[논문]부신수질 크로마핀(Chromaffin) 세포를 이용한 승마 추출무의 카테콜라민 분비 저해작용

우경철; 서병선

부신수질 크로마핀(Chromaffin) 세포를 이용한 승마 추출무의 카테콜라민 분비 저해작용
The Effects of Cimicifuga Racemosa Extracts on the Inhibition of Catecholamine Secretion in Bovine Chromaffin Cells 원문보기

생약학회지, v.34 no.4 = no.135, 2003년, pp.318 - 323

우경철 (한동대학교 생명식품과학부 생의학 연구실) , 서병선 (한동대학교 생명식품과학부 생의학 연구실)

Abstract ▼ AI-Helper

Extracts of Black cohosh (Cimicifugae rhizoma) have been used for the treatment of climacteric complaints for decades. A significant number of woman entering menopause exhibit the following symptoms: getting hot flushes, night sweats, irritability, depression, and anxiety, A reduction of the frequency of hot flushes equivalents and hints on the antidepressant activity of Cimcifuga extracts. In the present work, we have screened several 80% ethanol extracts from medicinal plants and found that the extracts from Cimicifugae Rhizoma(Black cohosh:승마) have inhibitory effect on catecholamine secretion in bovine chromaffin cell. Since this extract inhibited 1,1-dimethyl-4-phenylpiperazinium iodide (DMPP)-induced catecholamine secretion, but did not inhibit KCl, bradykinin, and veratridine-evoked case, this inhibitory effect is mediated by nicotinic acetylcholine receptors with noncompetitive manner.

주제어

AI 본문요약
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문제 정의

본 연구에서는 승마 이외의 몇 가지 종류의 한약재에 대한 에탄올 추출물이 카테콜라민 분비에 어떤 영향을 끼치는지 함께 검색했고, 특이하게 승마의 추출물이 카테콜라민 분비를 유의하게 저해하는 것을 관찰했다. 승마는 과거로부터 통증을 완화시키고, 특히 폐경이후 나타나는 여성 질환의 증세를 완화시키는 것으로 그 효능이 많이 알려져 왔는데, 그럼 에 도 불구하고 그 작용기작은 많이 알려 지 지 않았다.
본 연구에서는 승마가 카테콜라민의 분비에 미치는 영향을 고찰하기 위하여 소의 부신수질 세포를 사용했는데 이는 부신이 발달단계에서 신경계로부터 유래한 이유이기도 하며 성체가 된 이후에는 교감신경계의 일부로 내부에 저장공간 없이 체내의 여러 가지 자극에 따라서 피질에서는코티졸 등의 스트레스성 호르몬을, 수질에서는 카테콜라민과 여러 뉴로펩타이드 등을 혈중으로 분비해 다른 조직과 기관에 영향을 끼치는 좋은 시스템으로 사용되어 왔기 때문이다. 이중 카테콜라민 분비를 측정하기 위해서는 부신수질 부분의 세포만을 선택적으로 분리 배양해서 실험에 사용해야 하는데, 수질세포는 다른 교감신경계 세포에 비해서 쉽게 높은 순도의 세포를 분리할 수 있고 배양하는데 있어서도 안정성을 보이기 때문에 신경계 분비기전과 세포의 전기 생리학적인 연구에 많이 사용되어 오고 있다.
이렇듯 승마는 많은 증상을 치료하는 목적으로 사용되어 왔지만 그것의 실제 어떤 기작을 통하여 작용하는지에 대해서는 그렇게 많은 연구가 이루어지지 못했다. 본 연구에서는 승마의 추출물이 부신 수질 크로마핀 세포에서 카테콜라민 분비를 다른 한약재에 비해 눈에 띄게 저해하는 것을 관찰하고 그 작용기작을 연구하고자 했다. 승마 추출물은 ionotrophic receptoi인 니코틴류 아세틸콜린 수용체 (nAChR)의 작용을 방해함으로써 그 아래에 유발되는 세포 내 칼슘 증가를 억제시켜 최종적인 카테콜라민 분비를 억제하는 것으로 보여지는데 이 저해작용은 아세틸콜린 수용체에 비교적 특이적으로 반응하는 것으로 나타났다.

제안 방법

만들어진 샘플은 고성능 액체 크로마토그래피(HPLC)법을 통해 분비된 카테콜라민의 양을 측정할 수 있는데, 기존에 보고된 조건에서 약간의 변화를 주어 시행하였다.13-15) HPLC BAS-480 (BioAnalytical Systems Inc. IN, USA)을 사용했으며 , 주입 량은 20 ㎕이었으며 , 역상 C₁₈ 칼럼(150 minx 1 mm)을 사용해 분리하고 electro chemical detectorl- 사용해 분리된 카테콜라민을 검출했다. 검출에 사용된 전극은 +770 mV에서 Ag/AgCl reference 전극에 대한 클래식 한 3 mm glassy carbon 전극을 사용했다.
니코틴은 니코틴류 아세틸콜린 수용체에 작용하는 물질 (ligand)중 하나로 알려져 있고 다른 여러 연구에서 아세틸콜린 수용체에 니코틴과 경쟁적으로 또는 비경쟁적으로 결합한다는 보고가 있었기 때문에 a>tritium([3H]) 으로 labeling 된 FH]nicotine이 수용체에 결합하는 것에 승마추출물이 영향을 주는지를 알아보기 위해서 binding assay를 시행했다. 결과는 Fig.
1 N HC₁ 이 50 ㎕ 담겨있는 각각의 튜브에 담고 측정할 때까지 냉장 보관했다. 만들어진 샘플은 고성능 액체 크로마토그래피(HPLC)법을 통해 분비된 카테콜라민의 양을 측정할 수 있는데, 기존에 보고된 조건에서 약간의 변화를 주어 시행하였다.13-15) HPLC BAS-480 (BioAnalytical Systems Inc.
방사성 동위원소인 [3H] nicotine 을 사용한 건강한 세포에서 니코틴 결합을 방해하는지에 대한 실험은 다른 논문에서 사용한 방법을 사용했다.'" 24-well plate에 자란 크로마핀 세포를(5xl()5 ceUs/well) 우선 Locke's 용액으로 두 번 정도 씻어주고 40 nM [3H] 니코틴과 표시된 농도의 승마 추출물을 경쟁시킨 후 상온에서 40분 동안 배양시킨다.
부신 수질 크로마핀세포에서 카테콜라민이 세포외유출이 되는 양상을 좀 더 자세히 관찰하기 위해 HPLC 이외에 단일 세포 수준에서 amperometry를 통해 관찰했다. 추출물을 전처리하고 DMPP 10 μM로 자극했을 때 눈에 띄는 카테콜라민 분비 억제를 HPLC의 경우와 같이 관찰할 수 있었다(Fig.
시작한다. 분비된 카테콜라민의 산화에 의해서 생성된 amperometric 전류는 axopatch 200B amplifier (Axon Instruments Inc., Foster City, CA, USA)와 +650 mV에 전압을 고정해 놓은 voltage-clamp 모드에서 측정했다. Amperometric 신호는 1 kHz에서 low-pass filtered 되고,0.
실험에 사용하였다. 우선 스크리닝 단계에서 여러 생약제가 카테콜라민의 생성을 제어하는 효과를 관찰했고, 다음 단계로 카테콜라민을 분비시키는 중요기작 중 하나인 니코틴류 아세틸콜린 수용체에 특이적으로 작용해서 활성을 유도하는 DMPP(l, l-dimethyl-4-phenylpiperazinium iodide)를 처리해서 승마추출물이 DMPP에 의해서 유도된 카테콜라민 분비증가를 얼마나 억제하는가를 보았다(Fig. 1). 결과에서 볼 수 있듯이 다른 추출물에 비해 승마의 경우 농도에 의한 차이를 보이면서 전 처리된 농도가 증가할수록 카테콜라민 분비가 저해되는 것을 보였고 이를 다시 농도를 더 세분화해서 실험했을 때 역시 같은 현상을 관찰할 수가 있었다(Fig.
전극에 대한 검사 범위를 100nA와 50nA로 지정하고 유속은 1ml/min을 적용했다. 이동상의 조성은 고차증류수 2L 안에 0.55 g heptanesulfonic acid, 0.2 g EDTA, 80 ml ace tonitrile, 12 ml 85% phosphoric acid, 16 ml triethylamine을 넣고 pH를 2.5으로 맞추어 필터링한 후 사용하였다. 보통 노르에피네프린은 2분 2Q초경에 분리되어 나오고, 바로 뒤이어 에피네프린이 2분 35초 정도에, 도파민은 3분 20초 정도에 분리되어 나오게 된다.

대상 데이터

1, 1 -dimethyl-4-phenylpiperazinium iodide (DMPP), brady kinin, veratridine, heptane sulfonic acid(Sodium salt), triethylamine, EDTA 등은 Sigma (St Louis, MO, USA)로부터 구입하였고, HPLC용 이동상을 위해서 사용된 phosphoric acid, acetonitrile은 Merck로부터 구입하였다.
IN, USA)을 사용했으며 , 주입 량은 20 ㎕이었으며 , 역상 C₁₈ 칼럼(150 minx 1 mm)을 사용해 분리하고 electro chemical detectorl- 사용해 분리된 카테콜라민을 검출했다. 검출에 사용된 전극은 +770 mV에서 Ag/AgCl reference 전극에 대한 클래식 한 3 mm glassy carbon 전극을 사용했다. 전극에 대한 검사 범위를 100nA와 50nA로 지정하고 유속은 1ml/min을 적용했다.
본 실험에서는 우선 몇 가지 생약제의 80% 에탄올 추출물을 실험에 사용하였다. 우선 스크리닝 단계에서 여러 생약제가 카테콜라민의 생성을 제어하는 효과를 관찰했고, 다음 단계로 카테콜라민을 분비시키는 중요기작 중 하나인 니코틴류 아세틸콜린 수용체에 특이적으로 작용해서 활성을 유도하는 DMPP(l, l-dimethyl-4-phenylpiperazinium iodide)를 처리해서 승마추출물이 DMPP에 의해서 유도된 카테콜라민 분비증가를 얼마나 억제하는가를 보았다(Fig.
승마 외 다른 한약재의 추출물은 한약 재료상으로부터 구입하여 건재 5 g을 갈아 80% 에탄올로 12시간 동안 추출하고 여과지로 거른 후 80℃로 가열하여 에탄올을 증발시키고 남은 용액을 동결 건조시켜 얻은 분말을 DMSO에 녹여 50 mg/ml으로 만들어 사용했고 남은 양은 냉동 보관하였다.
2% 콜라게네이즈를 20분간 처리한 이후 부신수질 부분만 분리해 수술용 칼로 잘게 자른 후 다시 콜라게네이즈 용액에 1시간 동안 처리하여 가는 망에 걸러 원심분리를 거쳐 수질 세포만 얻었다. 얻어진 세포는 DMEMM12 배지(Life technologies, Inc. Grand Island, NY, USA)에 10% Fetal Bovine Serum(hyclone, Logan, UT, USA), 1% antibiotics (Life Technologies, Inc.)을 첨가한 액체 배지에 부유시키고, 카테콜라민 분비를 측정하기 위해서 24 well plate에 500.000 세포/well 씩 분주해 넣고 95% 공기와 5% CO₂ 배양기에서 2~3일 정도 안정화 시킨 후 실험에 사용했다

데이터처리

, Foster City, CA, USA)와 +650 mV에 전압을 고정해 놓은 voltage-clamp 모드에서 측정했다. Amperometric 신호는 1 kHz에서 low-pass filtered 되고,0.5kHz에서 값을 취하게 되는데 데이터 취득과 분석에는 pCLAMP 8 software (Axon Instruments Inc., Foster City, CA, U.S.A.)를 사용했고 많은 양의 수적인 결과들을 시각화하는 데는 특별히 IGOR software (WaveMetrics)를 사용했다. 모든 용액은 local perfusion system을 사용해서 2 초안에 bathing 용액을 완전히 교환할 수 있도록 했다.
모든 정 량적 인 데 이타는 means±SEM으로 표현했고 ANOVA test를 통해서 유의성을 검증했다.

성능/효과

승마 추출물은 ionotrophic receptoi인 니코틴류 아세틸콜린 수용체 (nAChR)의 작용을 방해함으로써 그 아래에 유발되는 세포 내 칼슘 증가를 억제시켜 최종적인 카테콜라민 분비를 억제하는 것으로 보여지는데 이 저해작용은 아세틸콜린 수용체에 비교적 특이적으로 반응하는 것으로 나타났다.12) 이는 세포내 칼슘유입을 일으킬 수 있는 다른 수용체를 자극했을 때는 이런 저해작용을 보이지 않았고, 또한 아세틸콜린 수용체 바로 아래 단계인 voltage-sensitive 칼슘 채널을 고농도의 K* 을 이용해서 활성화(activation) 시켰을 때도 그렇게 눈에 띄는 저해현상을 관찰할 수 없었던 것으로 보아 추출물의 특이적인 표적(target)은 아세틸콜린 수용체이고 그에 따라 수용체 아래단계의 반응들이 저해를 받고 최종 현상인 카테콜라민 분비를 억제하는 것으로 보여졌다. 거기에 더불어 [3H]니코틴결합에는 농도에 따른 증감을 관찰할 수 없었으므로 승마추출물은 아세틸콜린 수용체에 니코틴과 비경쟁적으로 작용하는 물질을 포함하는 것으로 보인다.
1). 결과에서 볼 수 있듯이 다른 추출물에 비해 승마의 경우 농도에 의한 차이를 보이면서 전 처리된 농도가 증가할수록 카테콜라민 분비가 저해되는 것을 보였고 이를 다시 농도를 더 세분화해서 실험했을 때 역시 같은 현상을 관찰할 수가 있었다(Fig. 2A). 카테콜라민의 분비는 세포내 칼슘 농도가 증가할 때 발생하게 되는데 세포내 칼슘증가를 유도하는 경로로는 아세틸콜린 수용체 아래에 위치하는 voltage-sensitive calcium channel, 식물성 알칼로이드(alkaloid)인 veratridine 에 의해서 비활성이 늦춰져서 칼슘농도를 올리는 voltage sensitive sodium channel18,19)이나 G-protein coupled 수용체인 bradykinin 수용체를 통해 phosphlipase C(PLC)를 경유해 소포체 (Endoplasmic reticulum)로부터 나오는 칼슘에 의한 증가20) 등이 있는데 이들 경로를 각각 활성화 시켰을 때는 그런 저해작용을 관찰 할 수가 없었다(Fig.
승마는 과거로부터 통증을 완화시키고, 특히 폐경이후 나타나는 여성 질환의 증세를 완화시키는 것으로 그 효능이 많이 알려져 왔는데, 그럼 에 도 불구하고 그 작용기작은 많이 알려 지 지 않았다. 본 연구의 결과는 승마 추출물이 선택적으로 니코틴류 아세틸콜린 수용체에 선택적으로 작용하는 것을 고성능 액체크로마토그래피 (HPLC)와 amperometry를 사용해서 보여주고 있다.
본 연구에서는 승마의 추출물이 부신 수질 크로마핀 세포에서 카테콜라민 분비를 다른 한약재에 비해 눈에 띄게 저해하는 것을 관찰하고 그 작용기작을 연구하고자 했다. 승마 추출물은 ionotrophic receptoi인 니코틴류 아세틸콜린 수용체 (nAChR)의 작용을 방해함으로써 그 아래에 유발되는 세포 내 칼슘 증가를 억제시켜 최종적인 카테콜라민 분비를 억제하는 것으로 보여지는데 이 저해작용은 아세틸콜린 수용체에 비교적 특이적으로 반응하는 것으로 나타났다.12) 이는 세포내 칼슘유입을 일으킬 수 있는 다른 수용체를 자극했을 때는 이런 저해작용을 보이지 않았고, 또한 아세틸콜린 수용체 바로 아래 단계인 voltage-sensitive 칼슘 채널을 고농도의 K* 을 이용해서 활성화(activation) 시켰을 때도 그렇게 눈에 띄는 저해현상을 관찰할 수 없었던 것으로 보아 추출물의 특이적인 표적(target)은 아세틸콜린 수용체이고 그에 따라 수용체 아래단계의 반응들이 저해를 받고 최종 현상인 카테콜라민 분비를 억제하는 것으로 보여졌다.

후속연구

실제로 국부마취제등의 물질들이 이런 비경쟁성 저해작용을 보이는 것으로 여러 논문에서 보여주고 있다.%25) 본 연구에서 관찰된 카테콜라민 저해효과와 임상적 기능과의 관계는 이미 알려진 구성 성분26)중 어떤 물질이 실제로 이런 효과를 나타내는지를 동물실험 등을 통하여 밝혀내야 할 것이다. 승마추출물의 특이적인 아세틸콜린 수용체를 경유한 저해효과는 이 한약재가 함유하고 있는 물질이 세포내에서 어떻게 작용하며, 이와 유사한 물질들의 구체적 인 신호전달기 작을 세포수준에서 규명하는데 유용할 것으로 생각된다.
즉, 시냅스에서의 분비량이 불균형을 이룰 경우 조울증(manic depression) 이나 정신분열증 (schizophrenia)과 같은 신경계통의 질병을 유발할 수 있는데, 많은 종류의 정신과 계통의 치료약들이 바로 이 카테콜라민 분비 기전에 작용하는 것으로 알려져 있다.7,8) 이런 이유로 카테콜라민 분비를 조절할 수 있는 물질은 앞에서 언급한 신경계 질환의 치료제로서 개발이 가능한 좋은 후보가 될 수 있을 것이다.

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저자의 다른 논문 :

표제어: PCR

동의어: Packet Collision Rate

용어 설명 출처 목록 (6)

용어 설명: PCR은 세균 특이성이 있는 primer를 이용하여 적은 수의 세균이 있을지라도 쉽게 검출할 수 있는 유용한 방법이며, 이를 이용하여 구강 내 치면세균막이나 타액에서 직접 세균을 검출할 수 있게 되었다[8].

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