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문제 정의
- 본 연구에서 골다공증 환자를 위한 서방성 미립구 제제화에 있어서 일반적인 O/W 유화 용매 증발법을 이용하여 초기 약물의 burst없이 서서히 약물이 영차로 방출할 수 있는 IP 함유 PLGA 미립구를 제조하고자 하였다.26-29 PLGA의 분자량 (8, 20, 33 및 90 kg/mol), 고분자용액의 농도 (2.
제안 방법
- 26-29 PLGA의 분자량 (8, 20, 33 및 90 kg/mol), 고분자용액의 농도 (2.5, 5, 10 및 20%), 유화제의 종류 (PVA, gelatin 및 Tween 80), 초기 약물 함유량 (5, 10, 20 및 30%) 및 교반속도 (250, 500 및 1000 rpm) 등을 변수로 하여 제조조건을 달리 하였으며, 이들 변수들이 약물의 방출거동 및 미립구의 형태에 미치는 영향을 조사하였다. 생성된 미립구의 크기, 크기 분포, 표면 상태를 관찰하기 위해 전자주사 현미경 (scanning electron microsphere, SEM)을 이용하여 관찰하였다.
- 따라서, 생체외 방출실험을 위해 수용성 계면활성제의 일종인 SDS를 첨가한 수용액을 이용하여 간단하고 정확한 방출실험을 통해 난용성 IP의 정량분석의 어려움을 해결하였다.31 정확한 분석을 위해 미립구의 동일한 양을 500 mL의 용출액 (pH 7.4)에 넣어 37 ℃ 에서 일정한 교반속도 (100 rpm)를 주어 30일 동안 정해진 시간에 분석 시료를 채취하였고, 동일한 양의 용출액을 보충해 주었다. 분석시료는 분석시까지 냉장 보관 후 포접율 측정과 마찬가지로 HPLC 분석을 통해 정량분석하였다.
- HPLC 분석은 UV 검출기 (UV-1000, Thermo Separation Products, Fermont, CA, USA), 펌프 (P-2000, Thermo Separation Products), 자동시료주입기 (AS-3000, Thermo Separation Products)로 구성된 HPLC를 사용하였다. 컬럼은 μ-Bondapak C18 (3.
- 3333px;"> 여기서 사용된 SDS와 같은 수용액상의 계면활성제는 임계미셀농도를 초과하는 농도에서 난용성 약물의 젖음성과 용해를 증진시켜 용출을 향상시킨다. 따라서, 생체외 방출실험을 위해 수용성 계면활성제의 일종인 SDS를 첨가한 수용액을 이용하여 간단하고 정확한 방출실험을 통해 난용성 IP의 정량분석의 어려움을 해결하였다.31 정확한 분석을 위해 미립구의 동일한 양을 500 mL의 용출액 (pH 7.
- 제조된 미립구의 생체외에서의 방출거동을 조사하기 위하여 고성능 액체크로마토그래피 (high perfonrance liquid chro-matography, HPLC)로 측정하였다. 또한 미립구의 물리 화학적 성질을 X선 회절기 (X-ray diffraction, XRD)와 시차주사열량계 (differential scanning calorimeter, DSC)로 관찰하였다
- 증발법을 이용하여 미립구를 제조하였고 (Table 1), 제조 방법은 다음과 같다. 먼저 PLGA와 IP를 MS에 녹인 후에 유화제가 함유된 수용액 상에 부으면서 5시간 동안 교반시키면서 용매를 증발시켰다. 원심분리하여 상등액을 버린 후 0.
- 4)에 넣어 37 ℃ 에서 일정한 교반속도 (100 rpm)를 주어 30일 동안 정해진 시간에 분석 시료를 채취하였고, 동일한 양의 용출액을 보충해 주었다. 분석시료는 분석시까지 냉장 보관 후 포접율 측정과 마찬가지로 HPLC 분석을 통해 정량분석하였다. 검량선은 IP를 메탄올에 용해하여 저농도와 고농도 부분을 각각 1~20 μg/mL과 50~400 μg/mL로 나누어 작성하였다.
- 5, 5, 10 및 20%), 유화제의 종류 (PVA, gelatin 및 Tween 80), 초기 약물 함유량 (5, 10, 20 및 30%) 및 교반속도 (250, 500 및 1000 rpm) 등을 변수로 하여 제조조건을 달리 하였으며, 이들 변수들이 약물의 방출거동 및 미립구의 형태에 미치는 영향을 조사하였다. 생성된 미립구의 크기, 크기 분포, 표면 상태를 관찰하기 위해 전자주사 현미경 (scanning electron microsphere, SEM)을 이용하여 관찰하였다. 제조된 미립구의 생체외에서의 방출거동을 조사하기 위하여 고성능 액체크로마토그래피 (high perfonrance liquid chro-matography, HPLC)로 측정하였다.
- 약물의 초기 함량, PLGA의 분자량, PLGA의 MC내의 고분자의 농도, 교반속도 및 유화제의 종류를 각각 변수로 주어 일반적인 O/W 용매 증발법을 이용하여 미립구를 제조하였고 (Table 1), 제조 방법은 다음과 같다. 먼저 PLGA와 IP를 MS에 녹인 후에 유화제가 함유된 수용액 상에 부으면서 5시간 동안 교반시키면서 용매를 증발시켰다.
- Japan)을 사용하여 관찰하였다. 양면테이프를 부착한 금속판 위에 시료를 고정한 후 플라스마 스퍼터 (SC 500K, Emscope, UK)를 이용하여 아르곤 분위기 하에서 90초 동안 백금코팅하였다 제조된 미립구의 결정성은 XRD (D/Max-ⅢB, Rigaku, Japan)를 사용하여 5 °/min의 속도로 2θ의 값을 0~50°의 범위에서 측정하였으며, 미립구의 열적성질의 변화는 DSC (TA Instruent DSC 3100, DuPont, USA)를 이용하여 10 ℃/min의 승온속도로 -20-180 ℃의 범위에서 측정하였다.
- 여러가지 변수를 주어 제조된 미립구 크기와 형태를 관찰하기 위하여 SEM (S-2250N, Hitachi, Japan)을 사용하여 관찰하였다. 양면테이프를 부착한 금속판 위에 시료를 고정한 후 플라스마 스퍼터 (SC 500K, Emscope, UK)를 이용하여 아르곤 분위기 하에서 90초 동안 백금코팅하였다 제조된 미립구의 결정성은 XRD (D/Max-ⅢB, Rigaku, Japan)를 사용하여 5 °/min의 속도로 2θ의 값을 0~50°의 범위에서 측정하였으며, 미립구의 열적성질의 변화는 DSC (TA Instruent DSC 3100, DuPont, USA)를 이용하여 10 ℃/min의 승온속도로 -20-180 ℃의 범위에서 측정하였다.
- 제조된 미립구의 IP 포접율을 조사하기 위하여 조건을 달리하여 제조된 각각의 미립구 40 mg을 2 mL의 MC에 넣어 PLGA와 약물을 녹이고, 18 mL의 메탄올을 첨가하여 PLGA를 침전시키고 상등액 1 mL를 취하여 원심분리한 후 상층액 100 μL를 취하여 HPLC 분석하였다. HPLC 분석은 UV 검출기 (UV-1000, Thermo Separation Products, Fermont, CA, USA), 펌프 (P-2000, Thermo Separation Products), 자동시료주입기 (AS-3000, Thermo Separation Products)로 구성된 HPLC를 사용하였다.
- 생성된 미립구의 크기, 크기 분포, 표면 상태를 관찰하기 위해 전자주사 현미경 (scanning electron microsphere, SEM)을 이용하여 관찰하였다. 제조된 미립구의 생체외에서의 방출거동을 조사하기 위하여 고성능 액체크로마토그래피 (high perfonrance liquid chro-matography, HPLC)로 측정하였다. 또한 미립구의 물리 화학적 성질을 X선 회절기 (X-ray diffraction, XRD)와 시차주사열량계 (differential scanning calorimeter, DSC)로 관찰하였다
대상 데이터
- (순도 99.2%, 동방미래화학)는 상온에서 보관하여 사용하였으며, 본 실험에서 이용한 생분해성 고분자 재료는 PLGA로서 평균분자량이 각각 820과 90 kg/mol (락타이드/글리콜라이드 몰비, 50/50, 75/25 및 75/25, Resomer RG 502 H, 752, 및 756, Boehringer Ingetheim, Germany)인 것을 사용하였다. 젤라틴 (Junsei Chem.
- , Japan)은 유화제로 사용하였다. 생체외 방출실험시 이용한 물은 Milli-Q 정화 시스템 (Millipore, Molsheim, France)을 이용, 정제하여 사용하였다. 메틸렌클로라이드 (MC, Tedia, Japan), 아세토니트릴 (덕산화학), 메틸알콜 (Junsei Chem.
- 2%, 동방미래화학)는 상온에서 보관하여 사용하였으며, 본 실험에서 이용한 생분해성 고분자 재료는 PLGA로서 평균분자량이 각각 820과 90 kg/mol (락타이드/글리콜라이드 몰비, 50/50, 75/25 및 75/25, Resomer RG 502 H, 752, 및 756, Boehringer Ingetheim, Germany)인 것을 사용하였다. 젤라틴 (Junsei Chem. Co., Japan), 폴리비닐알콜 (PVA, Junsei Chem. Co., Japan), 및 Tween 80 (Junsei Chem. Co., Japan)은 유화제로 사용하였다. 생체외 방출실험시 이용한 물은 Milli-Q 정화 시스템 (Millipore, Molsheim, France)을 이용, 정제하여 사용하였다.
- 0 mL/min으로 하였다. 컬럼온도는 상온을 유지하였고 검출 파장은 250 nm를 선택하였으며 시료주입량은 20 μL로 하였다.
이론/모형
- 검량선은 IP를 메탄올에 용해하여 저농도와 고농도 부분을 각각 1~20 μg/mL과 50~400 μg/mL로 나누어 작성하였다. IP 특성피크는 약 12분에서 정량적으로 증가하였고, 검량선은 1/x 선형회귀법을 이용하여 도식하였다.31,32
성능/효과
- )를 나타낸 그림이다. IP의 Tm와 PLGA 20 kg/mol의 유리전이온도 (Tg)는 문헌에 보고된 것과 일치하였으며,2 IP의 경우는 높은 결정성으로 인해 매우 강한 흡열피크를 갖는 것으로 나타났다. IP의 용융엔탈피 (ΔHm)는 PLGA에 포접된 경우 IP자체의 ΔHm에 비하여 현저히 감소하여 결정성이 거의 없음을 알 수 있었다.
- IP의 Tm와 PLGA 20 kg/mol의 유리전이온도 (Tg)는 문헌에 보고된 것과 일치하였으며,2 IP의 경우는 높은 결정성으로 인해 매우 강한 흡열피크를 갖는 것으로 나타났다. IP의 용융엔탈피 (ΔHm)는 PLGA에 포접된 경우 IP자체의 ΔHm에 비하여 현저히 감소하여 결정성이 거의 없음을 알 수 있었다. 한편, PLGA의 Tg도 상승하였으며 유리엔탈피 (ΔHg)값은 감소하는 경향을 나타내어 PLGA의 결정성이 감소함을 알 수 있었다.
- 또한, 약물이 고분자 매트릭스내에 고루 분포되어 직경이 5~200 μm인 미립구를 형성하였으며 형태는 매끈한 원형이었다. XRD분석 결과를 통하여 결정성 약물인 IP가 PLGA에 포접되어 결정성이 감소하였음을 확인하였고 DSC분석 결과 각각의 열적특성을 나타내는 피크들의 이동과 전이엔탈피의 감소로부터 친수성 고분자가 약물의 결정성에 영향을 미치고 있음을 확인하였다 생체외 방출실험에서는 연속상에 유화제인 젤라틴으로 제조된 미립구가 포접율이 가장 높을 뿐만 아니라, 방출속도도 다른 유화제의 사용보다는 빠르게 나타났으며, 초기 약물 함량이 증가할수록 약물의 방출기간은 길어지고, 초기 약물 함량이 적을수록 방출속도가 빠름을 알 수 있었다. 고분자의 농도와 PLGA의 분자량이 증가할수록 제조된 미립구의 방출속도가 느려졌고, 교반속도가 증가할수록 방출속도가 증가함을 알 수 있었다.
- 미립구의 경우는 고분자와 약물의 중간부위에서 Tm의 전이가 일어남을 관찰할 수 있었다. XRD와 DSC의 결과로부터 미립구를 제조할 때 용매의 사용으로 인한 약물의 결정성 감소와 약물의 결정성이 매트릭스인 고분자의 무정형의 영역에 포함하고 있어서 결정성이 감소됨을 알 수가 있었다.2 IP가 함유된 PLGA는 고체용액 상태로 존재하면서 각각의 전이온도를 변화시키고 결정성을 감소시키는 작용을 한다고 추측할 수 있다.
- 따른 생체외 방출거동을 나타내었다. 고분자의 농도가 2.5%로 제조된 미립구의 방출속도가 20%로 제조된 미립구보다 더 증가하였음을 알 수 있었다. 용매의 사용감소로 인한 고분자의 농도 증가는 분포상의 점도의 증가로 인해 일정한 교반속도로 행해질 때 미립구의 크기가 커짐으로, 미립구의 크기 증가는 비 표면적이 작아지기 때문에 방출속도가 낮아짐을 알 수 있었다.
- XRD분석 결과를 통하여 결정성 약물인 IP가 PLGA에 포접되어 결정성이 감소하였음을 확인하였고 DSC분석 결과 각각의 열적특성을 나타내는 피크들의 이동과 전이엔탈피의 감소로부터 친수성 고분자가 약물의 결정성에 영향을 미치고 있음을 확인하였다 생체외 방출실험에서는 연속상에 유화제인 젤라틴으로 제조된 미립구가 포접율이 가장 높을 뿐만 아니라, 방출속도도 다른 유화제의 사용보다는 빠르게 나타났으며, 초기 약물 함량이 증가할수록 약물의 방출기간은 길어지고, 초기 약물 함량이 적을수록 방출속도가 빠름을 알 수 있었다. 고분자의 농도와 PLGA의 분자량이 증가할수록 제조된 미립구의 방출속도가 느려졌고, 교반속도가 증가할수록 방출속도가 증가함을 알 수 있었다. 이들 결과로부터 미립구의 제조 조건을 조절한다면, 입자들의 회합현상을 배제하고 약물을 고분자지지체 내부에 골고루 분산시켜 약물의 방출을 효과적으로 제어할 수 있음을 확인하였다.
- 분자량이 커짐에 따라 분자량이 낮은 것보다는 PLGA의 소수성이 증가하여 수용액이 미립구로의 젖음속도가 늦어져 방출속도는 늦어지게 되는 것으로 사료된다. 고분자의 분자량을 조절함으로써 조금 더 약물의 방출을 효과적으로 제어할 수 있다는 사실을 관찰하였다.
- 고분자의 분자량이 클수록 제조된 미립구의 방출속도가 느림을 알 수 있었다. 분자량이 커짐에 따라 분자량이 낮은 것보다는 PLGA의 소수성이 증가하여 수용액이 미립구로의 젖음속도가 늦어져 방출속도는 늦어지게 되는 것으로 사료된다.
- (Batches 2, 10 및 11). 교반속도가 증가할수록 전반적으로 결정성이 큰 약물과 무정형인 고분자 매트릭스가 서로 잘 결합하여 미립구를 형성하였고, 포접율은 증가하였다.
- 교반속도를 달리하여 제조된 모든 미립구는 대략 30일 이상 방출이 되었고 교반속도가 증가할수록 방출속도가 증가하였다 (초기 10% 약물 함유, PLGA 분자량 20 kg/mol, 및 PLGA 농도 10%). 그 이유는 교반속도가 증가함에 따라 미립구의 크기가 작아져서 약물이 방출액과 접촉할 수 있는 표면적이 넓어지고, 매트릭스에 채널생성 현상이 더 빨리 일어나 약물의 방출속도가 빨라져 방출기간이 짧아진다.
- 사용하여 관찰한 결과이다. 그림에서 보는 바와 같이 IP는 매우 높은 결정성을 가지고 있고 10~30° 영역에서 결정피크가 나타남을 알 수 있으며, IP를 포접하는데 사용된 PLGA의 고분자는 결정성이 매우 낮아 결정영역이 거의 없는 무정형을 보이는 것으로 나타났다. 또한, 제조된 미립구의 경우에는 결정영역이 보이지 않았고 무정형 형태로 측정되었다 물리적인 혼합물보다는 미립구의 무정형성이 증가됨을 알 수가 있었다.
- 또한, 제조된 미립구의 경우에는 결정영역이 보이지 않았고 무정형 형태로 측정되었다 물리적인 혼합물보다는 미립구의 무정형성이 증가됨을 알 수가 있었다. 따라서, IP가 PLGA 고분자와 대부분 균일하게 분산된 고체용액 상태를 이루고 있음을 알 수 있었다.
- 그림에서 보는 바와 같이 IP는 매우 높은 결정성을 가지고 있고 10~30° 영역에서 결정피크가 나타남을 알 수 있으며, IP를 포접하는데 사용된 PLGA의 고분자는 결정성이 매우 낮아 결정영역이 거의 없는 무정형을 보이는 것으로 나타났다. 또한, 제조된 미립구의 경우에는 결정영역이 보이지 않았고 무정형 형태로 측정되었다 물리적인 혼합물보다는 미립구의 무정형성이 증가됨을 알 수가 있었다. 따라서, IP가 PLGA 고분자와 대부분 균일하게 분산된 고체용액 상태를 이루고 있음을 알 수 있었다.
- 그 이유는 교반속도가 증가함에 따라 미립구의 크기가 작아져서 약물이 방출액과 접촉할 수 있는 표면적이 넓어지고, 매트릭스에 채널생성 현상이 더 빨리 일어나 약물의 방출속도가 빨라져 방출기간이 짧아진다. 반면에 교반속도가 느려지면 반대의 현상이 일어나 방출기간이 길어짐을 알 수 있었다.
- 본 실험을 통하여 얻어진 미립구의 제조기술은 본 실험에서 적용된 약물뿐만 아니라 타 난용성 약물에도 적용 가능하다. 현재 IP 함유 미립구의 동물실험이 연구 중이다
- 생분해성 고분자인 PLGA를 매트릭스로 하여 골다공증 치료제인 IP를 함유한 미립구를 제조하여 서방성 제제화를 하였고 미립구를 제조함에 있어서 제조 조건인 초기 약물 함유량, 고분자의 분자량, 고분자의 농도 및 유화제의 종류에 따라 포접율이 다른 미립구를 얻었고, 포접율과 SEM 관찰결과로부터 유화제인 젤라틴과 PVA의 사용이 약물의 포접율이 가장 좋음을 확인하였다. 또한, 약물이 고분자 매트릭스내에 고루 분포되어 직경이 5~200 μm인 미립구를 형성하였으며 형태는 매끈한 원형이었다.
- 나타내었다. 약물의 포접율은 제조 조건에 따라서 23.7~116%의 범위로 나타났으며 고분자의 농도가 높은 미립구가 고분자의 농도가 낮은 것보다 포접율이 약간 좋게 나타났는데 20%의 고분자 농도로 제조된 미립구는 2.5%로 제조된 것보다는 포접율이 다소 큼을 알 수 있었다 (Batches 2, 7, 8 및 9). 이러한 경우는 고분자의 농도가 높을수록 분포상의 점도가 증가하여 분포상에 존재하는 약물이 액체상인 연속상으로 빠져나가려고 하는 것을 느리게 함으로써 약물의 함량이 증가하는 것으로 사료된다.
- 5%로 제조된 미립구의 방출속도가 20%로 제조된 미립구보다 더 증가하였음을 알 수 있었다. 용매의 사용감소로 인한 고분자의 농도 증가는 분포상의 점도의 증가로 인해 일정한 교반속도로 행해질 때 미립구의 크기가 커짐으로, 미립구의 크기 증가는 비 표면적이 작아지기 때문에 방출속도가 낮아짐을 알 수 있었다.
- 고분자의 농도와 PLGA의 분자량이 증가할수록 제조된 미립구의 방출속도가 느려졌고, 교반속도가 증가할수록 방출속도가 증가함을 알 수 있었다. 이들 결과로부터 미립구의 제조 조건을 조절한다면, 입자들의 회합현상을 배제하고 약물을 고분자지지체 내부에 골고루 분산시켜 약물의 방출을 효과적으로 제어할 수 있음을 확인하였다.
- 초기 약물 함유량이 5%와 10%일 때 방출속도가 빨랐고, 20%와 30%의 약물이 함유된 미립구는 상당히 오랫동안 방출이 되어 방출기간이 지연됐음을 알 수 있다. 일반적으로 약물의 함유량이 증가할수록 약물 방출이 빠르게 진행되는 일반적인 약물 방출거동과는 달리 약물의 초기 함유량이 증가할수록 약물의 방출기간이 길어지고 방출량이 감소하는 이유는 결정성 약물의 함유량이 증가할수록 무정형 고분자 매트릭스내에서 약물이 고르게 분포하지 않고, 이에 따라 미립구들중 일부가 깨짐현상이 일어나고, 일부 미립구들은 약물의 회합현상이 일어나 초기에 형성된 채널을 통해 결정성 약물이 잘 빠져 나오지 못하는 것으로 사료된다. 약물의 함량에 따라서 미립구의 제조조건을 조절한다면, 입지들의 회합 현상을 배제하고 약물을 고분자지지체 내부에 골고루 분산시켜 방출속도를 일정하게 제어할 수 있을 것으로 사료된다.
- Figure 8은 초기 약물 함유량에 따른 IP를 함유한 미립구의 방출거동을 나타낸 것이다. 초기 약물 함유량이 5%와 10%일 때 방출속도가 빨랐고, 20%와 30%의 약물이 함유된 미립구는 상당히 오랫동안 방출이 되어 방출기간이 지연됐음을 알 수 있다. 일반적으로 약물의 함유량이 증가할수록 약물 방출이 빠르게 진행되는 일반적인 약물 방출거동과는 달리 약물의 초기 함유량이 증가할수록 약물의 방출기간이 길어지고 방출량이 감소하는 이유는 결정성 약물의 함유량이 증가할수록 무정형 고분자 매트릭스내에서 약물이 고르게 분포하지 않고, 이에 따라 미립구들중 일부가 깨짐현상이 일어나고, 일부 미립구들은 약물의 회합현상이 일어나 초기에 형성된 채널을 통해 결정성 약물이 잘 빠져 나오지 못하는 것으로 사료된다.
- IP의 용융엔탈피 (ΔHm)는 PLGA에 포접된 경우 IP자체의 ΔHm에 비하여 현저히 감소하여 결정성이 거의 없음을 알 수 있었다. 한편, PLGA의 Tg도 상승하였으며 유리엔탈피 (ΔHg)값은 감소하는 경향을 나타내어 PLGA의 결정성이 감소함을 알 수 있었다. 미립구의 경우는 고분자와 약물의 중간부위에서 Tm의 전이가 일어남을 관찰할 수 있었다.
후속연구
- 일반적으로 약물의 함유량이 증가할수록 약물 방출이 빠르게 진행되는 일반적인 약물 방출거동과는 달리 약물의 초기 함유량이 증가할수록 약물의 방출기간이 길어지고 방출량이 감소하는 이유는 결정성 약물의 함유량이 증가할수록 무정형 고분자 매트릭스내에서 약물이 고르게 분포하지 않고, 이에 따라 미립구들중 일부가 깨짐현상이 일어나고, 일부 미립구들은 약물의 회합현상이 일어나 초기에 형성된 채널을 통해 결정성 약물이 잘 빠져 나오지 못하는 것으로 사료된다. 약물의 함량에 따라서 미립구의 제조조건을 조절한다면, 입지들의 회합 현상을 배제하고 약물을 고분자지지체 내부에 골고루 분산시켜 방출속도를 일정하게 제어할 수 있을 것으로 사료된다.
- 그 이유는 약물의 초기 함유량이 증가할수록 약물의 고분자내에 차지하는 비율이 높아져 결정성이 매우 큰 약물과 무정형인 고분자 매트릭스가 서로 잘 결합하지 못하고, 포접 가능성이 작아지기 때문이다. 위의 결과들로부터, 약물의 함량과 유화제의 종류 및 교반속도 등에 따라서 제조조건을 달리한다면, 미립구의 깨짐현상과 회합현상을 배제하고 약물을 고분자지지체 내부에 고르게 분산시켜 방출속도를 일정하게 제어할 수 있을 것으로 사료된다.
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