₂SO₄(in EtOH) 분무시액과 Dragendorff 분무시액을 사용하였다. 효소반응의 기질로 사용한 acetylthiocholine iodide(ATCh), coupling agent로 사용한 5, 5-dithiobis-2-nitrobenzoic acid(DTNB)는 Sigma Chemical Co에서 구입하여 사용하였다.

데이터처리

- 통계적 유의성의 검토는 Student t-test를 실시하여 p<0.05를 기준으로 하여 판정하였다.

이론/모형

- 효소활성은 Ellman법⁷⁾을 사용하여 측정하였다. AChE 효소는 생쥐의 뇌에서 추출하였다.

성능/효과

4 Hz) ppm에서 1개의 olefinic proton이 관찰되었다. ¹³C-NMR spectrum에서는 δ 178.0 ppm에서 1개의 carbonyl signal0] 나타났으며, δ 1753과 109.9 ppm에서 2개의 olefinic carbon signal이 관찰되었고, oxygen 또는 nitrogen bearing carbon으로 추정되는 signal이 δ 93.0, 62.9, 61.5 ppm에서 나타났으며, 그 외에 6개의 signal 049.4, 38.5, 32.7, 25.4, 23.7, 21.3 ppm)이 관찰되어 모두 12개의 carbon signal이 확인되었다. 이와 같은 자료를 토대로 화합물 1은 본 식물에서 이미 보고되어 있는 securinine-type alkaloid임을 알 수 있었으며, 기존 문헌^11,12)과 비교하여 화합물 1은 dihyrosecuiinina으로 확인 동정하였다.
1종을 분리하였다. 기기분석 결과 dihydrosecurinine으로 동정 된 이 화합물은 AChE의 활성을 농도 의존적으로 저해시켰으며, IC%값이 18.9 ㎍/ml로 측정되었고, Lineweaver-Burk plot에서 K_m은 일정하게 유지시키고 V_max는 농도 의존적으로 감소시켜 기질과 비경쟁적으로 AChE의 활성을 저해시킴을 확인할 수 있었다.
수십 종의 국내 자생식물에 대하여 total MeOH 추출물을 조제하여 Ellman법에 따라 AChE활성 저해검색을 한 결과 광대싸리잎의 MeOH 추출물이 저해효과가 있음을 확인할 수 있었다. 따라서 광대싸리에 대한 문헌조사에서 alkaloid 성분을 많이 함유되는 있는 식물임을 확인하고 잎의 total MeOH 추출물을 일반적인 alkaloid 추출 방법에 따라 분획을 실시한 다음, 각 분획에 대하여 AC₁hE활성 저해효과를검토한 결과 조alkaloids분획에서 저해효과가 관찰되어 이분획에서 AChE활성 저해성분을 단리하고자 하였다(Table Ⅰ).
3 ppm)이 관찰되어 모두 12개의 carbon signal이 확인되었다. 이와 같은 자료를 토대로 화합물 1은 본 식물에서 이미 보고되어 있는 securinine-type alkaloid임을 알 수 있었으며, 기존 문헌^11,12)과 비교하여 화합물 1은 dihyrosecuiinina으로 확인 동정하였다. 화합물 1의 AChE 저해활성은 IC₅₀ 값이 18.
몇 가지 chromatography를 실시하여 가장 활성이 강한 소분획에서 화합물 1을 단리하였다. 화합물 1은 황색의 고체로 EIMS에서 분자량이 219임을 확인할 수 있었으며, ¹H-NMR spectrum에서 85.55(1H, d, J=2.4 Hz) ppm에서 1개의 olefinic proton이 관찰되었다. ¹³C-NMR spectrum에서는 δ 178.

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