고추냉이에 모자이크 병징을 나타내는 이병주로부터 고추냉이 모자이크 바이러스를 분리하였다. 고추냉이 모자이크 바이러스의 genomic RNA를 추출하여 전체 유전자 구조를 결정하였다. 유전자 전체길이는 6,298 염기를 가지고 있었으며, 4개 ORF로 구성 되어 있었다. ORF 1은 180KD 단백질, ORF 2는 130KD 단백질 , ORF 3은 30KD 단백질, ORF4는 18KD로 외피단백질로 구성되어 있었다. ORF 유전자간에는 ORF4와 ORF 3 유전자간 130개의 염기, ORF 2와 ORF 3 유전자갈 20개 염기 그리고 ORF 1 과 ORF2 유전자간에는 40개의 염기로 overlaps되어 있었다 3'NCR부분은 238개 염기, 외피단백질은 537개 염기, 30KD 이동단백질은 825개 염기, 130KD 단백질은 1,896개 염기와 180k단백질의 2,958개의 염기로 구성되어 있었다. TMV-WTF전체 염기 서열의 유전자 상동성에서는 비교 유전자에서 미보고된 일본의 TMV-WSF와 러시아의 TMV-crucifer와 각각 98.6%와 82.4%로 매우 높았다.
고추냉이에 모자이크 병징을 나타내는 이병주로부터 고추냉이 모자이크 바이러스를 분리하였다. 고추냉이 모자이크 바이러스의 genomic RNA를 추출하여 전체 유전자 구조를 결정하였다. 유전자 전체길이는 6,298 염기를 가지고 있었으며, 4개 ORF로 구성 되어 있었다. ORF 1은 180KD 단백질, ORF 2는 130KD 단백질 , ORF 3은 30KD 단백질, ORF4는 18KD로 외피단백질로 구성되어 있었다. ORF 유전자간에는 ORF4와 ORF 3 유전자간 130개의 염기, ORF 2와 ORF 3 유전자갈 20개 염기 그리고 ORF 1 과 ORF2 유전자간에는 40개의 염기로 overlaps되어 있었다 3'NCR부분은 238개 염기, 외피단백질은 537개 염기, 30KD 이동단백질은 825개 염기, 130KD 단백질은 1,896개 염기와 180k단백질의 2,958개의 염기로 구성되어 있었다. TMV-WTF전체 염기 서열의 유전자 상동성에서는 비교 유전자에서 미보고된 일본의 TMV-WSF와 러시아의 TMV-crucifer와 각각 98.6%와 82.4%로 매우 높았다.
Genomic RNA sequence of a tobamovirus infecting Eutrema wasabi plant(TMV-W) was determined. The RNA is composed 6,298 nucleotide and contains four OREs encoding the protein of 180KD(OREI), 130KD(ORE2),30KD(ORF3) and 18KD(coat protein, ORF4). ORE4, ORF 3, ORF 2 and ORF 1 are overlaped by 130, 20 and ...
Genomic RNA sequence of a tobamovirus infecting Eutrema wasabi plant(TMV-W) was determined. The RNA is composed 6,298 nucleotide and contains four OREs encoding the protein of 180KD(OREI), 130KD(ORE2),30KD(ORF3) and 18KD(coat protein, ORF4). ORE4, ORF 3, ORF 2 and ORF 1 are overlaped by 130, 20 and 40 nucleotides, and the overapping region can be folded into a stable hairpin styucture. This includes the 3'non-coding region of 238 nucleotides, coat protein gene(537 nucleotides,179 amino acid), 30KD movement protein gene(825 nucleotides, 275 amino acid), 13(IKD protein gene(1,896 nucleotides, 632 amino acid) and 180KD protein gene(2,958 nucleotides, 986 amino acid). The genomic RNA sequence was compared with homologous regions of eleven other tobamoviruses. TMV-WTE was similar to TMV-WSF(98.6%) in nucleotide sequence.
Genomic RNA sequence of a tobamovirus infecting Eutrema wasabi plant(TMV-W) was determined. The RNA is composed 6,298 nucleotide and contains four OREs encoding the protein of 180KD(OREI), 130KD(ORE2),30KD(ORF3) and 18KD(coat protein, ORF4). ORE4, ORF 3, ORF 2 and ORF 1 are overlaped by 130, 20 and 40 nucleotides, and the overapping region can be folded into a stable hairpin styucture. This includes the 3'non-coding region of 238 nucleotides, coat protein gene(537 nucleotides,179 amino acid), 30KD movement protein gene(825 nucleotides, 275 amino acid), 13(IKD protein gene(1,896 nucleotides, 632 amino acid) and 180KD protein gene(2,958 nucleotides, 986 amino acid). The genomic RNA sequence was compared with homologous regions of eleven other tobamoviruses. TMV-WTE was similar to TMV-WSF(98.6%) in nucleotide sequence.
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문제 정의
노산 배열이 유사하다고 보고하였다. 그러나 고추냉이 에 대한 바이 러스 유전자 연구로는 일본의 Shimamoto(1998)등이 고추냉이에서 분리한 TMV 유전자의 CP와 180KD 단백질의 일부인 3 '말단의 2, 378개의 염기를 분석하여 다른 바이러스간 유전자비교를 하였으나, 아직 고추냉이에서 TMV를 분리하여 전체 유전자 구조를 밝힌바 없어 이 연구에서는 고추냉 이에 감염된 TMV를 분리 하여 전체 RNA 유전자 염기 서열을 결정하고 같은 계통의 바이러스간 유전자 상동성 을 비 교하고자 실시하였다.
제안 방법
coli JM 109 competent cell에 형질전환시켰다. Clone의 선발은 K3 와 K5 primer를 이용하여약6.5Kb의 insert를 확인 선발하고, 재조합 plasmid는 SDS-alkaline 용해방법으로 추출하여 1.0% agarose 상에서 전기영동하여 재확인하였다. 5'말단의 염기구조의 결정 은 5' -AmpliFinder RACE kit, subcloning 은 phamacia double-stranded nested deletion kit를 이용설명서에 준하여 실시하였다.
바이 러 스 정 제 RNA 추출 TMV 정제는 고추냉이에 중식 된 잎을 이 용 Otsuki 등(1977)의 방법을 수정하여 실시하였다. 바이러스의 RNA 추출은 정제된 바이 러 스를 SDS-phenol 추출법 에 따라 추출하고 저온 진공 건조시 켜 증류수(RNase free) 50 μl에 용해시켜 재 료로사용하였다.
염 기 서 열 자료의 분석 은 GENETYX-WIN 프로그램 을 이용하여 분석하였다. 분석 에 사용된 바이러스의 유전자원은 중국계통의 DDBJ와 GeneBank 에 등록되어 있는 AF395128(TMV-017), AF395129(- 152), AJO 11933(-VF), 러시아 계통 Z29370(-crucifer), TMO243571(-K1), Z92909(-K2), 영 국 계 통 AX040174(-Ul), AX040175(-U2), 한국계 통 X68110(- CG, tobacco), L35073(-T, pepper), L35074(-P, pepper), 그리고 아직 보고되지 않은 일본 계통으로 TMV- WSF의 유전자를 비교 분석하였다.
l에서 보는 바와 같이 약6, 500bp 의 부근에 TMV 바이 러스 전체 유전자가 증폭되었다. 증폭된 PCR 산물을 이용하여 pT7 blue 벡터 에 클로닝하여 pCRTl, 2, 3, 5를 얻어 subcloning하여 염 기서 열을 결정하였다. 그 결과 바이 러스 genomic RNA 는 4개의 ORF 유전자를 가지고 있었다.
대상 데이터
공시 바이 러스 바이러스원은 1999년부터 2002년 전라북도 무주지방에서 재배되고 있는 고추냉이 (달마)를 대상으로 바이러스 병증이 뚜렷한 개체를수집 하여 효소결 합항체 법 에 따라 TMV의 감염 여 부를 확인하고 Chenopodium amaranticola에 5회 재접종하고 단일 spot를 채취하여 고추냉이(달마)의 잎에 재접 종 증식하여 이용하였다.
2). 그러나 180K 유전자와 130K 유전자 사이 40염기, 130KD 유전자와 30KD 유전자사이 20염 기 그리고 30KD 유전자와 CP사이 130염기가 overrapping되어 실제 염기는 총 6, 298염 기 로 구성되어 있었다. TMV-WMJ계통유전자의 3' NCR의 stop codone 3' NCR과 CP 사이의 UAA이 었으며 , 30KD와 CPA}o] 5] stop codone UGA와 UAA, 130KD와 30KD는 UAA와 UGA, 180KD과 130KD는 UAA였다.
Co.의 cDNA Kit를 이용하였다. 이때 이용된 primer는 random과 oligo(dT) primer, Kpnl과 BbrPI 효소 절단부위를 삽입시 킨 K3(5' TTTggTACCACgTggg C* CCCTACCCggggTTgA3 ), K5(AACAACAA CATggCACAATTTCAA)> 이용하였다.
의 cDNA Kit를 이용하였다. 이때 이용된 primer는 random과 oligo(dT) primer, Kpnl과 BbrPI 효소 절단부위를 삽입시 킨 K3(5' TTTggTACCACgTggg C* CCCTACCCggggTTgA3 ), K5(AACAACAA CATggCACAATTTCAA)> 이용하였다. 합성된 cDNA는 pT7 Blue 벡터에 cloning하고 재조합된 plasmid는 E.
데이터처리
염 기 서 열 자료의 분석 은 GENETYX-WIN 프로그램 을 이용하여 분석하였다. 분석 에 사용된 바이러스의 유전자원은 중국계통의 DDBJ와 GeneBank 에 등록되어 있는 AF395128(TMV-017), AF395129(- 152), AJO 11933(-VF), 러시아 계통 Z29370(-crucifer), TMO243571(-K1), Z92909(-K2), 영 국 계 통 AX040174(-Ul), AX040175(-U2), 한국계 통 X68110(- CG, tobacco), L35073(-T, pepper), L35074(-P, pepper), 그리고 아직 보고되지 않은 일본 계통으로 TMV- WSF의 유전자를 비교 분석하였다.
이론/모형
0% agarose 상에서 전기영동하여 재확인하였다. 5'말단의 염기구조의 결정 은 5' -AmpliFinder RACE kit, subcloning 은 phamacia double-stranded nested deletion kit를 이용설명서에 준하여 실시하였다.
DNA 염 기서 열 결정 과 분석 염기서열 결정 은 dideoxynucleotide chain termination 법 에 따라 perkin elmer 사의 유전자분석기(ABI377)를 이용하여 결정하였다. 염 기 서 열 자료의 분석 은 GENETYX-WIN 프로그램 을 이용하여 분석하였다.
실시하였다. 바이러스의 RNA 추출은 정제된 바이 러 스를 SDS-phenol 추출법 에 따라 추출하고 저온 진공 건조시 켜 증류수(RNase free) 50 μl에 용해시켜 재 료로사용하였다.
성능/효과
4%, 나머지 계 통과는 60%정도의 상동성을 보여 주었다. 130KD 유전자는 TMV WSF와 97.9%, TMV-crucifer와는 82.8%의 상동성 을 보여 주었다(Table 2). 이상의 결과를 종합하여보면 고추냉이에서 분리한 TMV-WTF 계통은 미보고된 일본의 TMV-WSF와 러 시 아의 TMV-crucifer와 유전 자의 상동성이 가장 높은 것으로 나타났다.
9%로 가장 낮았다. CP는 비 교유 전자 간 51-100%까지 상동성이 있었으나 TMV- WTF는 미 보고된 일 본의 TMV-WSF와 96.8%로 가장높았으며 다음으로 러시아의 TMV-crucifer와 86.3% 로 높았다. 그러나 다른 계통과는 53% 정도의 상동 성을 보여 낮은 편이었다.
증폭된 PCR 산물을 이용하여 pT7 blue 벡터 에 클로닝하여 pCRTl, 2, 3, 5를 얻어 subcloning하여 염 기서 열을 결정하였다. 그 결과 바이 러스 genomic RNA 는 4개의 ORF 유전자를 가지고 있었다. 이러한 결과는 Lartey 등(1995)이 보고한 바이 러스의 유전자 구조와 같은 5' 말단부터 180KD, 130KD, 30KD, coat protein과 3' non-coding region(NCR)으로 구성 되 어있었다는 결과와 일치 하였다.
2%로 높았으나 다른 계통간에는 51%정도의 상동을 보여 아주 낮은 상동을 나타내 었 다(Table 1). 또한 180KD 유전의 비 교에서도 CP와 마찬가지로 TMV-WSF와 96.8%로 가장 높았으며 TMV-crucifer와는 79.4%, 나머지 계 통과는 60%정도의 상동성을 보여 주었다. 130KD 유전자는 TMV WSF와 97.
이상의 결과를 종합하여보면 고추냉이에서 분리한 TMV-WTF 계통은 미보고된 일본의 TMV-WSF와 러 시 아의 TMV-crucifer와 유전 자의 상동성이 가장 높은 것으로 나타났다. 또한 유 전자의 상동성 을 GENETYX-WIN 프로그램의 UPGMA 방법으로 유연 관계를 도식 화 한 결과 Fig.3에서 나타난 바와 같이 크게 TMV 바이 러 스가 TMVUl,- VF, -CG, -017, -152 그룹, -KI, -K2 그룹, -P, -T 그룹, U2, 그리고 -WSF, -WTF, -crucifer 5그룹으로 분류 되 었으나 상동성 에서 보여 주었던 것과 마찬가지로 고추냉이에서 분리한 TMV-WTF분리주는 미 보고된 일본의 -WSF와 러 시 아의 -crucifer 계통과 같은 그룹으로 분류되었다.
바이러스 유전자구조 정제된 바이러스의 RNA 로부터 제작된 primer K3와 K5를 가지고 전기영동을 하여본 결과 Fig.l에서 보는 바와 같이 약6, 500bp 의 부근에 TMV 바이 러스 전체 유전자가 증폭되었다. 증폭된 PCR 산물을 이용하여 pT7 blue 벡터 에 클로닝하여 pCRTl, 2, 3, 5를 얻어 subcloning하여 염 기서 열을 결정하였다.
유전자 상동성의 비교에서 전체 유전자는 TMV- WSF와 98.6%, TMV-crucifer 계 통과 82.4%로 높았고 TMV-K1 계 통과는 54.9%로 가장 낮았다. CP는 비 교유 전자 간 51-100%까지 상동성이 있었으나 TMV- WTF는 미 보고된 일 본의 TMV-WSF와 96.
8%의 상동성 을 보여 주었다(Table 2). 이상의 결과를 종합하여보면 고추냉이에서 분리한 TMV-WTF 계통은 미보고된 일본의 TMV-WSF와 러 시 아의 TMV-crucifer와 유전 자의 상동성이 가장 높은 것으로 나타났다. 또한 유 전자의 상동성 을 GENETYX-WIN 프로그램의 UPGMA 방법으로 유연 관계를 도식 화 한 결과 Fig.
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