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문제 정의
- 또한 이 실험에서 확보한 구름버섯의 laccase, lignin peroxidase, manganese peroxidase 유전자의 조각들을 외국 균주의 해당 유전자 부분과 비교하였을 때 laccase인 Kiel의 경우 외국의 동일 균주와 매우 높은 상동성을 보인 것에 비하여 manganese peroxidase인 Kmpl 의 아미노산 서열은 외국 균주와 83-85%의 상동성을 보였으며, 이는 국내에서 분리한 미생물 자원은 외국의 동일 종과 비교할 때 난분해성 물질의 분해와 깊은 관련이 있는 세 가지 효소들의 유전자에서 고유한 유전자를 가지고 있는 것으로 확인하였다. 앞으로 이 유전자들에 대한 연구를 통하여 구름버섯이 난분해성물질을 분해하는 과정에서 관련 유전자들의 발현조절 기전을 분석하고자 한다.
제안 방법
- 방법을 확립하였다(12). 강력한 리그닌 분해능을 가진 이 균을 대상으로 관련 효소들의 유전자에 대한 연구를 수행하기 위하여 primer를 제작하고 이를 사용하여 각 효소들의 유전자 조각을 cloning하였으며 보고된 유전자와의 상동성을 비교하였다.
- 구름버섯의 LiP과 MnP들이 가지는 heme 결합부위의 염기서열을 이용하여 각 효소의 유전자를 증폭하고자 PCR을 수행한 결과 F-1과 R-1 조합에서 185 bp의 DNA band를, F-2와 R-2 조합에서 443 bp 길이의 DNA band를 확보하였고, 이들을 각각 pGEM-T vector에 cloning하였다(Fig. 4). 증폭된 185 bp의 염기서열은 Fig.
- 본 실험실에서는 강원도 동해지역에서 분리한 구름버섯을 대상으로 hygromycin B에 대한 저항성을 선택표지로 사용하는 형질전환 방법을 확립하였다(12). 강력한 리그닌 분해능을 가진 이 균을 대상으로 관련 효소들의 유전자에 대한 연구를 수행하기 위하여 primer를 제작하고 이를 사용하여 각 효소들의 유전자 조각을 cloning하였으며 보고된 유전자와의 상동성을 비교하였다.
- 6 kb 길이의 증폭된 DNA를 확인하였다 (자료 미제시). 이들의 염기서열을 분석하기 위하여 증폭된 DNA를 pGEM-T vector에 cloning하였다. P-1과 P-3 조합에서 증폭된 1.
- PCR 수행조건은 96℃에서 5분간 1회 denaturation 하고, 95℃ 1분, 5FC 2분(P-1, 3) 또는 52℃ 2분(P-1, 4), 72℃ 2분 반응을 30회 반복하였으며, 최종적으로 72℃에서 5분간 1회 증폭하였다. 증폭된 유전자 조각은 agarose gel로 분석하였고, gel로부터 elution하여 pGEM-T vector에 cloning한 후 염기서열을 분석하였다.(Me A 또는 C; Ne A, C, G, T 중 하나; R은 A 또는 G; S는 C 또는 G; Y는 C 또는 T를 나타냄)
- F-2와 R-2 조합의 경우 96℃ 5분 1회, <95℃ 1분, 60℃ 2분, 72℃ 2분>30 cycle, 72℃ 5분 1회로 증폭하였다. 증폭된 유전자 조각은 laccase의 경우와 동일하게 처리하여 염기서열을 분석하였다.
- 확인된 염기서열을 GenBank의 Database를 이용하여 보고된 효소들의 유전자와 그 상동성을 비교 분석하였다.
대상 데이터
- 구름버섯 dikaryon(9522)에서 분리된 monokaryon(9522-l)을 실험에 사용하였으며 염색체 DNA는 완전배지(12)에서 1일간 진탕배양한 균체로부터 CTAB 방법(15)으로 분리하였다. Cloning된유전자 조각의 증폭을 위하여 대장균 XLl-Blue에 형질전환 방법으로 재조합된 벡터를 도입하였다.
이론/모형
- Cloning된유전자 조각의 증폭을 위하여 대장균 XLl-Blue에 형질전환 방법으로 재조합된 벡터를 도입하였다.
성능/효과
- 염색체 DNA를 templatee., 구리결합 부위의 염기서열을 primer로 사용하는 PCR을 수행한 결과 P-1과 P-3 조합에서 약 1.3 kb와 1.4kb 길이의 조각을 확보하였고(Fig. 1), P-1과 P-4 조합에서 1.5 kb 및 1.6 kb 길이의 증폭된 DNA를 확인하였다 (자료 미제시). 이들의 염기서열을 분석하기 위하여 증폭된 DNA를 pGEM-T vector에 cloning하였다.
- 2와 같으며 이 유전자를 klcl이라 명명하였다. Kiel의 아미노산 서열을 Pleurotus ostreatus POX2 (6; GenBank Z34848), T. versicolor Lccl (10; GenBank X84683), T. villosa Lcc4 (17; GenBank L78077)의 해당부분과 비교한 결과 각각 65.7%, 97.4%, 97.1%의 상동성을 보였다(Fig. 3). 이 결과는 확보한 Kiel의 아미노산 서열이 같은 종인 7: versicolor Lccl과 가장 상동성이 높았고, 세포생리학적 특성이 매우 유사한 T.
- P-1과 P-3 조합에서 얻은 약 1.4 kb 길이의 유전자 조각의 염기서열을 분석한 결과 klcl과 달랐으며, P-1과 P-4 조합에서는 P-1 과 P-3 조합에서 얻은 각각의 유전자를 더 길게 증폭한 것으로 확인되었다(자료 미제시).
- 구리결합 부위가 잘 보존된 laccase의 경우 부위 I (P-1: 5'-CAYTGGCAYG- GNTTYTTYCA-3'; Kim 등, 2001)을 forward primer, 부위 Ⅲ (P-3: 5'-TGNCCGTGMARRTGSAANGG-3') 및 부위 IV (P-4: 5' -RT-CRATRTGGCRTGSAGGAA-3'; 1)를 reverse primer로 사용하였다. PCR 수행조건은 96℃에서 5분간 1회 denaturation 하고, 95℃ 1분, 5FC 2분(P-1, 3) 또는 52℃ 2분(P-1, 4), 72℃ 2분 반응을 30회 반복하였으며, 최종적으로 72℃에서 5분간 1회 증폭하였다. 증폭된 유전자 조각은 agarose gel로 분석하였고, gel로부터 elution하여 pGEM-T vector에 cloning한 후 염기서열을 분석하였다.
- 이 실험을 통하여 LiP과 MnP들이 공통적으로 가지는 heme-binding domain의 염기서열을 PCR primer로 사용할 수 있음이 확인되었다. 또한 이 실험에서 확보한 구름버섯의 laccase, lignin peroxidase, manganese peroxidase 유전자의 조각들을 외국 균주의 해당 유전자 부분과 비교하였을 때 laccase인 Kiel의 경우 외국의 동일 균주와 매우 높은 상동성을 보인 것에 비하여 manganese peroxidase인 Kmpl 의 아미노산 서열은 외국 균주와 83-85%의 상동성을 보였으며, 이는 국내에서 분리한 미생물 자원은 외국의 동일 종과 비교할 때 난분해성 물질의 분해와 깊은 관련이 있는 세 가지 효소들의 유전자에서 고유한 유전자를 가지고 있는 것으로 확인하였다. 앞으로 이 유전자들에 대한 연구를 통하여 구름버섯이 난분해성물질을 분해하는 과정에서 관련 유전자들의 발현조절 기전을 분석하고자 한다.
- 3). 이 결과는 확보한 Kiel의 아미노산 서열이 같은 종인 7: versicolor Lccl과 가장 상동성이 높았고, 세포생리학적 특성이 매우 유사한 T. villosa의 Lcc4와도 높은 상동성을 보인 반면 느타리 버섯균의 laccase와는 상대적으로 낮은 상동성을 보였다.
- Blue copper oxidase라고도 알려진 laccase는 구리 결합 부위가 잘 보존되어 있으므로 해당지역의 염기서열을 PCR primer로 사용하여 유전자 조각의 증폭이 가능하다. 이 실험을 통하여 LiP과 MnP들이 공통적으로 가지는 heme-binding domain의 염기서열을 PCR primer로 사용할 수 있음이 확인되었다. 또한 이 실험에서 확보한 구름버섯의 laccase, lignin peroxidase, manganese peroxidase 유전자의 조각들을 외국 균주의 해당 유전자 부분과 비교하였을 때 laccase인 Kiel의 경우 외국의 동일 균주와 매우 높은 상동성을 보인 것에 비하여 manganese peroxidase인 Kmpl 의 아미노산 서열은 외국 균주와 83-85%의 상동성을 보였으며, 이는 국내에서 분리한 미생물 자원은 외국의 동일 종과 비교할 때 난분해성 물질의 분해와 깊은 관련이 있는 세 가지 효소들의 유전자에서 고유한 유전자를 가지고 있는 것으로 확인하였다.
- 4). 증폭된 185 bp의 염기서열은 Fig. 5A와 같으며, LiP으로 추정되는 Klpl 의 아미노산 서열을 P- chrysosporium LiPl(16; GenBank AAD02880), T. versicolor LiPl(9; GenBank S32581), LiP2(9; GenBank S47649) 의 해당부분과 비교한 결과 각각 80%, 95%, 85%의 상동성을 보였다(Fig. 5B). kip]의 17번째 codon GNC가 다른 LiP의 경우와 같이 GGC가 되어 glycine이 된다면 T.
- 증폭된 443bp의 염기서열은 Fig. 6에 정리하였으며 MnP로 추정되는 Kmpl의 아미노산 서열을 P. chrysosporium MnP 1(7;GenBank JH0156), T. versicolor MNP2 (GenBank AAD02880; unpublished)와 MP2 (8; GenBank CAA83148)의 해당부분과 비교한 결과 각각 61%, 85%, 83%의 상동성을 보였다(Fig. 7). Blue copper oxidase라고도 알려진 laccase는 구리 결합 부위가 잘 보존되어 있으므로 해당지역의 염기서열을 PCR primer로 사용하여 유전자 조각의 증폭이 가능하다.
후속연구
- 5%의 높은 상동성을 보인다. F-1과 R-1 조합으로 증폭된 유전자 조각이 상대적으로 짧아 다른 LiP들과높은 상동성을 보인 것으로 판단되며, 더 긴 유전자를 확보하여 분석한다면 다음의 MnP 경우와 같이 60-85% 정도의 상동성을 보일 것으로 판단된다.
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