선택한 단어 수는 입니다.
최소 단어 이상 선택하여야 합니다.
최소 단어 이상 선택하여야 합니다.
선택한 단어 수는 30입니다.
최대 10 단어까지만 선택 가능합니다.
최대 10 단어까지만 선택 가능합니다.
문제 정의
- 따라서 본 연구는 한강 지표수를 비롯한 다양한 물시료에 크립 토스포리디움 및 지아디아를 접종하고 이를 1623방법에 의해 회수하는 시험을 통해, 환경수 중 원생동물 농도 측정시 분석결과 의 정확도와 신뢰도, 회수율에 영향을 미치는 요인들을 검토하였다. 그리고 이에 기초하여 보다 정확하고 신뢰할만한 분석결과를 얻기 위해 필요한 일상적인 정도관리방법과, 보다 향상되고 안정된 회수율을 달성할 수 있는 몇가지 방안을 제시하고자 한다.
- 따라서 본 연구는 한강 지표수를 비롯한 다양한 물시료에 크립 토스포리디움 및 지아디아를 접종하고 이를 1623방법에 의해 회수하는 시험을 통해, 환경수 중 원생동물 농도 측정시 분석결과 의 정확도와 신뢰도, 회수율에 영향을 미치는 요인들을 검토하였다. 그리고 이에 기초하여 보다 정확하고 신뢰할만한 분석결과를 얻기 위해 필요한 일상적인 정도관리방법과, 보다 향상되고 안정된 회수율을 달성할 수 있는 몇가지 방안을 제시하고자 한다.
제안 방법
- 첫 번째 방법은 5% Formalin 처리된 (오)시스트 (Waterborne, USA)나 살아있는 (오)시스트(Iowa/H3 isolate, Waterborne, USA)를 구입한 후, 원하는 농도로 희석하고 웰슬라 이드법이나 멤브레인휠터법을 이용해 10 회 반복 계수하여 평균 값을 접종량으로 하였으며, 필요시마다 조제하여 사용하였다. 두 번째 방법은 시판중인 표준접종용액(“Easyseed100", BTF)을 구입하여 사용하였는데, 이는 flow cytometry로 100여 개씩의 오시스 트와 시스트를 계수하여 PBS (phosphate buffer solution)6)] 부유 시킨 후 보존기간 연장 및 취급시 안전을 위해 감마선을 조사한 것이었다. 접종용액은 4~8℃ 상태로 유지보관하며 사용하였다.
- Blue filter (excitation wavelength, 490 nm; emission wavelength, 510nmpV 장착된 형광현미경(Zeiss Axioskop)으로 웰 전체를 관찰하였다. 먼저 크립토스포리디움은, Blue filter 하에서 직경 4~6|im의 구형 또는 타원형 모양에 전체가 밝은 초록 (apple-green) 형광빛이되, 테두리가 보다 선명하고, DIC (differential interference contrast)로 보아 내부에 비전형적인 물체 (돌출물, 구멍, 세포 전체를 차지하는 한두 개의 핵, 붉은 형광빛 의 엽록체, 결정체나 포자)를 포함하지 않을 경우, ① 1~4개의 스포로조이트(sporozoites)와 같은 선명한 내부구조를 갖거나(1) ② 스포로조이트인지 확인할 수는 없지만, UV filter (excitation wavelength, 400 nm; emission wavelength, 420 nm)하에서 DAP[ 양성이거나 봉합선(縫合線)이 관찰되는 경우(A) ③내부구조물이 없이 껍데기만 남아있는 속빈 형태(E)로 구분하여 계수하였다.
- 접종된 현장시료에서의 회수량과 미접종시료 회수량과의 차이로 회수율(%)을 구하여 총회수율(RT)로 하였고 그 상대표준편차 (relative standard deviation; RSD)를 구하여 정밀도(precision)로 하였다. IMS 회수율(R, ms)은 L 2차 해체(dissociation)에서 얻은(오)시스트량으로 계산하되, 2차 해체과정에 의한 회수율도 별도로 기록하였다.
- 또한 실타래형 카트리지휠터를 사용해 환경시료로부터 탁질들을 포집, 농축한 후 정제수를 첨가하여 10NTU (nephelometric turbidity units), 100 NTU, 1000 NTU 탁도수를 조제하여, 일정량 의 (오)시스트를 주입한 다음, IMS 및 형광염색을 거쳐 최종 회수량을 측정, 탁도별로 IMS 회수율을 비교하였다.
- 현장시료 관찰에 앞서 먼저 양성대조군 및 음성대조군 슬라이드를 먼저 관찰하여 초록형광 염색정도 및 DAPI에 의한 하늘색 형광정도를 확인하고 그 결과를 사진으로 저장하여 현장시료 관찰시 참고하였다. 또한 현장시료 슬라이드, 접종한 현장시료 슬라이드, IMS 슬라이드에서 발견된 (오)시스트의 염색결과도 상호 비교하였다.
- Blue filter (excitation wavelength, 490 nm; emission wavelength, 510nmpV 장착된 형광현미경(Zeiss Axioskop)으로 웰 전체를 관찰하였다. 먼저 크립토스포리디움은, Blue filter 하에서 직경 4~6|im의 구형 또는 타원형 모양에 전체가 밝은 초록 (apple-green) 형광빛이되, 테두리가 보다 선명하고, DIC (differential interference contrast)로 보아 내부에 비전형적인 물체 (돌출물, 구멍, 세포 전체를 차지하는 한두 개의 핵, 붉은 형광빛 의 엽록체, 결정체나 포자)를 포함하지 않을 경우, ① 1~4개의 스포로조이트(sporozoites)와 같은 선명한 내부구조를 갖거나(1) ② 스포로조이트인지 확인할 수는 없지만, UV filter (excitation wavelength, 400 nm; emission wavelength, 420 nm)하에서 DAP[ 양성이거나 봉합선(縫合線)이 관찰되는 경우(A) ③내부구조물이 없이 껍데기만 남아있는 속빈 형태(E)로 구분하여 계수하였다. 지아디아는 테두리가 보다 선명한 초록(apple-green) 형광빛을 띄되, 길이 폭 5~15)im 정도의 럭비공모양 또는 구형인 물체에 대하여, DICS.
- 미처리된 환경시료에 일정량의 (오)시스트를 주입하여 분석의 전과정을 수행한 후 총회수율을 평가하고 정확도를 결정하는 주요 영향요인들을 검토하였다. 환경시료로는 1998년부터 2002년까지 매월 또는 분기별로 총 30 회에 걸쳐 한강 취수장 또는 지류 천에서 채취된 지표수를 사용하였다.
- 접종할 (오)시스트용액(spiking suspension)은 2가지 방법으로 준비되었다. 첫 번째 방법은 5% Formalin 처리된 (오)시스트 (Waterborne, USA)나 살아있는 (오)시스트(Iowa/H3 isolate, Waterborne, USA)를 구입한 후, 원하는 농도로 희석하고 웰슬라 이드법이나 멤브레인휠터법을 이용해 10 회 반복 계수하여 평균 값을 접종량으로 하였으며, 필요시마다 조제하여 사용하였다. 두 번째 방법은 시판중인 표준접종용액(“Easyseed100", BTF)을 구입하여 사용하였는데, 이는 flow cytometry로 100여 개씩의 오시스 트와 시스트를 계수하여 PBS (phosphate buffer solution)6)] 부유 시킨 후 보존기간 연장 및 취급시 안전을 위해 감마선을 조사한 것이었다.
- 한강 지표수시료 20 L를 채취하여 실험실로 운반한 후 먼저 탁도(HACH 2100AN Turbidimeter)를 측정하였다. 시료가 담겨있는 물통에 캡슐휠터(polyether-sulfone 재질, 여과면적 1300 cm2, 공극크기 1.
- 한편 형광항체염색 및 DAPI 염색 수행도를 측정하기 위해 매 시험마다 표준 (오)시스트용액 및 정제수를 각각 슬라이드에 접종하여 시료와 동일한 형광염색과정을 수행, 양성대조군과 음성 대조군으로써 판정에 참고하였다.
- 현장시료 1 점당 6 개씩 준비된 웰슬라이드에 대해 형광항체키트(Direct labeling kit, Meridian)를 사용해 제조사의 지시대로 형광 염색하였으며 그 과정은 대략 다음과 같다. HTC-labeled anti-Cryplosporidium & anti-Giardia monoclonal antibody용액과 역염색시약 한방울 씩을 웰슬라이드에 떨어뜨린 후 빛이 차단된 humid chamber에 넣고 37℃ 배양기에서 30 분 동안 배양한 다음, 세척하였다.
- 현장시료 관찰에 앞서 먼저 양성대조군 및 음성대조군 슬라이드를 먼저 관찰하여 초록형광 염색정도 및 DAPI에 의한 하늘색 형광정도를 확인하고 그 결과를 사진으로 저장하여 현장시료 관찰시 참고하였다. 또한 현장시료 슬라이드, 접종한 현장시료 슬라이드, IMS 슬라이드에서 발견된 (오)시스트의 염색결과도 상호 비교하였다.
대상 데이터
- 미처리된 환경시료에 일정량의 (오)시스트를 주입하여 분석의 전과정을 수행한 후 총회수율을 평가하고 정확도를 결정하는 주요 영향요인들을 검토하였다. 환경시료로는 1998년부터 2002년까지 매월 또는 분기별로 총 30 회에 걸쳐 한강 취수장 또는 지류 천에서 채취된 지표수를 사용하였다. 초기 8 회의 크립토스포리디 움 분석은 1622방법에 준하였으며, 나머지 22회는 1623방법에 준하여 지아디아까지 분석하였다.
데이터처리
- 접종된 현장시료에서의 회수량과 미접종시료 회수량과의 차이로 회수율(%)을 구하여 총회수율(RT)로 하였고 그 상대표준편차 (relative standard deviation; RSD)를 구하여 정밀도(precision)로 하였다. IMS 회수율(R, ms)은 L 2차 해체(dissociation)에서 얻은(오)시스트량으로 계산하되, 2차 해체과정에 의한 회수율도 별도로 기록하였다.
이론/모형
- 환경시료로는 1998년부터 2002년까지 매월 또는 분기별로 총 30 회에 걸쳐 한강 취수장 또는 지류 천에서 채취된 지표수를 사용하였다. 초기 8 회의 크립토스포리디 움 분석은 1622방법에 준하였으며, 나머지 22회는 1623방법에 준하여 지아디아까지 분석하였다. 1623방법은 1622방법을 지아디 아에까지 적용하여 크립토스포리디움과 지아디아를 동시 분석하는 방법으로 두 방법의 분석과정은 완전히 동일하며, 그 상세한 과정은 다음과 같다.
성능/효과
- 1998 년부터 3 년동안 한강 수계 취수장 및 지류천 등에서 시료를 채취하여, 88-1, 135개의 오시스트와 83T49 개의 시스트를 접종한 후 회수율시험을 수행한 결과, 접종된 오시스트의 평균 46%와 접종된 시스트의 평균 60%가 회수되었다(Table 1). 이때 접종되지 않은 한강 지표수시료에서 발견된 크립토스포리디움 및 지아디아 농도범위는 0~2 oocysts/10 L과 O~38 cysts/10 L이었 으며, 시료 중 두 원생동물의 검출농도와 회수율간에는 통계학적 유의성이 관찰되지 않았다.
- 54종의 조류를 면역형광항체법에 따라 관찰한 Rodgers 등(22)은 Navicula minima와 같은 규조류가 지아디아와 유사한 형태적 특징과 초록형광을, 남조류의 일종인 Synechococcus elongatiis가 크립토스포리디움과 유사한 초록형광을 보인다고 지적한 바 있다(22). 따라서 FITC 형광염색 및 크 기, 모양의 관찰만으로는 이들 조류를 (오)시스트와 구분짓기 어려웠으며, DIC하에서 관찰되는 내부구조와 DAPI에 의한 핵 염색결과를 최종적인 판정기준으로 할 때, 환경의 실제 오염수준에 대한 정확하고 신뢰할만한 접근이 가능할 것으로 생각되었다. 수중 원생동물 분석방법은 아직도 개발 중이며 계속 보완되고 있다.
- 이에 비해 flow cytometry로 계수, 준비된 시판접종액은 오 시스트와 시스트가 각각 99± 1개 범위내로 항상 일정하고 각각의 RSD도 항상 2% 이내이었다. 따라서 flow cytometry로 계수된 접종액을 사용할 경우 수행도 평가시 접종용액에 의한 영향을 상당부분 배제함으로 분석과정에 대한 보다 신뢰도 높은 정보를 얻을 수 있으며 특히 분석방법 비교나 실험실간의 정도관리 (inter-laboratory validation)0, ] 보다 적합할 것으로 판 단되었다.
- 또한 10, 100, 1,000NTU로 조제된 탁도수에 대한 접종시험 에서도 크립토스포리 디움 회수율은 68-107%, 지아디아는 53~94%로(Table 2) 본 증류수에서의 회수율 범위와 크게 다르지 않아 시료 탁도로 인한 회수율 감소는 크지 않다고 여겨진다. 이 환경수 중 크립토스포리디움 오시스트 및 지아디아 시스트 검출 31와 관련하여, Rochelle 등(21)은 탁도 0.
- 분석된 시료의 탁도는 0.8시3.4NTU의 범위로, 지아디아 회수 율은 탁도와 관련성을 보이지 않은 반면(Fig. 3), 크립토스포리디 움 회수율과는 음의 상관관계 (r = -0.486, P <0.01)를 나타내어 (Fig. 4), 분석 시료의 탁도에 따라 회수율에 영향을 미칠 가능성을 시사하였다. 그러나 분석시료 중 최고 탁도가 13.
- 다양하게 준비된 슬라이드에서 관찰되는 전형적 . 비전형적 물 체들은 모두 각각 3 개씩의 이미지로 저장, 보관되었는데, 일차 적으로 blue filter하에서의 관찰된 FITC 염색결과를, 두 번째로 DAPI에 의한 핵염색 결과를, 그리고 마지막으로 DIC 관찰결과를 촬영, 보관하였다(Fig. 6, Fig. 7)
- IMS 회수율 측정에서는 100%를 초과하는 경우가 간혹 발생하였는데, 이는 접종된 (오)시스트용액에 기인하였다. 실험실에서 희석한 후 웰슬라이드법 또는 멤브레인휠터법으로 10 회 반복계 수하여 준비된 (오)시스트용액은 각 상대표준편차가 8~27%로써 (Table 1), 매회 접종된 (오)시스트량의 95% 신뢰구간을 적용할 경우, IMS 회수율은 최소 3%에서 최대 19%까지의 격차를 내포 하였다. 즉 오시스트 접종량이 88개인 경우, 95% 신뢰구간은 81~95개로, 이때의 IMS 회수율은 98~115%의 범위 안에 존재 하였다.
- 이로써 크립토스포리디움의 경우, 여과농축 및 추출과정에서 보다 많이 손실되며 탁도에 의한 영향도 더 큼을 알 수 있다(3). 이에 비해, 총회수율이 평균 60%이었던 지아디아는 IMS 이후과정에서 약 27% 정도가 손실되는 것으로 나타나 여과 농축과정보다는 IMS과정이 회수율에 더 큰 영향을 비치는 것으로 예상되었다.
- 정제수 10 ml에 88~1, 135개의 오시스트와 83~149개의 시스트를 접종하여 IMS과정부터 수행한 결과, 평균 83% (range 55-111%, RSD 18%)의 크립토스포리디움과 평균 73% (range 35~98%, RSD 21%)의 지아디아가 회수되었다. 이러한 결과는 Bukhari 등(9)이 비슷한 방법으로 접종된 증류수로부터 크립토스 포리디움 회수율을 구한 결과인 68~83%와 대체로 비슷한 수준 이었다.
- 한편 flow cytometry로 계수된 (오)시스트를 접종한 IMS에서 HCI 첨가에 의한 해체단계를 1회 수행한 경우의 크립토스포리 디움 회수율은 평균 71%이었으며, 해체과정을 반복함으로써 회수율을 평균 6% (range 1-28%) 높일 수 있었다(Table 3). 지아 디아 또한 1차 해체에 의한 평균회수율은 70%이지만, 2차 해체를 추가함으로써 평균 5% (range 1~13%)를 더 회수할 수 있었다. 이러한 회수율 향상은 현장시료 분석에서도 확인되었는 바, 회수된 총량의 약 10%가 2차 해체로 만들어진 슬라이드에서 관찰되었다.
- 크립토스포리디움 총회수율이 평균 46%이고 IMS 정제 이후 과정의 회수율이 평균 83%로 결과되었으므로, 여과농축과정에서손실은 약 37%, IMS 정제 이후과정에서의 손실은 17% 수준으로 추정된다. 이로써 크립토스포리디움의 경우, 여과농축 및 추출과정에서 보다 많이 손실되며 탁도에 의한 영향도 더 큼을 알 수 있다(3).
- 이러한 결과는 Bukhari 등(9)이 비슷한 방법으로 접종된 증류수로부터 크립토스 포리디움 회수율을 구한 결과인 68~83%와 대체로 비슷한 수준 이었다. 특히 이번 결과는 IMS kit, 0.1 N HCl 등 모든 시약이 각 시험마다 새롭게 조제 또는 구입되었고 시험시기도 3 년에 걸쳐 다양함에도 불구하고 상대표준편차가 약 20% 정도로 나타 나, IMS (Dynabeads IMS kit 사용)에 의한 (오)시스트 회수가 매우 안정적임을 보여주었다.
- 한편 flow cytometry로 계수된 (오)시스트를 접종한 IMS에서 HCI 첨가에 의한 해체단계를 1회 수행한 경우의 크립토스포리 디움 회수율은 평균 71%이었으며, 해체과정을 반복함으로써 회수율을 평균 6% (range 1-28%) 높일 수 있었다(Table 3). 지아 디아 또한 1차 해체에 의한 평균회수율은 70%이지만, 2차 해체를 추가함으로써 평균 5% (range 1~13%)를 더 회수할 수 있었다.
후속연구
- 4), 분석 시료의 탁도에 따라 회수율에 영향을 미칠 가능성을 시사하였다. 그러나 분석시료 중 최고 탁도가 13.4 NTU에 불과해 앞으로 고탁도시료에 대한 데이터가 좀더 축적, 보완되어야 할 것이다.
- 2). 이러한 결과에 기초할 때, 환경수 중 두 원생동물, 특히 크립토스포리디움의 분포에 대한 신뢰할 만한 정보를 얻기 위해서는, 동일 지점에 대한 반복 측정과 통계학적인 해석을 병행하여야 할 것으로 판단되었다.
※ AI-Helper는 부적절한 답변을 할 수 있습니다.