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문제 정의
- 본 연구에서는 자운영 (Astragalus sinicus) 종자로부터 페놀 성화합물을 분리하여 그 항산화 효과를 파익하고자 하였다
제안 방법
- 9ml을 가하였다. 각 시료는 5가지 농도로 조제하였다. \brtex mixer로 10초간 진탕한 후 37℃에서 30분 동안 incubation 시킨 후spectrophotometer를 이용하여 515 nm에서 흡광도를 측정하였다.
- 추출 및 분리 - 자 운영 종자 800항을 80% aqueous acetone으로 실온에서 3회 추출하여 여과하였다. 그 추출액을 감압농축한 엑스(80 g)를 HQ에 현탁하여 여과한 후 Sephadex LH-20 컬럼크로마토그래피를 실시하였다. 용매는 물에서부터 메탄올을 10%씩 올려 100%까지 농도를 높였으며 TLC 를 실시하여 7개의 fraction으로 나누었다.
- \brtex mixer로 10초간 진탕한 후 37℃에서 30분 동안 incubation 시킨 후spectrophotometer를 이용하여 515 nm에서 흡광도를 측정하였다. 양성대조약물로는 ascorbic acid를 5가지 농도로 조제하여 측정하였다. 각 시료의 항산화 작용은 IC50 치 (DPPH 래디칼 형성을 50%로 억제하는 데 필요한 농도mM) 로 나타내었다.
- 그 추출액을 감압농축한 엑스(80 g)를 HQ에 현탁하여 여과한 후 Sephadex LH-20 컬럼크로마토그래피를 실시하였다. 용매는 물에서부터 메탄올을 10%씩 올려 100%까지 농도를 높였으며 TLC 를 실시하여 7개의 fraction으로 나누었다. Fe2에 대해서는MCI-gel CHP 20P (20% MeOH->100% MeOH, gradient system) 및 ODS-gel을 이용한 Low pressure liquid column chromatography (H2O~>80% MeOH, gradient system)을 실시 하여 compound 1 (170 mg)을 얻었다.
- 이상의 기기분석 결과로부터 이 화합물을 kaempferol 3-(시3-D-apiofuranosyl-(lT2)-a-L-rhamnopyranosyl-(l→6)-β-D-glucopyranoside로 확인하였으며, 문헌과의 data 비교를 통해 동정하였다.29,30)
- 이상의 기기분석 결과를 토대로 이 화합물을 ampelopsin 3'-O-β-D-xylopyranoside로 확인하였으며, 문헌과의 data 비교를 통해 동정하였다.32)
- 이상의 기기분석 결과를 토대로 이 화합물을 myricetin 3'O-3-β-glucopyranoside로 확인하였으며, 문헌과의 data 비교를 통해 동정하였다.32)
- 이상의 기기분석 결과를 통해 이 화합물을 ampelopsin 3'-O-β-D-glucopyranoside로 확인하였으며, 문헌과의 data 비교를 통해 동정하였다.32)
- 추출 및 분리 - 자 운영 종자 800항을 80% aqueous acetone으로 실온에서 3회 추출하여 여과하였다. 그 추출액을 감압농축한 엑스(80 g)를 HQ에 현탁하여 여과한 후 Sephadex LH-20 컬럼크로마토그래피를 실시하였다.
- 기타 용매는 1급 시약을 사용하여 실험하였다. 흡광도는 Human TU-1800PC UV/Vis spectrophotometer(PGENERAL)를 사용하여 측정하였다.
대상 데이터
- 기기 및 시약 - IR spectrophotometer : Shimadzu IR-435 (Japan), KBr, 1H-NMR spectrometer : Varian GEMINI 2000, 300 MHz (USA), Broker AMX-500, 500 MHz (Germany), 13C-NMR spectrometer : Varian GEMINI 2000, 75 MHz (USA), Bruker AMX-500, 125 MHz (Germany), Mass spectrometer : API 3000 triple quadrupole mass spectrometry (Canada), TLC : Adsorbent ; Kieselgel 60 F254 (Merck, Germany), Cellulose (Sigma, USA), Solvent (v/ v); CHC13 : MeOH : H2O=6 : 4 : 1, 70 : 30 : 4 Detection; Ethanolic-FeCl3 solution, 10%-H2SO4 in H2O (heating), UVlamp (254 nm), Chromatographic gels : Sephadex LH- 20 (25-100 |im, Sigma, USA), MCLgel CHP-20P (75 - 150 Mitsubishi, Japan), YMC-gel ODS-A(230/70, 400/ 230, 500/400 mesh, YMC Co., Japan), Low Pressure Liquid Column Chromatography (pump : Gilson minipuls 3, detector : Gilson 112 UV/VIS (254 nm), gel : YMC-gel ODS-A (500/400 mesh, YMC Co., Japan), data system : Autochro-Win 3.0 plus (Tbung-lin Co., Korea))DPPH (1, 1 -diphenyl-2-picrylhydrazyl), /-ascorbic acid, 2- thiobarbituric acid는 Sigma에서 구입하였고, 99.5% ethanol 은 Merck, trichloroacetic acid는 ACROS에서 구입하여 사용하였다. 기타 용매는 1급 시약을 사용하여 실험하였다.
- 실험 재료 -본 실험에서 사용한 자 운영 (Astragalus sinicus) 의 종자는 2002년 12월 시판하는 것을 경동시장에서 구입하여 사용하였다.
데이터처리
- 이상의 기기분석 결과를 통해 이 화합물을 myricetin 3'-O-β-D-xylopyranoside로 확인하였고, 문헌과의 data 비교를 통해 동정하였다.32)
이론/모형
- 래디칼 소거작용의 측정- Hatano et 의 방법23)에 의하여 시료를 각 농도별로 조제한 용액 100µl (control :99.5% ethanol)에 0.1 mM DPPH 용액(99.5% ethanol) 1.9ml을 가하였다. 각 시료는 5가지 농도로 조제하였다.
성능/효과
- 13C-NMR spectrum에서는 kaempferol과 비교하여 C-2가 8 156.6으로 저자 장으로, C-3이 5 133.1으로 고자 장 shift하 여 당이 3번 위치에 결합한 것을 알 수 있었으며, fucose, rhamnose, apiose의 peak를 각각 확인하였다. 또한, H'-H1 COSY와 HMQC spectrum을 통하여 각각의 carbon과 proton 을 귀속시킨 후 HMBC spectrum에서 C-3과 glucose 1번수소, glucose 6번 탄소와 rhamnose 1번수소, rhamnose 2번 탄소와 apiose 1번수소 사이의 correlation peak를 확인하여 각 결합 위치를 확인하였으며, negative FAB MS spectrum에서 m/z 724 [M-H]의 피크를 보여주었다.
- 1으로 고자 장 shift하 여 당이 3번 위치에 결합한 것을 알 수 있었으며, fucose, rhamnose, apiose의 peak를 각각 확인하였다. 또한, H'-H1 COSY와 HMQC spectrum을 통하여 각각의 carbon과 proton 을 귀속시킨 후 HMBC spectrum에서 C-3과 glucose 1번수소, glucose 6번 탄소와 rhamnose 1번수소, rhamnose 2번 탄소와 apiose 1번수소 사이의 correlation peak를 확인하여 각 결합 위치를 확인하였으며, negative FAB MS spectrum에서 m/z 724 [M-H]의 피크를 보여주었다.
- 이상의 기기분석 결과와 문헌과의 data 비교를 통해 이 화합물을 ampelopsin^로 확인, 동정하였다.32)
- 이상의 기기분석 결과와 문헌과의 data 비교를 통해 이 화합물을 myricetin으로 확인, 동정하였다.32)
- 자 운영 종자로부터 3종의 flavanonol, 5종의 flavonol 화합물을 분리함으로써 자 운영종자는 풍부한 flavonoid 화합물의 자원임을 알 수 있었으며, 이들 flavonoid 화합물들은 DPPH를 이용한 항산화 실험에서 우수한 항산화 효과를 나타내었다. 특히 , flavanonol 형태인 3 (IC50=6.
- 자 운영 종자로부터 3종의 flavanonol, 5종의 flavonol 화합물을 분리함으로써 자 운영종자는 풍부한 flavonoid 화합물의 자원임을 알 수 있었으며, 이들 flavonoid 화합물들은 DPPH를 이용한 항산화 실험에서 우수한 항산화 효과를 나타내었다. 특히 , flavanonol 형태인 3 (IC50=6.47 µM), 4 (IC50= 8.45 |xM), 5 (IC5o=4.691µM)가 양성대 조군인 ascorbic acid(IC50=10.91 µM)와 비교하여 뛰어난 항산화 활성을 보여주 었다.
- 한편 이들 8가지 화합물에 대하여 DPPH를 이용한 항산화 활성을 측정한 결과, 양성대 조군인 ascorbic acid (IC50= 10.91 |1M)와 비교하여, flavonol 화합물로써 kaempferol의 배당체(1, IC50=17.41 pM)와 qurecetin의 배당체(2, 1C50=13.44 µM), myricetin (6, 12.92 µM)과 그 배당체 (7, IC50=18.31 |1M; 8, IC5o=29.O6 µM)에 비하여, flavanonol 화 합물인 ampelopsin (3, IC50=6.47 µM)과 그 배당체들 (4, IC50=8.45 |1M; 5, IC50=4.69 |1M)이 보다 우수한 항산화 활성을 보여주었다(Table n 참조).
후속연구
- 이상의 결과를 종합해 볼 때 자 운영종자의 flavonoid 화합물은 항산화제로의 개발 가능성이 있다고 사료된다.
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