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문제 정의
- 노산 배열이 유사하다고 보고하였다. 그러나 고추냉이 에 대한 바이 러스 유전자 연구로는 일본의 Shimamoto(1998)등이 고추냉이에서 분리한 TMV 유전자의 CP와 180KD 단백질의 일부인 3 '말단의 2, 378개의 염기를 분석하여 다른 바이러스간 유전자비교를 하였으나, 아직 고추냉이에서 TMV를 분리하여 전체 유전자 구조를 밝힌바 없어 이 연구에서는 고추냉 이에 감염된 TMV를 분리 하여 전체 RNA 유전자 염기 서열을 결정하고 같은 계통의 바이러스간 유전자 상동성 을 비 교하고자 실시하였다.
제안 방법
- coli JM 109 competent cell에 형질전환시켰다. Clone의 선발은 K3 와 K5 primer를 이용하여약6.5Kb의 insert를 확인 선발하고, 재조합 plasmid는 SDS-alkaline 용해방법으로 추출하여 1.0% agarose 상에서 전기영동하여 재확인하였다. 5'말단의 염기구조의 결정 은 5' -AmpliFinder RACE kit, subcloning 은 phamacia double-stranded nested deletion kit를 이용설명서에 준하여 실시하였다.
- 바이 러 스 정 제 RNA 추출 TMV 정제는 고추냉이에 중식 된 잎을 이 용 Otsuki 등(1977)의 방법을 수정하여 실시하였다. 바이러스의 RNA 추출은 정제된 바이 러 스를 SDS-phenol 추출법 에 따라 추출하고 저온 진공 건조시 켜 증류수(RNase free) 50 μl에 용해시켜 재 료로사용하였다.
- 염 기 서 열 자료의 분석 은 GENETYX-WIN 프로그램 을 이용하여 분석하였다. 분석 에 사용된 바이러스의 유전자원은 중국계통의 DDBJ와 GeneBank 에 등록되어 있는 AF395128(TMV-017), AF395129(- 152), AJO 11933(-VF), 러시아 계통 Z29370(-crucifer), TMO243571(-K1), Z92909(-K2), 영 국 계 통 AX040174(-Ul), AX040175(-U2), 한국계 통 X68110(- CG, tobacco), L35073(-T, pepper), L35074(-P, pepper), 그리고 아직 보고되지 않은 일본 계통으로 TMV- WSF의 유전자를 비교 분석하였다.
- l에서 보는 바와 같이 약6, 500bp 의 부근에 TMV 바이 러스 전체 유전자가 증폭되었다. 증폭된 PCR 산물을 이용하여 pT7 blue 벡터 에 클로닝하여 pCRTl, 2, 3, 5를 얻어 subcloning하여 염 기서 열을 결정하였다. 그 결과 바이 러스 genomic RNA 는 4개의 ORF 유전자를 가지고 있었다.
대상 데이터
- 공시 바이 러스 바이러스원은 1999년부터 2002년 전라북도 무주지방에서 재배되고 있는 고추냉이 (달마)를 대상으로 바이러스 병증이 뚜렷한 개체를수집 하여 효소결 합항체 법 에 따라 TMV의 감염 여 부를 확인하고 Chenopodium amaranticola에 5회 재접종하고 단일 spot를 채취하여 고추냉이(달마)의 잎에 재접 종 증식하여 이용하였다.
- 2). 그러나 180K 유전자와 130K 유전자 사이 40염기, 130KD 유전자와 30KD 유전자사이 20염 기 그리고 30KD 유전자와 CP사이 130염기가 overrapping되어 실제 염기는 총 6, 298염 기 로 구성되어 있었다. TMV-WMJ계통유전자의 3' NCR의 stop codone 3' NCR과 CP 사이의 UAA이 었으며 , 30KD와 CPA}o] 5] stop codone UGA와 UAA, 130KD와 30KD는 UAA와 UGA, 180KD과 130KD는 UAA였다.
- Co.의 cDNA Kit를 이용하였다. 이때 이용된 primer는 random과 oligo(dT) primer, Kpnl과 BbrPI 효소 절단부위를 삽입시 킨 K3(5' TTTggTACCACgTggg C* CCCTACCCggggTTgA3 ), K5(AACAACAA CATggCACAATTTCAA)> 이용하였다.
- 의 cDNA Kit를 이용하였다. 이때 이용된 primer는 random과 oligo(dT) primer, Kpnl과 BbrPI 효소 절단부위를 삽입시 킨 K3(5' TTTggTACCACgTggg C* CCCTACCCggggTTgA3 ), K5(AACAACAA CATggCACAATTTCAA)> 이용하였다. 합성된 cDNA는 pT7 Blue 벡터에 cloning하고 재조합된 plasmid는 E.
데이터처리
- 염 기 서 열 자료의 분석 은 GENETYX-WIN 프로그램 을 이용하여 분석하였다. 분석 에 사용된 바이러스의 유전자원은 중국계통의 DDBJ와 GeneBank 에 등록되어 있는 AF395128(TMV-017), AF395129(- 152), AJO 11933(-VF), 러시아 계통 Z29370(-crucifer), TMO243571(-K1), Z92909(-K2), 영 국 계 통 AX040174(-Ul), AX040175(-U2), 한국계 통 X68110(- CG, tobacco), L35073(-T, pepper), L35074(-P, pepper), 그리고 아직 보고되지 않은 일본 계통으로 TMV- WSF의 유전자를 비교 분석하였다.
이론/모형
- 0% agarose 상에서 전기영동하여 재확인하였다. 5'말단의 염기구조의 결정 은 5' -AmpliFinder RACE kit, subcloning 은 phamacia double-stranded nested deletion kit를 이용설명서에 준하여 실시하였다.
- DNA 염 기서 열 결정 과 분석 염기서열 결정 은 dideoxynucleotide chain termination 법 에 따라 perkin elmer 사의 유전자분석기(ABI377)를 이용하여 결정하였다. 염 기 서 열 자료의 분석 은 GENETYX-WIN 프로그램 을 이용하여 분석하였다.
- 실시하였다. 바이러스의 RNA 추출은 정제된 바이 러 스를 SDS-phenol 추출법 에 따라 추출하고 저온 진공 건조시 켜 증류수(RNase free) 50 μl에 용해시켜 재 료로사용하였다.
성능/효과
- 4%, 나머지 계 통과는 60%정도의 상동성을 보여 주었다. 130KD 유전자는 TMV WSF와 97.9%, TMV-crucifer와는 82.8%의 상동성 을 보여 주었다(Table 2). 이상의 결과를 종합하여보면 고추냉이에서 분리한 TMV-WTF 계통은 미보고된 일본의 TMV-WSF와 러 시 아의 TMV-crucifer와 유전 자의 상동성이 가장 높은 것으로 나타났다.
- 9%로 가장 낮았다. CP는 비 교유 전자 간 51-100%까지 상동성이 있었으나 TMV- WTF는 미 보고된 일 본의 TMV-WSF와 96.8%로 가장높았으며 다음으로 러시아의 TMV-crucifer와 86.3% 로 높았다. 그러나 다른 계통과는 53% 정도의 상동 성을 보여 낮은 편이었다.
- 증폭된 PCR 산물을 이용하여 pT7 blue 벡터 에 클로닝하여 pCRTl, 2, 3, 5를 얻어 subcloning하여 염 기서 열을 결정하였다. 그 결과 바이 러스 genomic RNA 는 4개의 ORF 유전자를 가지고 있었다. 이러한 결과는 Lartey 등(1995)이 보고한 바이 러스의 유전자 구조와 같은 5' 말단부터 180KD, 130KD, 30KD, coat protein과 3' non-coding region(NCR)으로 구성 되 어있었다는 결과와 일치 하였다.
- 2%로 높았으나 다른 계통간에는 51%정도의 상동을 보여 아주 낮은 상동을 나타내 었 다(Table 1). 또한 180KD 유전의 비 교에서도 CP와 마찬가지로 TMV-WSF와 96.8%로 가장 높았으며 TMV-crucifer와는 79.4%, 나머지 계 통과는 60%정도의 상동성을 보여 주었다. 130KD 유전자는 TMV WSF와 97.
- 이상의 결과를 종합하여보면 고추냉이에서 분리한 TMV-WTF 계통은 미보고된 일본의 TMV-WSF와 러 시 아의 TMV-crucifer와 유전 자의 상동성이 가장 높은 것으로 나타났다. 또한 유 전자의 상동성 을 GENETYX-WIN 프로그램의 UPGMA 방법으로 유연 관계를 도식 화 한 결과 Fig.3에서 나타난 바와 같이 크게 TMV 바이 러 스가 TMVUl,- VF, -CG, -017, -152 그룹, -KI, -K2 그룹, -P, -T 그룹, U2, 그리고 -WSF, -WTF, -crucifer 5그룹으로 분류 되 었으나 상동성 에서 보여 주었던 것과 마찬가지로 고추냉이에서 분리한 TMV-WTF분리주는 미 보고된 일본의 -WSF와 러 시 아의 -crucifer 계통과 같은 그룹으로 분류되었다.
- 바이러스 유전자구조 정제된 바이러스의 RNA 로부터 제작된 primer K3와 K5를 가지고 전기영동을 하여본 결과 Fig.l에서 보는 바와 같이 약6, 500bp 의 부근에 TMV 바이 러스 전체 유전자가 증폭되었다. 증폭된 PCR 산물을 이용하여 pT7 blue 벡터 에 클로닝하여 pCRTl, 2, 3, 5를 얻어 subcloning하여 염 기서 열을 결정하였다.
- 유전자 상동성의 비교에서 전체 유전자는 TMV- WSF와 98.6%, TMV-crucifer 계 통과 82.4%로 높았고 TMV-K1 계 통과는 54.9%로 가장 낮았다. CP는 비 교유 전자 간 51-100%까지 상동성이 있었으나 TMV- WTF는 미 보고된 일 본의 TMV-WSF와 96.
- 8%의 상동성 을 보여 주었다(Table 2). 이상의 결과를 종합하여보면 고추냉이에서 분리한 TMV-WTF 계통은 미보고된 일본의 TMV-WSF와 러 시 아의 TMV-crucifer와 유전 자의 상동성이 가장 높은 것으로 나타났다. 또한 유 전자의 상동성 을 GENETYX-WIN 프로그램의 UPGMA 방법으로 유연 관계를 도식 화 한 결과 Fig.
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