환경수 중 크립토스포리디움 오시스트 및 지아디아 시스트 검출의 정확도 및 회수율 향상을 위한 연구 Improvement of Validity and Efficiency for Detection of Cryptosporidium Ocysts and Giardia Cysts in Environmental Water Samples원문보기
환경수 중 크립토스포리디움 및 지아디아 분석방법은 현재 어떤 방법도 만족할만한 민감도, 특이도, 재현성을 인정 받지 못하고 있어, 다양한 형태의 정도관리 및 수행도 평가가 요구되고 있다. 본 연구는 1623방법(USEPA :Method 1623)을 사용해 한강 지표수에 대한 크립토스포리디움 및 지아디아 접종시험과 현장시료 동시분석시험에 기초하여, 환경수 중 이들의 존재여부와 농도를 측정함에 있어 분석결과의 정확도 및 신뢰도, 그리고 회수율에 미치는 영향요인을 검토하였다. 1623방법에 의한 결과, 평균적으로 한강 지표수시료에 존재하는 크립토스포 리디움의 46%와 지아디아의 60%를 검출할 수 있는 것으로 나타났으나, 각각의 회수율 범위가 13-73% 및 28-84%로 변이가 매우 커서 실제 환경 중 두 원생동물의 농도를 결정하기 위해서는 반복측정 및 통계학적 인 접 근이 수반되어 야 할 것으로 나타났다. 또한 IMS (immunomagnetic separation)중 산첨가에 의한 해체·분리과정을 1 회 더 반복함으로써 지표수시료에서의 총회수율의 약 10%를 향상시킬 수 있었으며, flow cytometry로 계수·준비된 (오)시스트((oo)cysts)를 정도관리에 사용할 경우 보다 신뢰할만한 결과를 얻을 수 있었다. 형광항체 및 DAPI염색은 현장시료특성 이나 전 처리과정에 따라 동일하지 않은 형광특징을 보인 바, 접종 된 현장시료 정제액에 대한 염색결과도 참조되어야 하며, 환경시료에는 다양한 비특이물질이 함유되어 있어 DAPI (4',6-diamidino-2-phenylindole) 염색 및 DIC(Differential Interference Contrast)에 의한 내부구조 관찰이 최종 동정기준이 되어야할 것으로 나타났다.
환경수 중 크립토스포리디움 및 지아디아 분석방법은 현재 어떤 방법도 만족할만한 민감도, 특이도, 재현성을 인정 받지 못하고 있어, 다양한 형태의 정도관리 및 수행도 평가가 요구되고 있다. 본 연구는 1623방법(USEPA :Method 1623)을 사용해 한강 지표수에 대한 크립토스포리디움 및 지아디아 접종시험과 현장시료 동시분석시험에 기초하여, 환경수 중 이들의 존재여부와 농도를 측정함에 있어 분석결과의 정확도 및 신뢰도, 그리고 회수율에 미치는 영향요인을 검토하였다. 1623방법에 의한 결과, 평균적으로 한강 지표수시료에 존재하는 크립토스포 리디움의 46%와 지아디아의 60%를 검출할 수 있는 것으로 나타났으나, 각각의 회수율 범위가 13-73% 및 28-84%로 변이가 매우 커서 실제 환경 중 두 원생동물의 농도를 결정하기 위해서는 반복측정 및 통계학적 인 접 근이 수반되어 야 할 것으로 나타났다. 또한 IMS (immunomagnetic separation)중 산첨가에 의한 해체·분리과정을 1 회 더 반복함으로써 지표수시료에서의 총회수율의 약 10%를 향상시킬 수 있었으며, flow cytometry로 계수·준비된 (오)시스트((oo)cysts)를 정도관리에 사용할 경우 보다 신뢰할만한 결과를 얻을 수 있었다. 형광항체 및 DAPI염색은 현장시료특성 이나 전 처리과정에 따라 동일하지 않은 형광특징을 보인 바, 접종 된 현장시료 정제액에 대한 염색결과도 참조되어야 하며, 환경시료에는 다양한 비특이물질이 함유되어 있어 DAPI (4',6-diamidino-2-phenylindole) 염색 및 DIC(Differential Interference Contrast)에 의한 내부구조 관찰이 최종 동정기준이 되어야할 것으로 나타났다.
No currently available methods to monitor pathogenic protozoa, Cryptosporidium and Giardia in environmental water come close to acceptable sensitivity, specificity and reproducibility, and so it has to be accompanied by thorough quality control and performance evaluation to credibly predict the dist...
No currently available methods to monitor pathogenic protozoa, Cryptosporidium and Giardia in environmental water come close to acceptable sensitivity, specificity and reproducibility, and so it has to be accompanied by thorough quality control and performance evaluation to credibly predict the distribution of them. We collected surface water samples from the Han River and spiked our prepared (oo)cysts, determined Matrix Spike recoveries using USEPA Method 1623 and considered what factors influence MS recovery and validity. As a result, average 46% of spiked oocysts and 60% of spike cysts were recovered, but repetitive sampling and statistical approach seemed to be necessary to determine the environmental pollution level of two protozoa as their variation coefficients was so much as 35oio and 26%. And MS recoveries with two acid dissociations during immunomagnetic separation were improved more 10% than that with one dissociations and the use of spiked suspension enumerated by flow cytometry instead of manual preparation enhanced the validity and reliability in spiking tests. Because fluorescence characteristics of (oo)cysts stained on well slides with FITC-labeled monoclonal antibodies and DAPI was not always same, well Elides from spiked field samples were helpful to evaluate the performance of staining. We found many (oo)cyst-like objects with typical fluorescence, not (co)cysts, from the Han River water samples, and then it was concluded that nuclei staining by DAPI (4',6-diamidino-2-phenylindole) and examination by Differential Interference Contrast Microscope should be critical for valid identification.
No currently available methods to monitor pathogenic protozoa, Cryptosporidium and Giardia in environmental water come close to acceptable sensitivity, specificity and reproducibility, and so it has to be accompanied by thorough quality control and performance evaluation to credibly predict the distribution of them. We collected surface water samples from the Han River and spiked our prepared (oo)cysts, determined Matrix Spike recoveries using USEPA Method 1623 and considered what factors influence MS recovery and validity. As a result, average 46% of spiked oocysts and 60% of spike cysts were recovered, but repetitive sampling and statistical approach seemed to be necessary to determine the environmental pollution level of two protozoa as their variation coefficients was so much as 35oio and 26%. And MS recoveries with two acid dissociations during immunomagnetic separation were improved more 10% than that with one dissociations and the use of spiked suspension enumerated by flow cytometry instead of manual preparation enhanced the validity and reliability in spiking tests. Because fluorescence characteristics of (oo)cysts stained on well slides with FITC-labeled monoclonal antibodies and DAPI was not always same, well Elides from spiked field samples were helpful to evaluate the performance of staining. We found many (oo)cyst-like objects with typical fluorescence, not (co)cysts, from the Han River water samples, and then it was concluded that nuclei staining by DAPI (4',6-diamidino-2-phenylindole) and examination by Differential Interference Contrast Microscope should be critical for valid identification.
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문제 정의
따라서 본 연구는 한강 지표수를 비롯한 다양한 물시료에 크립 토스포리디움 및 지아디아를 접종하고 이를 1623방법에 의해 회수하는 시험을 통해, 환경수 중 원생동물 농도 측정시 분석결과 의 정확도와 신뢰도, 회수율에 영향을 미치는 요인들을 검토하였다. 그리고 이에 기초하여 보다 정확하고 신뢰할만한 분석결과를 얻기 위해 필요한 일상적인 정도관리방법과, 보다 향상되고 안정된 회수율을 달성할 수 있는 몇가지 방안을 제시하고자 한다.
따라서 본 연구는 한강 지표수를 비롯한 다양한 물시료에 크립 토스포리디움 및 지아디아를 접종하고 이를 1623방법에 의해 회수하는 시험을 통해, 환경수 중 원생동물 농도 측정시 분석결과 의 정확도와 신뢰도, 회수율에 영향을 미치는 요인들을 검토하였다. 그리고 이에 기초하여 보다 정확하고 신뢰할만한 분석결과를 얻기 위해 필요한 일상적인 정도관리방법과, 보다 향상되고 안정된 회수율을 달성할 수 있는 몇가지 방안을 제시하고자 한다.
제안 방법
첫 번째 방법은 5% Formalin 처리된 (오)시스트 (Waterborne, USA)나 살아있는 (오)시스트(Iowa/H3 isolate, Waterborne, USA)를 구입한 후, 원하는 농도로 희석하고 웰슬라 이드법이나 멤브레인휠터법을 이용해 10 회 반복 계수하여 평균 값을 접종량으로 하였으며, 필요시마다 조제하여 사용하였다. 두 번째 방법은 시판중인 표준접종용액(“Easyseed100", BTF)을 구입하여 사용하였는데, 이는 flow cytometry로 100여 개씩의 오시스 트와 시스트를 계수하여 PBS (phosphate buffer solution)6)] 부유 시킨 후 보존기간 연장 및 취급시 안전을 위해 감마선을 조사한 것이었다. 접종용액은 4~8℃ 상태로 유지보관하며 사용하였다.
Blue filter (excitation wavelength, 490 nm; emission wavelength, 510nmpV 장착된 형광현미경(Zeiss Axioskop)으로 웰 전체를 관찰하였다. 먼저 크립토스포리디움은, Blue filter 하에서 직경 4~6|im의 구형 또는 타원형 모양에 전체가 밝은 초록 (apple-green) 형광빛이되, 테두리가 보다 선명하고, DIC (differential interference contrast)로 보아 내부에 비전형적인 물체 (돌출물, 구멍, 세포 전체를 차지하는 한두 개의 핵, 붉은 형광빛 의 엽록체, 결정체나 포자)를 포함하지 않을 경우, ① 1~4개의 스포로조이트(sporozoites)와 같은 선명한 내부구조를 갖거나(1) ② 스포로조이트인지 확인할 수는 없지만, UV filter (excitation wavelength, 400 nm; emission wavelength, 420 nm)하에서 DAP[ 양성이거나 봉합선(縫合線)이 관찰되는 경우(A) ③내부구조물이 없이 껍데기만 남아있는 속빈 형태(E)로 구분하여 계수하였다.
접종된 현장시료에서의 회수량과 미접종시료 회수량과의 차이로 회수율(%)을 구하여 총회수율(RT)로 하였고 그 상대표준편차 (relative standard deviation; RSD)를 구하여 정밀도(precision)로 하였다. IMS 회수율(R, ms)은 L 2차 해체(dissociation)에서 얻은(오)시스트량으로 계산하되, 2차 해체과정에 의한 회수율도 별도로 기록하였다.
또한 실타래형 카트리지휠터를 사용해 환경시료로부터 탁질들을 포집, 농축한 후 정제수를 첨가하여 10NTU (nephelometric turbidity units), 100 NTU, 1000 NTU 탁도수를 조제하여, 일정량 의 (오)시스트를 주입한 다음, IMS 및 형광염색을 거쳐 최종 회수량을 측정, 탁도별로 IMS 회수율을 비교하였다.
현장시료 관찰에 앞서 먼저 양성대조군 및 음성대조군 슬라이드를 먼저 관찰하여 초록형광 염색정도 및 DAPI에 의한 하늘색 형광정도를 확인하고 그 결과를 사진으로 저장하여 현장시료 관찰시 참고하였다. 또한 현장시료 슬라이드, 접종한 현장시료 슬라이드, IMS 슬라이드에서 발견된 (오)시스트의 염색결과도 상호 비교하였다.
Blue filter (excitation wavelength, 490 nm; emission wavelength, 510nmpV 장착된 형광현미경(Zeiss Axioskop)으로 웰 전체를 관찰하였다. 먼저 크립토스포리디움은, Blue filter 하에서 직경 4~6|im의 구형 또는 타원형 모양에 전체가 밝은 초록 (apple-green) 형광빛이되, 테두리가 보다 선명하고, DIC (differential interference contrast)로 보아 내부에 비전형적인 물체 (돌출물, 구멍, 세포 전체를 차지하는 한두 개의 핵, 붉은 형광빛 의 엽록체, 결정체나 포자)를 포함하지 않을 경우, ① 1~4개의 스포로조이트(sporozoites)와 같은 선명한 내부구조를 갖거나(1) ② 스포로조이트인지 확인할 수는 없지만, UV filter (excitation wavelength, 400 nm; emission wavelength, 420 nm)하에서 DAP[ 양성이거나 봉합선(縫合線)이 관찰되는 경우(A) ③내부구조물이 없이 껍데기만 남아있는 속빈 형태(E)로 구분하여 계수하였다. 지아디아는 테두리가 보다 선명한 초록(apple-green) 형광빛을 띄되, 길이 폭 5~15)im 정도의 럭비공모양 또는 구형인 물체에 대하여, DICS.
미처리된 환경시료에 일정량의 (오)시스트를 주입하여 분석의 전과정을 수행한 후 총회수율을 평가하고 정확도를 결정하는 주요 영향요인들을 검토하였다. 환경시료로는 1998년부터 2002년까지 매월 또는 분기별로 총 30 회에 걸쳐 한강 취수장 또는 지류 천에서 채취된 지표수를 사용하였다.
접종할 (오)시스트용액(spiking suspension)은 2가지 방법으로 준비되었다. 첫 번째 방법은 5% Formalin 처리된 (오)시스트 (Waterborne, USA)나 살아있는 (오)시스트(Iowa/H3 isolate, Waterborne, USA)를 구입한 후, 원하는 농도로 희석하고 웰슬라 이드법이나 멤브레인휠터법을 이용해 10 회 반복 계수하여 평균 값을 접종량으로 하였으며, 필요시마다 조제하여 사용하였다. 두 번째 방법은 시판중인 표준접종용액(“Easyseed100", BTF)을 구입하여 사용하였는데, 이는 flow cytometry로 100여 개씩의 오시스 트와 시스트를 계수하여 PBS (phosphate buffer solution)6)] 부유 시킨 후 보존기간 연장 및 취급시 안전을 위해 감마선을 조사한 것이었다.
한강 지표수시료 20 L를 채취하여 실험실로 운반한 후 먼저 탁도(HACH 2100AN Turbidimeter)를 측정하였다. 시료가 담겨있는 물통에 캡슐휠터(polyether-sulfone 재질, 여과면적 1300 cm2, 공극크기 1.
한편 형광항체염색 및 DAPI 염색 수행도를 측정하기 위해 매 시험마다 표준 (오)시스트용액 및 정제수를 각각 슬라이드에 접종하여 시료와 동일한 형광염색과정을 수행, 양성대조군과 음성 대조군으로써 판정에 참고하였다.
현장시료 1 점당 6 개씩 준비된 웰슬라이드에 대해 형광항체키트(Direct labeling kit, Meridian)를 사용해 제조사의 지시대로 형광 염색하였으며 그 과정은 대략 다음과 같다. HTC-labeled anti-Cryplosporidium & anti-Giardia monoclonal antibody용액과 역염색시약 한방울 씩을 웰슬라이드에 떨어뜨린 후 빛이 차단된 humid chamber에 넣고 37℃ 배양기에서 30 분 동안 배양한 다음, 세척하였다.
현장시료 관찰에 앞서 먼저 양성대조군 및 음성대조군 슬라이드를 먼저 관찰하여 초록형광 염색정도 및 DAPI에 의한 하늘색 형광정도를 확인하고 그 결과를 사진으로 저장하여 현장시료 관찰시 참고하였다. 또한 현장시료 슬라이드, 접종한 현장시료 슬라이드, IMS 슬라이드에서 발견된 (오)시스트의 염색결과도 상호 비교하였다.
대상 데이터
미처리된 환경시료에 일정량의 (오)시스트를 주입하여 분석의 전과정을 수행한 후 총회수율을 평가하고 정확도를 결정하는 주요 영향요인들을 검토하였다. 환경시료로는 1998년부터 2002년까지 매월 또는 분기별로 총 30 회에 걸쳐 한강 취수장 또는 지류 천에서 채취된 지표수를 사용하였다. 초기 8 회의 크립토스포리디 움 분석은 1622방법에 준하였으며, 나머지 22회는 1623방법에 준하여 지아디아까지 분석하였다.
데이터처리
접종된 현장시료에서의 회수량과 미접종시료 회수량과의 차이로 회수율(%)을 구하여 총회수율(RT)로 하였고 그 상대표준편차 (relative standard deviation; RSD)를 구하여 정밀도(precision)로 하였다. IMS 회수율(R, ms)은 L 2차 해체(dissociation)에서 얻은(오)시스트량으로 계산하되, 2차 해체과정에 의한 회수율도 별도로 기록하였다.
이론/모형
환경시료로는 1998년부터 2002년까지 매월 또는 분기별로 총 30 회에 걸쳐 한강 취수장 또는 지류 천에서 채취된 지표수를 사용하였다. 초기 8 회의 크립토스포리디 움 분석은 1622방법에 준하였으며, 나머지 22회는 1623방법에 준하여 지아디아까지 분석하였다. 1623방법은 1622방법을 지아디 아에까지 적용하여 크립토스포리디움과 지아디아를 동시 분석하는 방법으로 두 방법의 분석과정은 완전히 동일하며, 그 상세한 과정은 다음과 같다.
성능/효과
1998 년부터 3 년동안 한강 수계 취수장 및 지류천 등에서 시료를 채취하여, 88-1, 135개의 오시스트와 83T49 개의 시스트를 접종한 후 회수율시험을 수행한 결과, 접종된 오시스트의 평균 46%와 접종된 시스트의 평균 60%가 회수되었다(Table 1). 이때 접종되지 않은 한강 지표수시료에서 발견된 크립토스포리디움 및 지아디아 농도범위는 0~2 oocysts/10 L과 O~38 cysts/10 L이었 으며, 시료 중 두 원생동물의 검출농도와 회수율간에는 통계학적 유의성이 관찰되지 않았다.
54종의 조류를 면역형광항체법에 따라 관찰한 Rodgers 등(22)은 Navicula minima와 같은 규조류가 지아디아와 유사한 형태적 특징과 초록형광을, 남조류의 일종인 Synechococcus elongatiis가 크립토스포리디움과 유사한 초록형광을 보인다고 지적한 바 있다(22). 따라서 FITC 형광염색 및 크 기, 모양의 관찰만으로는 이들 조류를 (오)시스트와 구분짓기 어려웠으며, DIC하에서 관찰되는 내부구조와 DAPI에 의한 핵 염색결과를 최종적인 판정기준으로 할 때, 환경의 실제 오염수준에 대한 정확하고 신뢰할만한 접근이 가능할 것으로 생각되었다. 수중 원생동물 분석방법은 아직도 개발 중이며 계속 보완되고 있다.
이에 비해 flow cytometry로 계수, 준비된 시판접종액은 오 시스트와 시스트가 각각 99± 1개 범위내로 항상 일정하고 각각의 RSD도 항상 2% 이내이었다. 따라서 flow cytometry로 계수된 접종액을 사용할 경우 수행도 평가시 접종용액에 의한 영향을 상당부분 배제함으로 분석과정에 대한 보다 신뢰도 높은 정보를 얻을 수 있으며 특히 분석방법 비교나 실험실간의 정도관리 (inter-laboratory validation)0, ] 보다 적합할 것으로 판 단되었다.
또한 10, 100, 1,000NTU로 조제된 탁도수에 대한 접종시험 에서도 크립토스포리 디움 회수율은 68-107%, 지아디아는 53~94%로(Table 2) 본 증류수에서의 회수율 범위와 크게 다르지 않아 시료 탁도로 인한 회수율 감소는 크지 않다고 여겨진다. 이 환경수 중 크립토스포리디움 오시스트 및 지아디아 시스트 검출 31와 관련하여, Rochelle 등(21)은 탁도 0.
분석된 시료의 탁도는 0.8시3.4NTU의 범위로, 지아디아 회수 율은 탁도와 관련성을 보이지 않은 반면(Fig. 3), 크립토스포리디 움 회수율과는 음의 상관관계 (r = -0.486, P <0.01)를 나타내어 (Fig. 4), 분석 시료의 탁도에 따라 회수율에 영향을 미칠 가능성을 시사하였다. 그러나 분석시료 중 최고 탁도가 13.
다양하게 준비된 슬라이드에서 관찰되는 전형적 . 비전형적 물 체들은 모두 각각 3 개씩의 이미지로 저장, 보관되었는데, 일차 적으로 blue filter하에서의 관찰된 FITC 염색결과를, 두 번째로 DAPI에 의한 핵염색 결과를, 그리고 마지막으로 DIC 관찰결과를 촬영, 보관하였다(Fig. 6, Fig. 7)
IMS 회수율 측정에서는 100%를 초과하는 경우가 간혹 발생하였는데, 이는 접종된 (오)시스트용액에 기인하였다. 실험실에서 희석한 후 웰슬라이드법 또는 멤브레인휠터법으로 10 회 반복계 수하여 준비된 (오)시스트용액은 각 상대표준편차가 8~27%로써 (Table 1), 매회 접종된 (오)시스트량의 95% 신뢰구간을 적용할 경우, IMS 회수율은 최소 3%에서 최대 19%까지의 격차를 내포 하였다. 즉 오시스트 접종량이 88개인 경우, 95% 신뢰구간은 81~95개로, 이때의 IMS 회수율은 98~115%의 범위 안에 존재 하였다.
이로써 크립토스포리디움의 경우, 여과농축 및 추출과정에서 보다 많이 손실되며 탁도에 의한 영향도 더 큼을 알 수 있다(3). 이에 비해, 총회수율이 평균 60%이었던 지아디아는 IMS 이후과정에서 약 27% 정도가 손실되는 것으로 나타나 여과 농축과정보다는 IMS과정이 회수율에 더 큰 영향을 비치는 것으로 예상되었다.
정제수 10 ml에 88~1, 135개의 오시스트와 83~149개의 시스트를 접종하여 IMS과정부터 수행한 결과, 평균 83% (range 55-111%, RSD 18%)의 크립토스포리디움과 평균 73% (range 35~98%, RSD 21%)의 지아디아가 회수되었다. 이러한 결과는 Bukhari 등(9)이 비슷한 방법으로 접종된 증류수로부터 크립토스 포리디움 회수율을 구한 결과인 68~83%와 대체로 비슷한 수준 이었다.
한편 flow cytometry로 계수된 (오)시스트를 접종한 IMS에서 HCI 첨가에 의한 해체단계를 1회 수행한 경우의 크립토스포리 디움 회수율은 평균 71%이었으며, 해체과정을 반복함으로써 회수율을 평균 6% (range 1-28%) 높일 수 있었다(Table 3). 지아 디아 또한 1차 해체에 의한 평균회수율은 70%이지만, 2차 해체를 추가함으로써 평균 5% (range 1~13%)를 더 회수할 수 있었다. 이러한 회수율 향상은 현장시료 분석에서도 확인되었는 바, 회수된 총량의 약 10%가 2차 해체로 만들어진 슬라이드에서 관찰되었다.
크립토스포리디움 총회수율이 평균 46%이고 IMS 정제 이후 과정의 회수율이 평균 83%로 결과되었으므로, 여과농축과정에서손실은 약 37%, IMS 정제 이후과정에서의 손실은 17% 수준으로 추정된다. 이로써 크립토스포리디움의 경우, 여과농축 및 추출과정에서 보다 많이 손실되며 탁도에 의한 영향도 더 큼을 알 수 있다(3).
이러한 결과는 Bukhari 등(9)이 비슷한 방법으로 접종된 증류수로부터 크립토스 포리디움 회수율을 구한 결과인 68~83%와 대체로 비슷한 수준 이었다. 특히 이번 결과는 IMS kit, 0.1 N HCl 등 모든 시약이 각 시험마다 새롭게 조제 또는 구입되었고 시험시기도 3 년에 걸쳐 다양함에도 불구하고 상대표준편차가 약 20% 정도로 나타 나, IMS (Dynabeads IMS kit 사용)에 의한 (오)시스트 회수가 매우 안정적임을 보여주었다.
한편 flow cytometry로 계수된 (오)시스트를 접종한 IMS에서 HCI 첨가에 의한 해체단계를 1회 수행한 경우의 크립토스포리 디움 회수율은 평균 71%이었으며, 해체과정을 반복함으로써 회수율을 평균 6% (range 1-28%) 높일 수 있었다(Table 3). 지아 디아 또한 1차 해체에 의한 평균회수율은 70%이지만, 2차 해체를 추가함으로써 평균 5% (range 1~13%)를 더 회수할 수 있었다.
후속연구
4), 분석 시료의 탁도에 따라 회수율에 영향을 미칠 가능성을 시사하였다. 그러나 분석시료 중 최고 탁도가 13.4 NTU에 불과해 앞으로 고탁도시료에 대한 데이터가 좀더 축적, 보완되어야 할 것이다.
2). 이러한 결과에 기초할 때, 환경수 중 두 원생동물, 특히 크립토스포리디움의 분포에 대한 신뢰할 만한 정보를 얻기 위해서는, 동일 지점에 대한 반복 측정과 통계학적인 해석을 병행하여야 할 것으로 판단되었다.
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