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문제 정의
- 본 연구에서는 부영양화된 저수지의 수생태계의 이화학적 특성에 따른 세균의 분포 및 군집구조의 변화를 DAPI법과 fluorescent in situ hybridization법을 이용하여 살펴 보았으며, 이 화학적 수질인자에 의한 영향성을 상관관계 분석을 통해 검토하였다. FISH기법은 원핵생물의 16S rRNA 염기서열의 상보적인 oligonucleotide에 형광물질을 부착한 것을 탐지자(gene probe)로 하여 세포 내 rRNA에 hybridization 함으로써 배양을 통하지 않고 현장시료의 세균을 직접 형광현미경을 이용해 동정하고 계수하는 방법이다(18).
제안 방법
- 총세균수를 측정하기 위한 DAPI와 세균군집구조를 위한 HSH 법의 fluorescent oligonucleotide의 dual staine Hicks 등(22)의 방법에 준하여 실시하였다. 고정된 시료는 시료 1 volume에 ethanol 1 volume을 첨가하여 -2(TC에 저장하였고, 총세균수는 고정된 시료 2 μ1를 silane coation slide glass위에 떨어뜨린 후, DAPI(1 #)를 50 gl 첨가하여 5분간 염색한 후, 멸균 증류수 로 세척하여 형광현미경과 scanning confocal laser micorscopy를 사용, X400 또는 XI,000의 배율에서 field에 나타난 세균을 20번 이상 반복 계수하여 그 평균값으로 나타내었다(5). 세균군집별 Eubacteria 수는 고정된 시료 2 μ1를 saline coating slide에 spot하여 공기 중에서 건조시키고 이 slide를 50, 80, 96% ethanol에 각각 3분간 담근 후 건조하여, hybridization 용액(0.
- 고정된 시료는 시료 1 volume에 ethanol 1 volume을 첨가하여 -2(TC에 저장하였고, 총세균수는 고정된 시료 2 μ1를 silane coation slide glass위에 떨어뜨린 후, DAPI(1 #)를 50 gl 첨가하여 5분간 염색한 후, 멸균 증류수 로 세척하여 형광현미경과 scanning confocal laser micorscopy를 사용, X400 또는 XI,000의 배율에서 field에 나타난 세균을 20번 이상 반복 계수하여 그 평균값으로 나타내었다(5). 세균군집별 Eubacteria 수는 고정된 시료 2 μ1를 saline coating slide에 spot하여 공기 중에서 건조시키고 이 slide를 50, 80, 96% ethanol에 각각 3분간 담근 후 건조하여, hybridization 용액(0.9 M NaCl, 20 mM Tris-HCl [pH 7.4] 0.1% SDS, fonnamide 농도:EUB, 20%; ALF, 20%; BET와 GAM, 35; C-F, 15%; HGC, 20%) 8 #probe로 사용되는 oligonucleotide (5 |lg/ml) 1 pl을 잘 섞은 혼합 액을 상기의 slide glass에 떨어뜨려 46℃, 90분간 반응시키고, 미리 48#(2로 예열된 세척용액(20mM Tris-HCl [pH7.4], 5 mM EDTA, 0.1% SDS, NaCl 용액농도 : EUB, 0.9 M; ALF, 0.225 M; BET와 GAM, 80Mm;CF, 80mM)에 15분간 담근 후 증류수로 세척하여 공기 중에서 건조시킨 다음 DAPI법과 동일하게 측 정하였다(5). 사용된 probe인 rRNA-targeted oligonucleotide-^ Table 1과 같다
대상 데이터
- 66 km2의 농업용수원으로, 저수지 유출수는 삽교담수호로 유입되는 곡교천의 지류인 오목천에 합류된다. 조사는 마산저수 지 중앙지점에서 2000년 6월부터 11월까지 월별로 실시하였으며,시료의 채취는 수심 즉정 후 수면하 0.5 m부터 간격으 로 구분하여 Vandon 채수기로 채수하였다. 세균분석을 위한 시 료는 멸균된 1L 채수병에 무균적으로 취했으며, 수질이화학적 분석을 위한 시료는 전처리과정을 고려하여 1 L와 2L 폴리에틸 렌병에 각각 취하였다.
데이터처리
- 마산저수지에서 이화학적 수질인자가 세균분포에 미치는 영향을 검토하기 위해 수질항목과 미생물군집간 상관관계를 Excell 2000을 이용하여 단순선형회귀분석(single linear regression analysis) 하였다(Table 4). 모집단의 크기인 ne 22이며, 상관계수에 대한 기각값은 p0.
이론/모형
- 수온, pH, EC, DO 등은 시료채취와 함께 현장에서 바로 측정 하였으며, COD는 산성망간법(16)으로, TN, 암모니아성질소 (NH4-N), 아질산성질소(Nq-N), 질산성질소(NO3-N), TP, 인산염 인(PO4-P), SS, Chl-a 등은 Standard Method 제19판(19)의 방법에 준해 분석하였다.
- 총세균수를 측정하기 위한 DAPI와 세균군집구조를 위한 HSH 법의 fluorescent oligonucleotide의 dual staine Hicks 등(22)의 방법에 준하여 실시하였다. 고정된 시료는 시료 1 volume에 ethanol 1 volume을 첨가하여 -2(TC에 저장하였고, 총세균수는 고정된 시료 2 μ1를 silane coation slide glass위에 떨어뜨린 후, DAPI(1 #)를 50 gl 첨가하여 5분간 염색한 후, 멸균 증류수 로 세척하여 형광현미경과 scanning confocal laser micorscopy를 사용, X400 또는 XI,000의 배율에서 field에 나타난 세균을 20번 이상 반복 계수하여 그 평균값으로 나타내었다(5).
성능/효과
- a-group보다는 다소 약 한 중상관관계를 가진 μ-groupe a-group과 비교하여 NH『N에 상관관계가 나타나지 않았으며, Y-groupe a-group보다 NH’-N과 Org-P와 더 높은 상관관계를 보여주었다. C-F group과 HGC groupe a-, P-, -group보다 상관관계가 약하게 나타났으며, 특히 C-F groupe Org-P와 HGC groupe NH4-N, NO2-N, NO3-N 과 상관관계의 유의성이 없었다. 그러나, Rhodococcus sp.
- 이는 6월 말 장마를 시작으로 9월 집중강우 등 강우 현상의 직접적인 영향을 보여주는 것으로 초기강우 이후에 저수지로 유입된 강우수가 희석수로서 작용하였음을 직접적으로 나타내고 있다. COD는 6월 이후 7월과 8월에 증가한 후 9월에 최저치를 보여주었는데 이는 강우와 함께 유입된 육상기원의 토 양입자에 부착된 유기물질과 강우 현상 사이에 식물플랑크톤에 의한 생물합성의 결과로 판단된다.
- 세균분포가 급증하였던 7월에는 각 a-, P-, YProteobacteria group과 C-F group이 유사한 분포를 보여주었으며, 다른 시기에 비해 HGC group과 기타세균의 비율이 상당히 낮게 나타났다. Chl-a가 가장 높았고, 강우 유출수의 유입이 많았던 8 월과 9월에는 7월과 달리 기타(other) 군집의 비율이 38.1 %로 아주 높았으며, Proteobacteria group의 비율은 10% 내외로 낮은 편이었고, C-F group의 비율 역시 다른 시기에 비해 특징적으로 낮게 나타났다. 9월 우점 group으로 나타났던 HGC groupe 수 온이 높았던 7월과 8월에 낮은 분포를 보인 것을 제외하면, 13~19%의 비교적 일정한 분포를 보여주고 있었다.
- 012)와 총세균수는 상관성이 없는 것으로 나타났다. Eubacteria는 총세균수보다 수질인자와 더 강한 상 관관계를 보여주었는데, 수온과 0.649의 상관계수로 유의성이 있는 양의 상관관계를 보였고, EC, COD, Org-N, Org-P는 0.523, 0.561 0.666, 0.775로 유의성을 가지는 중상관~강상관 관계를 보 여준 반면, 총세균수에서와 같이 Chl-a (r=0.024)와는 유의성이 없는 것으로 나타났다
- TNe 6월 이후 점차 증가하여 8월에 가장 높은 수치를 보였 으며, TP는 9월에 가장 높은 농도를 보여 EC와 전혀 다른 양상 을 보여주었으며, SS도 TP와 같이 점차 증가하여 9월에 가장 높은 농도를 나타내었다. 특히, 유기성 질소와 암모니아성 질소, 유 기성 인은 초기강우의 영향을 받고 있는 7월에 증가한 후 감소 하였으며, 질산성질소와 인산염인은 강우기 동안 점차 증가하여 9월에 최고 농도를 보여주고 있었다.
- 세균군집구조와 수질인자간의 상관관계를 보면, 마산지 에서 비교적 우세하게 나타난 a-groupe 수온, EC, COD, Org-N, NH4-N, NO2-N, NO3-N 등과 유의성 있는 중상관관계를 가졌으 며, Org-P와는 강상관관계를 보여주었다. a-group보다는 다소 약 한 중상관관계를 가진 μ-groupe a-group과 비교하여 NH『N에 상관관계가 나타나지 않았으며, Y-groupe a-group보다 NH’-N과 Org-P와 더 높은 상관관계를 보여주었다. C-F group과 HGC groupe a-, P-, -group보다 상관관계가 약하게 나타났으며, 특히 C-F groupe Org-P와 HGC groupe NH4-N, NO2-N, NO3-N 과 상관관계의 유의성이 없었다.
- 각세균군집과 수질인자간의 상관관계를 통해 상호 영향성을 검토한 결과 Proteobacteria groupe Org-P, Org-N과 가장 밀접한 관계를 가지는 것으로 나타났으며, 수온, EC, COD, 무기질소에 대해서도 상호 연관성이 나타남을 알 수 있었다. 반면에 C-F groupe Org-N에 HGC groupe 수온에 가장 큰 영향을 받는 것 로 나타났으며, 그외 항목에서는 Proteobacteria group 보다 영 향성이 크지 않은 것으로 나타났다.
- 0%로 6월에 가장 높은 비율을, 7월에 가장 낮은 비율을 나타내었다. 강우현 상에 따른 총세균수 및 Eubacteria 분포의 변화를 보면, 초기강 우 유출에 따른 육상기원의 유기물질 증가로 7월에 급격한 증가 를 보인 후 8월에 감소, 집중강우가 있었던 9월에 더욱 감소하였으며, 강우기가 끝난 10월에 세균분포의 증가를 관찰할 수 있었다. 또한 수온의 감소로 인해 11월에는 세균수가 최저 수준을 보여주었다.
- 마산저수지는 이제까지 많은 연구가 이루어진 소양호 등의 인 공댐호에 비해 규모가 작고, 수심이 낮으며, 경사가 급한 중산간 지대를 유역으로 하는 농업용저수지로 관개기인 5~6월에 저수위 상태였다가 강우가 시작되면 저수량보다 훨씬 많은 물이 일시에 몰려드는 특성을 가지고 있다. 따라서 기존에 보고되어진 국내외 호소의 세균군집특성과 달리 식물플랑크톤의 영향과 함께 강우 특성 및 기타 저수지내부요소에 복잡하게 영향을 받고 있는 것으로 나타났다.
- 남매지에서는 다양한 물질 대사능과 다양한 형태를 가진 세균군을 포함하여, 저농도의 유기 물 이용능력이 다른 세균군에 비해 좋은 a-group이 많이 검출되면 C-F group도 많이 검출되는 경향을 보고하였는데(10), 마산저수지에서는 11월 a-group이 우세할 때 C-F group이 높은 분포를 보였다. 또한 C-F groupe Chl-a가 증가했을 경우 우점하고 심 수층에 존재하는 다양한 고분자 물질의 분해에 관여하는 것으로 알려져있는데(21,26), 본 연구에서는 Chl-a가 높게 나타난 7월, 8월 10월중 7월과 10월에는 C-F group이 높은 비율을 차지하였 으나, 8월에는 낮은 비율을 보인 반면, 수층이 안정화되고 수온 의 감소에 따른 식물플랑크톤의 조성의 변화로 Chl-a의 농도가 감소한 11월에는 높은 비율을 보여주어 C-F group이 Chl-a 변화 보다는 수층의 안정화가 이루어진 시기에 분포비율이 증가하고 강우 등 수층의 교란이 심각할 때 감소하는 것으로 판단되어졌 다. 수층의 안정화는 Chl-a의 증가 요인으로 Chl-a는 C-F group 과 유사한 변화를 보여주며, 6월에 C-F group의 비율이 높은 것 도 같은 이유로 사료되었다.
- 반면에 C-F groupe Org-N에 HGC groupe 수온에 가장 큰 영향을 받는 것 로 나타났으며, 그외 항목에서는 Proteobacteria group 보다 영 향성이 크지 않은 것으로 나타났다. 또한, pH, DO, BOD, SS 등의 항목에 대해서는 서로 영향을 미치지 않았으며, Chl-a와도 유 의성있는 상관성이 전혀 없어 서로 영향을 미치지 않는 것으로 나타났다.
- 마산저수지에서 총세균수의 변화에 영향을 미치는 이화학적 수질인자를 상관 관계를 통해 분석한 결과 수온과는 0.618으로 유의성이 있는 양의 중상관 관계를 보였으며, EC, COD, Org-N, Org-P의 상관계수가 0.509, 0.529, 0.656, 0.758로 유의성을 가지는 중상관~강상관 관계를 가지고 있었다. 식물플랑크톤의 현존량 을 반영하는 Chl-a (r=0.
- 각세균군집과 수질인자간의 상관관계를 통해 상호 영향성을 검토한 결과 Proteobacteria groupe Org-P, Org-N과 가장 밀접한 관계를 가지는 것으로 나타났으며, 수온, EC, COD, 무기질소에 대해서도 상호 연관성이 나타남을 알 수 있었다. 반면에 C-F groupe Org-N에 HGC groupe 수온에 가장 큰 영향을 받는 것 로 나타났으며, 그외 항목에서는 Proteobacteria group 보다 영 향성이 크지 않은 것으로 나타났다. 또한, pH, DO, BOD, SS 등의 항목에 대해서는 서로 영향을 미치지 않았으며, Chl-a와도 유 의성있는 상관성이 전혀 없어 서로 영향을 미치지 않는 것으로 나타났다.
- 또한, 농업용저수지인 문천지와 남매 지에서 Eubacteria의 총균수에 대한 비율이 남조류의 증식과 관 련하여 남조류 증식시기에 격감하였으며(9, 10), 소양호에서 남조 류 우점 시기에 Eubacteria의 총세균수에 대한 비율이 50% 이하 로 감소한 이유로 남조류의 toxin이 세균성장을 저해하기 때문으 로 추정한 바 있다(1). 본 연구에서도 Chl-a가 높은 #, 8월, 10 월에 Eubacteria의 비율이 낮게 나타나 남조류에 의한 영향이 있 었음을 추측할 수 있었다.
- 세균군집구조와 수질인자간의 상관관계를 보면, 마산지 에서 비교적 우세하게 나타난 a-groupe 수온, EC, COD, Org-N, NH4-N, NO2-N, NO3-N 등과 유의성 있는 중상관관계를 가졌으 며, Org-P와는 강상관관계를 보여주었다. a-group보다는 다소 약 한 중상관관계를 가진 μ-groupe a-group과 비교하여 NH『N에 상관관계가 나타나지 않았으며, Y-groupe a-group보다 NH’-N과 Org-P와 더 높은 상관관계를 보여주었다.
- 758로 유의성을 가지는 중상관~강상관 관계를 가지고 있었다. 식물플랑크톤의 현존량 을 반영하는 Chl-a (r=0.012)와 총세균수는 상관성이 없는 것으로 나타났다. Eubacteria는 총세균수보다 수질인자와 더 강한 상 관관계를 보여주었는데, 수온과 0.
- 강우기 이후 10월과 11월에는 식물플랑크톤 등의 생물작용과 물리적 침강 등에 영향을 받아 COD 등 유기물질농도가 증가하 고, TN, TP, SS는 감소하였다. 이시기 N, P 등 영양염류는 무기 성 염양염류는 감소하였고, 유기성 영양염은 증가하였는데, 이는 생물에 의한 유기화로 인한 결과로 판단된다.
- 총세균수 중의 Eubacteria 군집의 비율을 군집구조별로 살펴본 결과(Fig. 3) 6월, 8월, 11월에는 a-Proteobacteria group이, 집중 강우가 나타났던 9월에는 HGC group이, 10월에는 0-group이 우 점하여 나타났다. 세균분포가 급증하였던 7월에는 각 a-, P-, YProteobacteria group과 C-F group이 유사한 분포를 보여주었으며, 다른 시기에 비해 HGC group과 기타세균의 비율이 상당히 낮게 나타났다.
- 총세균수, Eubacteria 분포와 수질인자와의 상관관계 연구에서 수온은 세균군집에 가장 큰 영향을 미치는 요인으로 보고한 사 례와 유사하게 나타났으나(2, 10, 14), 수온보다는 Org-N, Org-P 등 유기성의 영양염류가 세균군집크기와 상관성이 가장 높게 나타나고 있어 세균군집에 가장 큰 영향을 미치고 있는 요인으로 나타났다. 또한, COD를 세균의 성장과 밀접한 관계를 가지는 용 존유기물질(DOC)과의 상관관계 분석결과와 비교해서 적용해 보면, 이 등(10)이 DOC와 분석한 총세균수(r=0.
- 총세균수에 대한 Eubacteria의 비율변화는 세균분포가 높은 7 월에 가장 낮고, 세균분포가 낮았던 6월, 9월, 11월에 높은 분포를 보여 주어 총세균수의 변동에 비해 Eubacteria의 변동이 다소 안정적인 것으로 나타났다. 또한, 농업용저수지인 문천지와 남매 지에서 Eubacteria의 총균수에 대한 비율이 남조류의 증식과 관 련하여 남조류 증식시기에 격감하였으며(9, 10), 소양호에서 남조 류 우점 시기에 Eubacteria의 총세균수에 대한 비율이 50% 이하 로 감소한 이유로 남조류의 toxin이 세균성장을 저해하기 때문으 로 추정한 바 있다(1).
- 2). 총세균수에 대한 Eubacteria의 비율은 평균 67.6~88.0%로 6월에 가장 높은 비율을, 7월에 가장 낮은 비율을 나타내었다. 강우현 상에 따른 총세균수 및 Eubacteria 분포의 변화를 보면, 초기강 우 유출에 따른 육상기원의 유기물질 증가로 7월에 급격한 증가 를 보인 후 8월에 감소, 집중강우가 있었던 9월에 더욱 감소하였으며, 강우기가 끝난 10월에 세균분포의 증가를 관찰할 수 있었다.
- TNe 6월 이후 점차 증가하여 8월에 가장 높은 수치를 보였 으며, TP는 9월에 가장 높은 농도를 보여 EC와 전혀 다른 양상 을 보여주었으며, SS도 TP와 같이 점차 증가하여 9월에 가장 높은 농도를 나타내었다. 특히, 유기성 질소와 암모니아성 질소, 유 기성 인은 초기강우의 영향을 받고 있는 7월에 증가한 후 감소 하였으며, 질산성질소와 인산염인은 강우기 동안 점차 증가하여 9월에 최고 농도를 보여주고 있었다. 따라서 마산저수지에서 강우의 집중으로 인해 EC는 감소하지만, COD 등 유기물질과 영 양염류는 오히려 증가하여 나타나는 등 강우의 영향을 크게 받 았다.
후속연구
- 마산 저수지에서 세균분포의 변화와 이화학적 수질인자에 의한 영향은 기존에 보고되어진 국내외 호소의 연구 결과와 상이 하였는데, 김 등(2)은 소양호의 세균군집의 크기를 용존유기탄소, Chl-a, pH, 온도 등으로 설명가능한 정도는 43-58% 임을 지적 한 바 있어 농업용 저수지에서 환경요인에 의한 세균군집의 변화에 대해 좀더 면밀한 검토가 필요할 것으로 판단된다. 따라서, 소양호, 대청호, 팔당호 등의 대형 인공댐호에 대한 다각적 연구 못지 않게 전국적으로 18,000여 개소에 달하고 있는 중, 소규모 의 농업용저수지에서 이화학적 환경요인, 동식물 플랑크톤의 천 이 등과 관련한 각 세균군집의 생태학적 기능과 특성변화 등에 대한 이해가 중요할 것으로 판단되며, 이에 대한 체계적 연구가 계속 이루어져야 할 것으로 사료된다.
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