선택한 단어 수는 입니다.
최소 단어 이상 선택하여야 합니다.
최소 단어 이상 선택하여야 합니다.
선택한 단어 수는 30입니다.
최대 10 단어까지만 선택 가능합니다.
최대 10 단어까지만 선택 가능합니다.
문제 정의
- 본 연구에서는 맥아당을 기질로써 T. caldophilus 유래의 trehalose synthase을 이용한 트레할로스 생산에 있어 효소 반응조건들을 최적화하여 트레할로스 생산을 극대화하기 위한 방법을 제시하였다.
- 트레할로스 대량 생산을 위한 효소 반응 최적화를 위해 trehalose synthase의 반응 기질농도의 효과를 조사하여 보았다. 부분 정제된 효소액을 사용하여 맥아당으로부터 트레할로스생산을 수행하였다.
- 트레할로스 생산에 있어서 효소반응 조건 최적화를 위해 trehalose synthase의 반응 온도의 효과를 조사하여 보았다. 부분 정제된 효소액을 사용하여 맥아당으로부터 트레할로스 생산을 수행하였다.
- 효소 반응조건 최적화를 위해 trehalose synthase의 양에 따른 효과를 조사하여 보았다. 부분 정제된 효소액을 사용하여 맥아당으로부터 트레할로스 생산을 수행하였다.
제안 방법
- Silica gel column을 이용하여 trehalose synthase 반응산물의 분리를 시도하였다. 분리에 사용한 silica gel resin는 200 - 400 mesh, pore volume 0.
- Trehalose synthase의 활성은 1 % 맥아당을 기질로써 63 °C 에서 1시간 동안 반응하고 100°C에서 10분간 끓여서 반응을 정지시킨 후 Bio-LC(bio-liquid chromatography, Dionex CO., USA) 분석을 통해 확인하였으며, 효소 1 U는 1분당 맥아당으로부터 전환되는 트레할로스 1.0 llmol 수로 정하였다.
- 0, 효소액(21 U/g substrate)이 첨가된 반응액을 45°C에서 24 시간 동안 반응시켰다. 온도별 반응을 위해 1 g/1 맥아당, 2。mM 인산화칼륨 완충 용액 pH 7.0, 효소액(18 U/g substrate)이 첨가된 반응액을 저온에서 고온까지 25, 40, 60°C 에서 24 시간 동안 반응시켰다. 효소양에 따른 반응을 위해 1 g/1 맥아당, 20 mM 인산화칼륨 완충 용액 pH 7.
- 0, 효소액이 첨가된 반응액을 25 - 90°C에서 1 시간 동안 반응시켰다. 미량원소들이 미치는 효과를 조사하기 위해 1 % 맥아당, 20 mM 인산화칼륨 완충 용액 (pH 7.0), 10, 1 mM metal ions, 효소액이 첨가된 반응액을 63°C에서 1 시간 동안 반응시켰다. 기질농도별 반응을 위해 50 - 0.
- 보았다. 부분 정제된 효소액을 사용하여 맥아당으로부터 트레할로스생산을 수행하였다. 그 결과 Fig.
- 보았다. 부분 정제된 효소액을 사용하여 맥아당으로부터 트레할로스생산을 수행하였다. 그 결과 Fig.
- 시료는 컬럼 총 부피의 1 %를 loading하였으며 당 농도는 최고 30 % (w/v)까지 이용하였다. 분획된 시료의 분석은 총당의 분석에 phenol-sulfuric acid 법과 분리 능의 확인에 박막크로마토그 래프 (propanol: acetone: acetic acid = 2:2:1)를 이용하였다. 분리에 사용된 당 혼합물은 트레할로스 43 %, 맥아당 42 %, 글루코오스 15 %의 합성 혼합물을 사용하였다.
- 앞서서 효소반응의 최적화된 조건 아래 효소반응의 크기를 증대시키기 위해 기질의 농도, 온도, 효소의 양을 고려하여 온도 40°C, 효소 양은 26 U/g, 맥아당의 초기농도는 2.5, 10 g/1 로 5-L bioreactor에서 2-L 반응액으로 수행하였다. 그 결과 시간에 따른 반응산물 조성을 보면 트레할로스의 생산수율은 기질 농도 2.
- 0, 효소액 10, 25, 50 U/g substrate 이 첨가된 반응액을 40°C에서 24 시간 동안 반응시켰다. 일정시간 간격으로 반응물을 회수하여 i(xrc에서 io분간 끓임으로써 반응을 정지시킨 후 Bio-LC분석을 통하여 정량화 하였다.
- 재조합 trehalose synthase 반응을 통하여 트레할로스를 생산하였고, 그 반응조건의 특성들을 조사하고 트레할로스를 정제하였다. 초기 효소반응 조건으로 최적화된 45°C, pH 7.
- 초기 효소반응 조건으로 최적화된 45°C, pH 7.0 를 기본으로 하여 트레할로스 생산을 극대화하기 위해 반응조건들을 장시간 동안 수행하여 조사하였다. 기질농도는 저농도인 1 g/1 에서 가장 높은 65.
- 트레할로스 합성 유전자는 2895 base pairs로 구성되어 있으며, 965 아미노산 잔기의 polypeptide로 암호화 되어있다. 트레할로스 생산균주는 유도성 프로모터 체계에 의해 trehalose synthase 발현조절이 가능한 pTSTRC를 E. coli MV 1184에 형질 전환시킨 재조합 대장균을 사용하였다<26). 재조합된 E.
- 트레할로스 생산을 위한 효소반응에 영향을 미치는 초기조건들을 최적화하기 위해 부분 정제(열처리)된 효소액을 사용하여 맥아당으로부터 trehalose synthase 반응을 수행하였다. Fig.
- 효소의 초기 반응 pH를 조사하기 위해 1 % 맥아당, 20 mM 완중 용액 pH 4 - 11 (Sodium acetate buffer 4~5, Potassium phosphate buffer 6~8, CAPS buffer 9~11), 효소액이 첨가된 반응액을 온도 63 °C 에서 1 시간 동안 반응시켰다. 효소반응 온도 조사를 위해 1 % 맥아당, 20 mM 인산화칼륨 완충 용액 pH 7.0, 효소액이 첨가된 반응액을 25 - 90°C에서 1 시간 동안 반응시켰다. 미량원소들이 미치는 효과를 조사하기 위해 1 % 맥아당, 20 mM 인산화칼륨 완충 용액 (pH 7.
- 0, 효소액(18 U/g substrate)이 첨가된 반응액을 저온에서 고온까지 25, 40, 60°C 에서 24 시간 동안 반응시켰다. 효소양에 따른 반응을 위해 1 g/1 맥아당, 20 mM 인산화칼륨 완충 용액 pH 7.0, 효소액 10, 25, 50 U/g substrate 이 첨가된 반응액을 40°C에서 24 시간 동안 반응시켰다. 일정시간 간격으로 반응물을 회수하여 i(xrc에서 io분간 끓임으로써 반응을 정지시킨 후 Bio-LC분석을 통하여 정량화 하였다.
- 효소의 초기 반응 pH를 조사하기 위해 1 % 맥아당, 20 mM 완중 용액 pH 4 - 11 (Sodium acetate buffer 4~5, Potassium phosphate buffer 6~8, CAPS buffer 9~11), 효소액이 첨가된 반응액을 온도 63 °C 에서 1 시간 동안 반응시켰다. 효소반응 온도 조사를 위해 1 % 맥아당, 20 mM 인산화칼륨 완충 용액 pH 7.
대상 데이터
- 사용하였다. Silica gel resin은 Aldrich chemical사 것을 구입하였다. 그 밖의 칼슘, 구리, 마그네슘, 망간, 아연, 철 등과 같은 화학물질 및 시약은 일급시약을 사용하였다.
- 맥아당과 트레할로스를 비롯한 모든 당들은 Sigma사의 것을 사용하였다. Silica gel resin은 Aldrich chemical사 것을 구입하였다.
- 본 실험에서 사용한 효소는 Thermus caldophilus GK24 유래의 trehalose synthase 유전자가 E. coli MV1184에서 클로닝되고 발현된 것이다. 트레할로스 합성 유전자는 2895 base pairs로 구성되어 있으며, 965 아미노산 잔기의 polypeptide로 암호화 되어있다.
- 분획된 시료의 분석은 총당의 분석에 phenol-sulfuric acid 법과 분리 능의 확인에 박막크로마토그 래프 (propanol: acetone: acetic acid = 2:2:1)를 이용하였다. 분리에 사용된 당 혼합물은 트레할로스 43 %, 맥아당 42 %, 글루코오스 15 %의 합성 혼합물을 사용하였다. 분리 유속은 분당 2 ml 이하가 적당함을 알 수 있었다.
이론/모형
- 이동상 용매는 200 mM NaOH, 300 mM NaOAc + 100 mM NaOH, 压0의 세 가지 혼합용액으로 분당 1 ml 유속으로 전개된다. 본 효소반응에 의해 생성된 트레할로스, 맥아당, 글루코오스를 분리하여 분획별 확인을 위하여 TLC분석법을 이용하였다. TLC plate 로는 silica gel 60 TLC(Merck, 20x20 cm aluminium sheet)를 사용하였으며, 이 plate 에 효소반응산물 1 111을 점적하여 propanol : acetone : acetic acid (2 : 2 : 1) 혼합용매로 전개하고 건조한 후 발색제 (methanol 용매에 2 % 황산)를 뿌려 100。(:에서 가열하여 발색시켰다.
성능/효과
- 그 결과 본 효소 반응의 가장 중요한 인자 중 하나는 온도임을 재차 검증할 수 있었다. Fig. 5 와 Table 2에서 나타내는 바와 같이 저온인 25°C에서 반응 안정성 및 트레할로스로의 전환률이 증가함을 알 수 있으며 고온의 경우 초기 반응 속도는 좋으나 시간이 지날수록 트레할로스로의 전환보다 글루코오스로의 생성률이 증가함을 알 수 있었다(Fig. 5). 반응 온도 25笆와 40°C 에서 최종 트레할로스의 양은 69.
- 부분 정제된 효소액을 사용하여 맥아당으로부터 트레할로스 생산을 수행하였다. 그 결과 Fig. 6 와 Table 3에서 나타내는 바와 같이 효소 양이 증가할수록 초기 반응 속도는 증가하나 최종 생산수율은 10, 25, 50 U/g 의 효소 양에 따라 각각 62.3, 62.3, 59 %로 유사하게 나타났다. 10 U/g 과 50 U/g의 효소 양으로 반응한 결과를 비교하여 볼 때 최종 트레할로스 생산수율에 이르는 시간이 6배나 앞당겨 짐을 알 수 있었다{Fig.
- 부분 정제된 효소액을 사용하여 맥아당으로부터 트레할로스 생산을 수행하였다. 그 결과 본 효소 반응의 가장 중요한 인자 중 하나는 온도임을 재차 검증할 수 있었다. Fig.
- 0)와 같은 양상을 나타내었다(23). 또한 트레할로스 생산에 영향을 미치는 초기 효소 반응에 있어 최적 온도는 45°C이고 반응 온도 20 - 65 °C 까지는 안정하였다(Fig. 2). 이 결과는 T.
- co/i로부터 trehalose synthase 생산에 대한 전형적인 시간별 양상을 나타낸 것이다. 세포의 성장은 시간에 따라 증가하였으며 배양 24시간에서 최대를 나타내었고, 세포 내 효소 활성은 배양 11시간, IPTG 유도물질 첨가 후 7시간에서 가장 높은 활성(약 2.7 U/ml)을 나타내었다. 그 후 효소 활성은 감소하기 시작하였다.
- 9 % 로 많은 차이를 나타내었다{Table 2). 초기 효소 반응에서는 65°C까지는 트레할로스 생성량에 차이가 없었으나 장시간 고온에서 반응 할 경우 글루코오스 생성량이 증가하게 되어 트레할로스의 양이 상대적으로 감소하게 됨을 알 수 있었다. 트레할로스 생산에 있어 산업적으로 이용하기 위해서는 비교적 안정하고 오염 우려를 고려해 중온인 40°C에서의 반응이 효율적인 것으로 사료된다.
- 5 - 40 %) 크게 영향을 받지 않는다고 보고한 바와 상이한 결과를 나타냈다(23). 한편 이 결과에서 기질농도와 관계없이 기질인 맥아당이 일정량(30 %) 이하로는 더 이상 소비되지 않는 양상을 나타내었으며, 기질농도가 증가할수록 글루코오스 생성량이 증가함을 볼 수 있었다Qable 1).
- 2 %의 트레할로스 생성량을 보였다. 효소 양에 따른 트레할로스 최종 생산수율은 10, 25, 50 U/g의 효소 양에 따라 각각 62.3, 62.3, 59 %로 유사하였으나 최종 트레할로스 생산수율에 이르는 시간이 최대 6시간 앞당겨 짐을 알 수 있었다. 효소반응 크기를 2-L로 증가시켜 반응하였을 때 그 양상을 조사한 결과 소규모 반응(10 ml 미만)의 경우와 큰 차이가 없이 트레할로스생성량은 60 % 내외였다.
후속연구
- 대량생산에 있어서는 기질농도가 낮을 때 전환률이 높긴 하지만 생산수율이나 오염의 위험을 고려하여 기질 농도를 좀더 높여 효소반응에 이용하여야 한다고 사료된다. 그리고 요구되어지는 트레할로스 생산 수율에 따라 기질 농도를 변화하여 알맞은 공정을 수립하는 것에 본 자료는 활용되어질 수 있을 것이다.
- 효소반응 크기를 2-L로 증가시켜 반응하였을 때 그 양상을 조사한 결과 소규모 반응(10 ml 미만)의 경우와 큰 차이가 없이 트레할로스생성량은 60 % 내외였다. 따라서 이 결과들을 통하여 본 효소를 이용한 트레할로스 생산은 비교적 산업적으로 적용이용이 할 것으로 사료된다.
- 6). 이는 트레할로스 생산을 산업적으로 적용시킬 때 앞에서 최적화한 조건들과 각각 고려하여 시간 및 생성량을 조절할 수 있으리라 사료된다.
- 8). 효소반응에 의한 반응산물 중에 트레할로스는 이상과 같이 비교적 간단한 방법으로 분리가 가능하여 산업적으로 적용할 때 유용할 것으로 사료된다.
※ AI-Helper는 부적절한 답변을 할 수 있습니다.