본 연구는 DNA수준에서 인삼의 종내 및 종간 개체간의 유전변이를 확인할 수 있는 새로운 방법인 PCR-aided RFLP를 사용하여 품종육성의 기초자료로 삼고자 수행하였다. 인삼의 엽록체 DNA중 psbA gene과 rbcL gene을 제한효소처리하여 그 band 양상을 조사하고자 하였다. Chloroplast DNA 중 psbA gene과 rbcL gene을 분리하기 위하여 각각 psbA-N, psbA-C primer 및 rbcL-N, PX-1 primer를 사용한 결과 적정 분자량인 psbA gene은 1,008bp에서, rbcL gene은 1,336 bp에서 band가 나타났다. 또한 atpB gene, rpoB gene, trn gene을 분리하기 위한 primer를 사용한 결과 역시 예상 대로 1,366bp, 900bp, 1,500bp, 1,008bp에서 band가 나타났다. PCR에 의하여 분리한 psbA gene과 rbcL gene을 sau3A, Taq1, Alu1, HaeIII 등의 제한효소로 절단하여 RFLP양상을 조사한 결과 모든 인삼에서 TaqI 제한효소 처리구에서 KG Line 과 종 및 변종간 모두 절단이 되었으며 800bp에서 band가 위치하고 있다. AluI의 제한효소 처리구에서도 KG Line과 유전자원에서 800bp인 동일한 band를 보였다. 제한효소 HaeIII에서는 KG Line의 경우 500bp의 위치에서 희미하게 band를 동일하게 보였다. 그러나 유전자원에 있어 HaeIII 제한효소처리구에서는 band가 관찰되지 않아 KG Line과 차이를 보였다. 모든 chloroplast gene은 PCR 증폭에 의하여 밴드를 형성하였으나 제한효소 처리후 각 인삼 종내 또는 종간 식별이 용이하지 않아서 좀 더 많은 제한효소를 사용하거나 증폭된 DNA를 염기서열을 분석하여 비교하는 방법이 고려 되어야 할 것으로 사료된다.
본 연구는 DNA수준에서 인삼의 종내 및 종간 개체간의 유전변이를 확인할 수 있는 새로운 방법인 PCR-aided RFLP를 사용하여 품종육성의 기초자료로 삼고자 수행하였다. 인삼의 엽록체 DNA중 psbA gene과 rbcL gene을 제한효소처리하여 그 band 양상을 조사하고자 하였다. Chloroplast DNA 중 psbA gene과 rbcL gene을 분리하기 위하여 각각 psbA-N, psbA-C primer 및 rbcL-N, PX-1 primer를 사용한 결과 적정 분자량인 psbA gene은 1,008bp에서, rbcL gene은 1,336 bp에서 band가 나타났다. 또한 atpB gene, rpoB gene, trn gene을 분리하기 위한 primer를 사용한 결과 역시 예상 대로 1,366bp, 900bp, 1,500bp, 1,008bp에서 band가 나타났다. PCR에 의하여 분리한 psbA gene과 rbcL gene을 sau3A, Taq1, Alu1, HaeIII 등의 제한효소로 절단하여 RFLP양상을 조사한 결과 모든 인삼에서 TaqI 제한효소 처리구에서 KG Line 과 종 및 변종간 모두 절단이 되었으며 800bp에서 band가 위치하고 있다. AluI의 제한효소 처리구에서도 KG Line과 유전자원에서 800bp인 동일한 band를 보였다. 제한효소 HaeIII에서는 KG Line의 경우 500bp의 위치에서 희미하게 band를 동일하게 보였다. 그러나 유전자원에 있어 HaeIII 제한효소처리구에서는 band가 관찰되지 않아 KG Line과 차이를 보였다. 모든 chloroplast gene은 PCR 증폭에 의하여 밴드를 형성하였으나 제한효소 처리후 각 인삼 종내 또는 종간 식별이 용이하지 않아서 좀 더 많은 제한효소를 사용하거나 증폭된 DNA를 염기서열을 분석하여 비교하는 방법이 고려 되어야 할 것으로 사료된다.
This study was carried out to obtain basic information on breeding using PCR-aided RFLP technology which can identify the variation inter- and intra-species of ginseng in the level of DNA. It was intended to investigate banding pattern on psbA and rbeL genes of chloroplast DNA in ginseng after treat...
This study was carried out to obtain basic information on breeding using PCR-aided RFLP technology which can identify the variation inter- and intra-species of ginseng in the level of DNA. It was intended to investigate banding pattern on psbA and rbeL genes of chloroplast DNA in ginseng after treating with restriction enzymes. To isolate psbA and rbcL genes of chloroplast, both psbA-N, psbA-C primer and rbcL-N, PX-1 primer were used. As a result, 1,008 bp band of psbA gene and 1,336 bp band of rbcL gene were appeared, which was optimal and expected molecular weight. In addition, primers to isolate atpB, rpoB, trnL, and trnF genes were used, resulting in the expected 1366, 900, 1500 and 1008 bp bands. Genes of psbA and rbcL isolated by PCR were cut by restriction enzymes, Sau3A, TaqI, AluI, HaeIII, and RFLP pattern was investigated. KG line and other species of ginseng were cut by TaqI treatment, and bands were located in 800 bp. The treatment treated by AluI also showed the same 800 bp band in KG line and other species. In HaeIII treatment, 500 bp of faint bands were shown in case of KG line, whereas any bands were not observed in other species. All chloroplast genes formed bands by PCR amplification. However, it was not evident to distinguish intra-or inter-species of ginseng after restriction enzyme treatment. Therefore, more restriction enzyme treatment or sequence comparison method should be considered for further experiment.
This study was carried out to obtain basic information on breeding using PCR-aided RFLP technology which can identify the variation inter- and intra-species of ginseng in the level of DNA. It was intended to investigate banding pattern on psbA and rbeL genes of chloroplast DNA in ginseng after treating with restriction enzymes. To isolate psbA and rbcL genes of chloroplast, both psbA-N, psbA-C primer and rbcL-N, PX-1 primer were used. As a result, 1,008 bp band of psbA gene and 1,336 bp band of rbcL gene were appeared, which was optimal and expected molecular weight. In addition, primers to isolate atpB, rpoB, trnL, and trnF genes were used, resulting in the expected 1366, 900, 1500 and 1008 bp bands. Genes of psbA and rbcL isolated by PCR were cut by restriction enzymes, Sau3A, TaqI, AluI, HaeIII, and RFLP pattern was investigated. KG line and other species of ginseng were cut by TaqI treatment, and bands were located in 800 bp. The treatment treated by AluI also showed the same 800 bp band in KG line and other species. In HaeIII treatment, 500 bp of faint bands were shown in case of KG line, whereas any bands were not observed in other species. All chloroplast genes formed bands by PCR amplification. However, it was not evident to distinguish intra-or inter-species of ginseng after restriction enzyme treatment. Therefore, more restriction enzyme treatment or sequence comparison method should be considered for further experiment.
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문제 정의
본 연구는 DNA수준에서 인삼의 종내 및 종간 개체간의 유전변이를 확인할 수 있는 새로운 방법인 PCR-aided RFLP를 사용하여 품종육성의 기초자료로 삼고자 수행하였다. 인삼의 엽록체 DNA중 psbk gene과 rbcL gene을 제한효소처리하여 그 band 양상을 조사하고자 하였다.
본 연구는 인삼의 종, 변종 및 계통간의 유전적 다양성을 PCR-aided RFLP기술을 이용하여 인삼의 품종육성을 위한 적용의 기초자료로 활용하고자 인삼의 엽록체 DNA중 atpB gene 및 rpoB gene, trnL gene 과 tmF gene, psbA gene 과 rbcL gene을 추출하여 그 중 psbA gene과 rbcL gene을 여러 제한효소로 절단하여 그 양상을 조사하였다. 또한 상기 추출한 psDAgene과 rbcL gene의 엽록체 DNA를 대상으로 하여 RAPD를 적용함으로써 그 양상을 조사하였다.
따라서 본 실험에서는 10mcr의 primer 대신 20mei. 이상의 specific primer를 사용하여 annealing temperature 높여서 매우 재현성이 높은 band를 획득하고자 하였다, 환경조건에 민감한 인삼에 있어 세포질 DNA(mt DNA, cpDNA)는 모본에 영향을 주지 않아 품종간에 세포질 DNA에 의한 차이가 있을 것으로 사료되는 바, 본 실험은 엽록체 DNA에 coding 되어 있는 psbA 및 rbcL gene을 추출하여 제한효소로 절단하여 그 절단 양상을 비교하고자 수행하였다. 사용한 인삼은 KG10L109계통 9종, 미국삼, 중국삼, 소련삼, 미마끼, 죽절삼, 황숙종, 청경종, 산양삼, 자경종둥 모두 18종 및 변종을 사용하였다.
인삼의 엽록체 DNA중 psbk gene과 rbcL gene을 제한효소처리하여 그 band 양상을 조사하고자 하였다. Chloroplast DNA 중 psbk gene과 rbcL gene을 분리하기 위하여 각각 psbA-N, psbA-C primer 및 rbcL-N, PX-1 primer를 사용한 결과 적정 분자량인 psbA genee l,008bp에서, rbcL genee 1,336 bp에서 band가 나타났다.
제안 방법
PCR에 의해서 인삼으로부터 엽록체 DNA를 합성하기 위해서 인삼 DNA 50ng과 primer 20pmol을 Premix™에 넣고 total volum을 20㎕로하여 PCR반응을 실시하였다. PCR 반응조건은 92℃의 predenaturation 온도에서 2분 반응 후 94℃ denaturation 온도에서 30초, 55 annealing 온도에서 30초, 72℃ extension 온도에서 2분간의 반응을 45 cycle로 고정하였으며 post extentione- 72℃에서 15분간 처리하였다. Data base에서 엽록체관련 유전자의 제한효소 site를 조사하여, 선발된 제한효소로 PCR product# 절단했다.
사용하였다. PCR에 의해서 인삼으로부터 엽록체 DNA를 합성하기 위해서 인삼 DNA 50ng과 primer 20pmol을 Premix™에 넣고 total volum을 20㎕로하여 PCR반응을 실시하였다. PCR 반응조건은 92℃의 predenaturation 온도에서 2분 반응 후 94℃ denaturation 온도에서 30초, 55 annealing 온도에서 30초, 72℃ extension 온도에서 2분간의 반응을 45 cycle로 고정하였으며 post extentione- 72℃에서 15분간 처리하였다.
1) Terachi 등(1994)도 9종의 Filipendula와 2종의 연관된 종들은 rbcL gene을 증폭한 후 여러종류의 제한효소로 절단하였을 때 다양한 밴드양상이 나타나서 종분류를 위한 좋은 marker가 될 수 있음을 나타내어, 16)PCR-aid RFLP방법에 의한 종간 혹은 종내의 구분이 가능할 것으로 사료되지만 인삼의 경우에는 현저한 차이를 보이지 않아 본 실험에서 사용한 제한효소로서는 어려움이 있는 것으로 판단된다. 따라서, 이와 같은 결과로 볼 때 4mer 인식 제한효소뿐만 아니라 사용폭을 넓혀 6mer 인식 제한효소등 여러종류의 제한효소를 사용하여 . 절단한다면 서로 차이가 나타나는 절편을 획득할 수 있을 것으로 사료되며, 어떤 경우에도 서로 다른 절편이 나오지 않을 경우에는 염기서열을 분석하여 분류하는 방법을 사용해야 할것으로 생각된다.
절단하여 그 양상을 조사하였다. 또한 상기 추출한 psDAgene과 rbcL gene의 엽록체 DNA를 대상으로 하여 RAPD를 적용함으로써 그 양상을 조사하였다.
Data base에서 엽록체관련 유전자의 제한효소 site를 조사하여, 선발된 제한효소로 PCR product# 절단했다. 절단 후 1.2% agarose gel에서 전기영동하여 형성된 band를 분석하였다.
대상 데이터
본 연구에 사용된 재료는 구 한국인삼연초연구원(대덕연구단지소재)에서 분양받은 유전적으로 안정화되어 계통육성된 KG 9계통과 유전자원으로 분류된 고려인삼CRzwx ginseng C. A. Meyer)과 미국삼(Panax quinquefolium C. A. Meyer), 그리고 죽절삼(Panax japonicum C. A. Meyer)을 이종간 분류에 사용하였으며, 고려인삼을 일본에서 품종화한 미마끼(Panaxginseng C. A. Meyer), 고려인삼속인 중국삼(Panax ginseng C. A. Meyer), 소련삼(Rzmx ginseng C. A. Meyer)과 고려인삼의 변종인 황숙종, 청경종, 자경종, 풍기황숙등의 잎과 뿌리를 채취하여 종 및 변종 분류에 사용하였다. 잎의 경우 인삼의 생육이 가장 왕성한 5월 전후에 상단부의 완전히 전개된엽을 사용하였고 뿌리의 경우 11월 전후에 6년근과 묘삼을 채취하여 사용하였다.
이상의 specific primer를 사용하여 annealing temperature 높여서 매우 재현성이 높은 band를 획득하고자 하였다, 환경조건에 민감한 인삼에 있어 세포질 DNA(mt DNA, cpDNA)는 모본에 영향을 주지 않아 품종간에 세포질 DNA에 의한 차이가 있을 것으로 사료되는 바, 본 실험은 엽록체 DNA에 coding 되어 있는 psbA 및 rbcL gene을 추출하여 제한효소로 절단하여 그 절단 양상을 비교하고자 수행하였다. 사용한 인삼은 KG10L109계통 9종, 미국삼, 중국삼, 소련삼, 미마끼, 죽절삼, 황숙종, 청경종, 산양삼, 자경종둥 모두 18종 및 변종을 사용하였다.
인삼의 엽록체 DNA에서 potosystcmll인 32kd protein(psbA) gene과 rubisco large subunit(rbcL) gene을 추출하여 RFLP< 실행하기 위하여 사용된 primer는 Table 1과같이 psbA-N, psbA-C, rteL-N, PX-1 을 각각 사용하였다. PCR에 의해서 인삼으로부터 엽록체 DNA를 합성하기 위해서 인삼 DNA 50ng과 primer 20pmol을 Premix™에 넣고 total volum을 20㎕로하여 PCR반응을 실시하였다.
Meyer)과 고려인삼의 변종인 황숙종, 청경종, 자경종, 풍기황숙등의 잎과 뿌리를 채취하여 종 및 변종 분류에 사용하였다. 잎의 경우 인삼의 생육이 가장 왕성한 5월 전후에 상단부의 완전히 전개된엽을 사용하였고 뿌리의 경우 11월 전후에 6년근과 묘삼을 채취하여 사용하였다. 각각의 시료는 채취 후 실험실에서 흐르는 물로 일차 깨끗이 세척한 후 3차 증류수로 헹군 다음 표피의 물기를 제거한 즉시 total DNA 분리에 이용하거나 또는 필요시 까지 -80℃의 deep fireezei에 냉동 밀폐 보관하였다.
성능/효과
2% 이상의 높은 생산증가율을 나타내어 로 인한 시장개방과 더불어 우리나라 인삼산업이 커다란 위협을 받고 있다.1,2) 또한 인삼은 뿌리부분만이 주로 사용되기 때문에 이 부분을 마쇄하거나 그 외 방법으로 가공처리한다면 형태적, 조직학적특성으로 구분하는 종래의 방법으로는 국내삼인지 타국삼인지 혹은 불량한 삼인지를 구별할 수 없다. 따라서 이러한 여건의 변화속에서 지역의 특성에 따른 고려인삼의 고품질화와 차별화와 더불어 식물의 종 및 품종간 구별을 확인할 수 있는 방법의 보완책과 시장특성에 맞는 경쟁력을 갖추어야 한다.
이러한 결과는 이(1995)가 백합의 엽록체 DNA에서 psbA와 rbcL gene을 추출하여 분리한 바 각각 유사한 banding pattern을 보여 본 실험과 유사한 결과를 보고하였고,14) Terachi 등(1994)도 서로 다른 식물체 98종 중 59종에서 psbA product가 형성되었고 rbcL 경우에는 56종의 동일한 위치에서 rbcL product가 형성되었다고 보고하여 본 실험의 결과와도 유사하였다.15) 이상의 결과에서 psbA gene을 사용한 종 및 변종간에는 1008 bp에서 유사한 1개의 band가 동일하게 보였으며, rbcL genel- 사용한 종 및 변종간에는 1,336 bp에서 동일한 1개씩의 band가 형성되었다.
따라서 이러한 여건의 변화속에서 지역의 특성에 따른 고려인삼의 고품질화와 차별화와 더불어 식물의 종 및 품종간 구별을 확인할 수 있는 방법의 보완책과 시장특성에 맞는 경쟁력을 갖추어야 한다.3) 그러나 문제점은 인삼은 환경에 민감하여 그 유전적 조성이 다양하며, 또한 현재 일반농가에서 재배되고 있는 인삼은 품종이나 계통의 구분없이 오래전부터 재배되어 왔기 때문에 뿌리를 자세히 관찰하여 보면 여러 가지.모양의 많은 유전자형을 가지고 있는 혼계상태로서 개체간의 형질변이가 대단히 심하다는 것을 알 수 있다.
인삼의 엽록체 DNA중 psbk gene과 rbcL gene을 제한효소처리하여 그 band 양상을 조사하고자 하였다. Chloroplast DNA 중 psbk gene과 rbcL gene을 분리하기 위하여 각각 psbA-N, psbA-C primer 및 rbcL-N, PX-1 primer를 사용한 결과 적정 분자량인 psbA genee l,008bp에서, rbcL genee 1,336 bp에서 band가 나타났다. 또한 atpB gene, rpoB gene, trn gene을 분리하기 위한 primeri 사용한 결과 역시 예상대로 1,366 bp, 900 bp, 1,500 bp, 1,008 bp에서 band가 나타났다.
PCR에 의하여 분리한 psbA. gene과 rbcL gene을 Sau3A, Taq1, Alu1, HaeⅢ 등의 제한효소로 절단하여 RFLP양상을 조사한 결과 모든 인삼에서 Taq1 제한효소 처리구에서 KG Line 과 종 및 변종간 모두 절단이 되었으며 800 bp에서 band가 위치하고 있다. AluⅠ의 제한효소 처리구에서도 KG Line과 유전자원에서 800 bp의 동일한 band를 보였다.
Table 1에서와 같이 psbA. gene을 분리하기 위해서는 psbNN, psbA-C primer를 그리고 rbcL gene을 분리하기 위해서는 rcL-N, PX-1 PHmer를 각각 사용하였으며, 그 외 동일한 방법으로 gene 추출을 위한 primer를 각각 사용하였고, PCR을 한 결과 psbA gene을 사용한 KG101-109에서는 1,008 bp에서 각각 유사한 1개의 band가 나타났다. rbcL gene을 사용한 KG101-109에서는 l,336bp에서 유사한 1개씩의 band가 형성되었다.
형성되었다. 또한 Fig. 2에서 atpB gene을 사용한 자경종, 미국삼, 죽절삼간에는 1,336 bp와} 900 bp에서 동일한 band양상을 보였으며, rpoB gene을 사용한 경우 1,300 bp에서 이종간 동일한 band양상을 보였다. 또한 tmL gene을 사용한 경우 자경종, 미국삼, 죽절삼간에도 1,008 bp에서와 같은 양상을 보임으로서 인삼의 엽록체에 coding되어 있음을 알 수 있었다.
2에서 atpB gene을 사용한 자경종, 미국삼, 죽절삼간에는 1,336 bp와} 900 bp에서 동일한 band양상을 보였으며, rpoB gene을 사용한 경우 1,300 bp에서 이종간 동일한 band양상을 보였다. 또한 tmL gene을 사용한 경우 자경종, 미국삼, 죽절삼간에도 1,008 bp에서와 같은 양상을 보임으로서 인삼의 엽록체에 coding되어 있음을 알 수 있었다. 이러한 결과는 이(1995)가 백합의 엽록체 DNA에서 psbA와 rbcL gene을 추출하여 분리한 바 각각 유사한 banding pattern을 보여 본 실험과 유사한 결과를 보고하였고,14) Terachi 등(1994)도 서로 다른 식물체 98종 중 59종에서 psbA product가 형성되었고 rbcL 경우에는 56종의 동일한 위치에서 rbcL product가 형성되었다고 보고하여 본 실험의 결과와도 유사하였다.
증폭된 인삼을 계통별 psbA gene 및 rbcL gene을 제한효소로 절단하여 RFLP pattern을 보고자 TaqⅠ, AluⅠ, HaeⅢ을 처리하여 2시간 동안 37℃에서 반응시킨 후 전기영동하여 band양상을 조사한 결과 TaqⅠ 제한효소 처리구에서 KG Line 과 종 및 변종간 모두 절단이 되었으며 800 bp에서 band가 위치하고 있다(Fig. 3). Alul의 제한효소 처리구에서는 KG Line 에 800 bp에서 1개의 동일한 band* 보였으나, 유전자원에서는 제한효소가 완전히 절단이 되어 band가 보이지 않았으므로 구별이 용이했다.
후속연구
1,2) 또한 인삼은 뿌리부분만이 주로 사용되기 때문에 이 부분을 마쇄하거나 그 외 방법으로 가공처리한다면 형태적, 조직학적특성으로 구분하는 종래의 방법으로는 국내삼인지 타국삼인지 혹은 불량한 삼인지를 구별할 수 없다. 따라서 이러한 여건의 변화속에서 지역의 특성에 따른 고려인삼의 고품질화와 차별화와 더불어 식물의 종 및 품종간 구별을 확인할 수 있는 방법의 보완책과 시장특성에 맞는 경쟁력을 갖추어야 한다.3) 그러나 문제점은 인삼은 환경에 민감하여 그 유전적 조성이 다양하며, 또한 현재 일반농가에서 재배되고 있는 인삼은 품종이나 계통의 구분없이 오래전부터 재배되어 왔기 때문에 뿌리를 자세히 관찰하여 보면 여러 가지.
그러나 유전자원에 있어 HaeⅢ 제한효소처리구에서는 band가 관찰되되지 않아 KG Line과 차이를 보였다. 모든 chloroplast genee PCR 증폭에 의하여 밴드를 형성하였으나 제한효소 처리후 각 인삼종내 또는 종간 식별이 용이하지 않아서 좀 더 많은 제한효소를 사용하거나 증폭된 DNA를 염기서열을 분석하여 비교하는 방법이 고려 되어야 할 것으로 사료된다.
따라서, 이와 같은 결과로 볼 때 4mer 인식 제한효소뿐만 아니라 사용폭을 넓혀 6mer 인식 제한효소등 여러종류의 제한효소를 사용하여 . 절단한다면 서로 차이가 나타나는 절편을 획득할 수 있을 것으로 사료되며, 어떤 경우에도 서로 다른 절편이 나오지 않을 경우에는 염기서열을 분석하여 분류하는 방법을 사용해야 할것으로 생각된다.
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