[논문]티올화 항체고정형 SPR 바이오센서를 이용한 미생물 인식

조용진; 김남수

doi:10.5307/jbe.2003.28.2.167

문제 정의

SPR 바이오센싱 시스템의 대장균 검출력 평가를 위한 실험을 실시하였다. 실험에 사용된 대장균 (strain: KFRI 272, ATCC 25922)은 한국식품개발연구원의 균주은행에서 분양 받아 MacConky 배양액 (Sigma Chemical, USA)에 접종하여 배양하였다.
따라서, 본 연구의 목적은 티올화 항체고정화 기법을 이용하여 대량의 SPR 센서에 대장균 항체를 미리 고정하여 시료 정체형 SPR 바이오센싱 시스템을 제작하고, 대장균의 검출 능력을 분석하여 휴대용 실시간 대장균 센서로서의 가능성을 평가하는데 있다.
평가되고 있다. 본 연구는 미생물 검출을 위한 휴대식 SPR 바이오센싱 시스템 개발을 위한 기초연구로서 수행되었다. 즉, 티올화 항체고정화 기법을 사용하여 센서표면처리를 미리 대량으로 실시하여 측정현장에서의 전처리 시간을 배제하는 방식을 통해 실시간 측정시스템을 구현하고자 하였다.
본 연구는 미생물 검출을 위한 휴대식 SPR 바이오센싱 시스템 개발을 위한 기초연구로서 수행되었다. 즉, 티올화 항체고정화 기법을 사용하여 센서표면처리를 미리 대량으로 실시하여 측정현장에서의 전처리 시간을 배제하는 방식을 통해 실시간 측정시스템을 구현하고자 하였다. 주요 연구결과를 요약하면 다음과 같다.
특히, 본 연구에서는 휴대식 바이오센싱 시스템을 개발할 목표를 고려하여 시료 정체형 시스템을 제작하였다. 즉, 미리 SPR 센서 표면에 대한 항체고정화 작업이 이루어진 후, 정체 상태의 시료에 대해서 SPR 바이오센서를 적용하는 방법이 가능하도록 시스템을 구성하였다.

제안 방법

대장균 항체는 "0" & "K" 항원 혈청형(antigenic serotype)(YVS1001, Accurate Chemical & Scientific Corp., Westbury, USA)를 사용하였으며, 티올화 항체공역기법 (thiolated antibody coupling)에 의해 SPR 센서 표면에 고정화되었다. 항체의 고정화는 금막이 티올기(-SH)와 화학흡착(chemisorption)하는 성질을 이용하여 이루어졌다.
대장균 항체가 티올화 항체 공역 화학흡착 (thiolated antibody coupling chemisorption)에 의해 고정된 SPR 바이오센서의 재사용시 나타나는 반응을 평가하기 위해 측정에 사용된 SPR 바이오센서를 고농도(1.2 M) 및 저농도(10 mM)의 NaOH로 세정한 후 다시 측정하고 그 신호를 분석하였다.
본 연구에서는 SPR 곡선에서 기준선 수준 (baseline level)을 0.85로 설정하여 기준선 이하로 나타나는 신호들을 대상으로 1차 모멘트를 구하여 각 시료의 굴절률을 산출하였다. 산출된 굴절률은 10^-6까지 유효한 값을 가진다.
결과를 나타낸 것이다. 본 연구에서는 동일한 SPR 바이오센서를 이용하여 3회까지 반복 사용하였을 때 나타나는 측정치를 식 (2)~(4)으로 표시되는 2종의 상대척도를 산출하여 센서의 재사용 능력을 평가하였다.
센서별 편차를 제거하기 위하여 센서의 초기화 과정을 거쳤으며, 각 대장균 농도별로 3 반복 측정하여 농도간 측정신호의 유의성을 분석하였다.
항체의 고정화는 금막이 티올기(-SH)와 화학흡착(chemisorption)하는 성질을 이용하여 이루어졌다. 즉, 먼저 티올화 가교화제 (thiolation cross-linker)에 의하여 -SH 기를 도입한 후 SPR 센서의 금막에 화학흡착시켜 항체를 고정화하였다. 대장균 항체를 고정화시키는 구체적인 방법은 그림 2에 나타내었다.
특히, 본 연구에서는 휴대식 바이오센싱 시스템을 개발할 목표를 고려하여 시료 정체형 시스템을 제작하였다. 즉, 미리 SPR 센서 표면에 대한 항체고정화 작업이 이루어진 후, 정체 상태의 시료에 대해서 SPR 바이오센서를 적용하는 방법이 가능하도록 시스템을 구성하였다.
, Westbury, USA)를 사용하였으며, 티올화 항체공역기법 (thiolated antibody coupling)에 의해 SPR 센서 표면에 고정화되었다. 항체의 고정화는 금막이 티올기(-SH)와 화학흡착(chemisorption)하는 성질을 이용하여 이루어졌다. 즉, 먼저 티올화 가교화제 (thiolation cross-linker)에 의하여 -SH 기를 도입한 후 SPR 센서의 금막에 화학흡착시켜 항체를 고정화하였다.

대상 데이터

1). SPR 센서의 광원은 840 nm의 편광 근적외선 LED이고, 128 픽셀의 포토다이오드 어레이(photodiode array)가 반사광 측정용으로 장착되어있다.
실험을 실시하였다. 실험에 사용된 대장균 (strain: KFRI 272, ATCC 25922)은 한국식품개발연구원의 균주은행에서 분양 받아 MacConky 배양액 (Sigma Chemical, USA)에 접종하여 배양하였다. 배양 후 배양액을 원심분리하여 제거하였다.

이론/모형

SPR 바이오센서는 Texas hstnumentfUSA)에서 제작된 SPR 센서(제품명: Spreeta)를 활용하여 센싱부에 대장균 항체를 고정화하는 방법으로 제작되었다(그림 1). SPR 센서의 광원은 840 nm의 편광 근적외선 LED이고, 128 픽셀의 포토다이오드 어레이(photodiode array)가 반사광 측정용으로 장착되어있다.

성능/효과

1) 대장균 항체가 고정화된 SPR 바이오센서를 이용하여 대장균 용액을 측정하는데 3~5분이 소요되는 것으로 나타났다.
2) 본 연구에서 개발된 대장균 측정용 SPR 바이오센서는 0.05 유의수준에서 10⁴ CFU/mL까지 대장균 검출 능력이 있는 것으로 분석되었다.
3) 10²~10⁴ CFU/mL 구간의 경우, 0.05 유의수준에서 부분적으로 유의한 계측능력이 확인되었다.
4) 한번의 항체고정화를 통해 SPR 바이오센서를 세정 후 재사용하기는 곤란한 것으로 분석되었다. 그러나, 사용된 SPR 센서는 표면에 다시 항체를 고정하여 재사용할 수 있다.
SPR 센서 기기분석학의 발전은 SPR 센서를 이용하여 물리적, 화학적, 그리고 생물학적 현상을 정량적으로 측정할 수 있는 가능성을 크게 향상시켰다. 특히, 1990년 Biacore Intemation이 AB에 의해 출시되었던 최초의 상용 SPR 바이오센서는 생물학적 응용 분야에서 각광을 받게 되었으며, 다음해 Biacore에서는 감쇠 전반사 방식과 angular modulation 방식의 Kretschmann 기하학에 기초한 연구용 SPR 장치를 개발하여 생물분자 반응공학 분석(bio molecular interaction kinetic analysis), 친화력 측정법(affinity measurements), 선별 및 농도 검정(screening and concentration assays) 등의 연구에 SPR 바이오센서 기술이 이용될 수 있었다(Ligler와 Rowe Taitt, 2002).
각 농도별로 3 반복 측정하여 농도별 측정능력에 대해서 Dmcan의 다중검증에 의한 통계적 유의성을 분석한 결과, 0.05 유의수준에서 10² FU/mL까지는 대장균 검출능력이 유의한 것으로 나타났다. 다만, 10³~10⁴ CFU/mL 구간에서 유의차가 나타나지 않은 것은 실험오차의 영향이 다소 크게 나타났기 때문인 것으로 판단된다.
그러나, relative scale 2에 의해 평가한 결과, 세정액의 농도에 따라 다소의 차이는 있으나 SPR 센서에 항체를 고정화하여 대장균 검출을 하는 경우 센서의 검출능력은 급격히 감소하는 것으로 나타났다.
SPR 곡선은 식 (1)에 의해 산출된 것이다. 그림 4에서 보는 바와 같이 본 연구에서 개발한 SPR 바아오센서에 의해 대장균 농도를 측정하였을 때 전형적인 SPR 곡선이 잘 형성되고 있음을 알 수 있다.
있다. 다만, 사용한 SPR 바이오센서를 충분히 세정한 후, 항체를 다시 고정화하여 SPR 센서를 재활용할 수 있음을 확인하였다.
05에서 유의차가 인정되지 않음을 나타내는 것이다. 실험에 사용된 대장균 농도 구간에서 나타난 측정 곡선은 Sigmoid 형으로 추정할 수 있는 것으로 나타났다. 즉, 본 연구에서 개발된 SPR 바이오센서의 신호는 10² CFU/mL 이하의 대장균 농도에서는 특정한 값으로 수렴하는 형태를 보였으며, 10^{이러한 결과를 볼 때, 항체를 고정화한 바이오센서의 재사용 가능성은 매우 희박한 것으로 평가할 수 있다. 다만, 사용한 SPR 바이오센서를 충분히 세정한 후, 항체를 다시 고정화하여 SPR 센서를 재활용할 수 있음을 확인하였다.}

실험에 사용된 대장균 농도 구간에서 나타난 측정 곡선은 Sigmoid 형으로 추정할 수 있는 것으로 나타났다. 즉, 본 연구에서 개발된 SPR 바이오센서의 신호는 10² CFU/mL 이하의 대장균 농도에서는 특정한 값으로 수렴하는 형태를 보였으며, 10⁹ CFU/ mL 이상의 농도에서도 또다른 특정한 값으로 수렴할 수 있는 가능성을 보여주고 있다.

표에서 보는 바와 같이, relative scale 1에 의해 센서의 재사용 능력을 평가하였을 때 NaOH 농도에 무관하게 3회 측정시까지 98% 이상의 재현성을 보였다. 이 방법은 기존의 센서 연구에서 흔히 사용하는 평가법이다.

한편, 본 연구에서 개발한 시료 정체형 SPR 바이오센싱 시스템을 이용하여 대장균 용액에서 반응을 개시하였을 때, 반응의 안정기에 도달하는 시간은 센서의 초기화 과정을 포함하여 3~5분 소요되는 것으로 나타났다(그림 5).

후속연구

이러한 결과를 볼 때, 10² CFU/mL 이상의 대장균 농도에 대해서 본 연구에서 개발된 SPR 바이오센서는 대장균 검출에 효과적으로 사용될 수 있을 것으로 판단된다.

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