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문제 정의
- 본 연구에서는 생물계면활성제 용액의 pH 변화가 phenanthrene의 용해도 증가에 미치는 영향을 수용 액상 시스템에서 조사하고자 하며, RAHs-분해균주를 이용하여 phenanthrene을 분해할 경우 이러한 용해도의 변화가 분해균주의 활성과 전체 분해율에 주는 영향을 파악하고자 한다.
제안 방법
- Phenanthrene^] 전체 분해율은 5일 배양한 용액에 40 ml의 chloroform을 첨가하여 liquid-liquid extraction 후 chloroform 층으로 이동한 phenan thren의 양을 HPLC를 이용하여 분석하였다. HPLC 분석은 35 % water와 65 % acetonitrile을 mobile phase로 이용하였고 Iml/min으로 주입, UV detector를 이용하여 실시하였다.
- 생장속도를 관찰하기 위해서 일정시간 간격으로 샘플을 채취하여 standard method(APHA et al, 1992)에 따라 표면평판법을 실시하여 개체수를 관찰하였다. Phenanthrene^] 전체 분해율은 5일 배양한 용액에 40 ml의 chloroform을 첨가하여 liquid-liquid extraction 후 chloroform 층으로 이동한 phenan thren의 양을 HPLC를 이용하여 분석하였다. HPLC 분석은 35 % water와 65 % acetonitrile을 mobile phase로 이용하였고 Iml/min으로 주입, UV detector를 이용하여 실시하였다.
- 용액 20 ml와 100 mg 의 phenanthrene을 45 ml centrifuge tubes 에 주입 후 orbital shaker에서 48 hr 동안 반응시켰다. 교반 종료 후 4000rpm에서 10분 동안 원심분리 후 상등액내로 용해되어진 phenanthrene의 양을 HPLC(High Performance Liquid Chromatography)를 이용하여 분석하였다. 또한, pH 변화가 phenanthrene의 solu- bilization에 미치는 영향을 조사하기 위해서는 240 ppm과 2000 ppm의 rhamnolipid 용액을 제조 후, NaOH와 HCI 을 이용하여 용액의 pH를 4~7.
- 대표적인 생물계면활성제인 rhamnolipid와 비이온계 계면활성제인 Tween 80의 phenanthrene에 대한 so lubilization capacity를 조사하기 위해서 다양한 농도의 계면활성제 용액을 제조하였다. 용액 20 ml와 100 mg 의 phenanthrene을 45 ml centrifuge tubes 에 주입 후 orbital shaker에서 48 hr 동안 반응시켰다.
- 교반 종료 후 4000rpm에서 10분 동안 원심분리 후 상등액내로 용해되어진 phenanthrene의 양을 HPLC(High Performance Liquid Chromatography)를 이용하여 분석하였다. 또한, pH 변화가 phenanthrene의 solu- bilization에 미치는 영향을 조사하기 위해서는 240 ppm과 2000 ppm의 rhamnolipid 용액을 제조 후, NaOH와 HCI 을 이용하여 용액의 pH를 4~7.5로 조절하여 20ml씩 주입하였다. 이러한 실험은 centrifuge vial과 플라스크를 이용하여 동시에 실시하였으며, 플라스크를 이용한 실험은 생분해 실험에 적용되어질 농도인 240 ppm의 rhamnolipid 용액에만 적용되었다.
- 분해균 주의 생장곡선을 pH에 따라 조사하고, 대수기 (expo nential phase)의 개체수 변화를 linear regression 한 결과로부터 비성장률(specific growth rate)을 계산하였다(Table 1). 최대 비성장률은 pH 6에서 나타났지만, pH 5-7 범위에서 크게 변화하지 않았다.
- 생물계면활성제로 인한 phenanthrene solublization기작이 평형에 도달하는 시간을 확인하기 위해, 플라스크를 이용한 회분식 실험을 실시하였다. 유기용매인 chloroform에 일정량의 phenanthrene을 첨가한 후 이용액을 125 ml flask의 내부에 주입함으로써 phenan threne layer가 생성되도록 하였다(Zhang et al.
- 생물계면활성제와 같은 첨가제가 존재하지 않는 조건에서, pH의 변화가 phenanthrene 분해균주인 CRE 7의 생장률과 분해능에 주는 영향을 조사하였다. 분해균 주의 생장곡선을 pH에 따라 조사하고, 대수기 (expo nential phase)의 개체수 변화를 linear regression 한 결과로부터 비성장률(specific growth rate)을 계산하였다(Table 1).
- , 1997). 용매가 휘발되도록 일정시간 방치한 후 30ppm과 240 ppm rhamnolipid 용액 20 ml와 반응하게 한 후 일정 시간 간격으로 수용액상으로 용해되어 나온 phenanthrene의 농도를 측정하였다.
- 유일 탄소원으로서의 phenanthrene 이용 정도를 알아보기 위해 전체 분해정도를 측정하였고, phenanthrene을 이용하는 균주의 생장률(growth rate) 을 조사하기 위해 표면평판법 (spread plate count)을 이용하여 균주 개체수를 측정하였다. 용해기작의 평형 시간을 측정한 실험과 같은 방법으로 플라스크 내에 phenanthrene layer를 만들고, NaOH와 HC1 을 이용하여 rhamnolipid를 포함한 또는 포함하지 않은 Mineral Salt Medium(MSM)(Zhang et aL} 1997) 의 pH를 4~8로 조절 후 20 ml 씩 주입하였다. 균주는 미리 배양한 후, 초기 개체수가 106cfu/ml 정도가 되도록 접종하였고, 150 rpm, 25℃ 조건에서 5일 동안 배양하였다.
- 유기용매인 chloroform에 일정량의 phenanthrene을 첨가한 후 이용액을 125 ml flask의 내부에 주입함으로써 phenan threne layer가 생성되도록 하였다(Zhang et al., 1997). 용매가 휘발되도록 일정시간 방치한 후 30ppm과 240 ppm rhamnolipid 용액 20 ml와 반응하게 한 후 일정 시간 간격으로 수용액상으로 용해되어 나온 phenanthrene의 농도를 측정하였다.
- 조사하였다. 유일 탄소원으로서의 phenanthrene 이용 정도를 알아보기 위해 전체 분해정도를 측정하였고, phenanthrene을 이용하는 균주의 생장률(growth rate) 을 조사하기 위해 표면평판법 (spread plate count)을 이용하여 균주 개체수를 측정하였다. 용해기작의 평형 시간을 측정한 실험과 같은 방법으로 플라스크 내에 phenanthrene layer를 만들고, NaOH와 HC1 을 이용하여 rhamnolipid를 포함한 또는 포함하지 않은 Mineral Salt Medium(MSM)(Zhang et aL} 1997) 의 pH를 4~8로 조절 후 20 ml 씩 주입하였다.
- 2). 이러한 평형 실험 결과를 바탕으로, 이후 진행되어진 solubilization 실험들은 48시간 반응시킨 후 용해도를 측정하였다.
대상 데이터
- Phenanthrene의 분해균주는 Pseudomonas putida CRE7을 사용하였으며, 이는 University of Arizona에서 기증받아 사용하였다. 이 균주는 기존의 연구에 따르면, 생물계면활성제를 생성하거나, 탄소원으로 이용하지 않는 것으로 알려져 있다(Zhang et al.
- 1 mM 정도이며(Bai et aL, 1998), Jeneil Biosurfactant Company(WI, USA)에서 구입하여 시용하였다. 분해균주의 성장률을 측정하기 위해 사용한 R2Qagar는 Difco Laboratories(MI, USA)에서, 그 외의 화학물질(phenanthrene, chloroform, methanol, aceton- itril, water etc.)은 Aldrich Chemical Co. (WI, USA)과 Fisher Scientific Co. (PA, USA)에서 구입하여 사용하였다.
- 의해 생성되어진 계면활성제이다. 이러한 rhamnolipid 의 임계마이셀 농도(Critical Micelle Concentration, CMC)는 0.1 mM 정도이며(Bai et aL, 1998), Jeneil Biosurfactant Company(WI, USA)에서 구입하여 시용하였다. 분해균주의 성장률을 측정하기 위해 사용한 R2Qagar는 Difco Laboratories(MI, USA)에서, 그 외의 화학물질(phenanthrene, chloroform, methanol, aceton- itril, water etc.
이론/모형
- 균주는 미리 배양한 후, 초기 개체수가 106cfu/ml 정도가 되도록 접종하였고, 150 rpm, 25℃ 조건에서 5일 동안 배양하였다. 생장속도를 관찰하기 위해서 일정시간 간격으로 샘플을 채취하여 standard method(APHA et al, 1992)에 따라 표면평판법을 실시하여 개체수를 관찰하였다. Phenanthrene^] 전체 분해율은 5일 배양한 용액에 40 ml의 chloroform을 첨가하여 liquid-liquid extraction 후 chloroform 층으로 이동한 phenan thren의 양을 HPLC를 이용하여 분석하였다.
성능/효과
- 측정되었다. 다양한 pH에서의 용해도를 centrifuge vial과 플라스크를 이용하여 측정하였는데 vial을 이용한 실험결과, 가장 높은 용해도를 나타낸 pH는 240 ppm과 2000 ppm 경우 모두 pH 범위 4~4.5로 나타났다(Fig. 3). 이러한 pH에 따른 용해도의 변화 경향은 flask를 이용한 so- lubilization 실험에서도 나타나며 (Fig.
- 대표적인 생물계면활성제 rhamnolipid와 널리 이용되어지고 있는 비이온계 합성계면활성제 Tween 80의 phenanthrene에 대한 solubilization capacity를 알아보기 위한 회분식 실험의 결과 MSR은 각각 0.0425와 0.1449로 나타났다(Fig. 1). 이러한 rhamnolipid의 MSR값은 기존의 연구에서 밝혀진 0.
- 본 연구결과에 따르면, 생물계면활성제 용액의 pH 변화가 phenanthrene solubility의 변화에 크게 영향을 주는 인자이며, 이는 실제 토양에서의 제거효율이 pH 변화에 따라 차이를 나타낼 수 있음을 의미한다. 또한, pH에 따라 나타나는 서로 다른 구조의 phenanthrene-rhamnolipid의 집합체는 생물학적 이용도 또한 달라질 수 있음을 생분해 실험을 통하여 확인할 수 있었다. 이러한 결과는 생물계면활성제인 rhamnolipid의 친수성 부분의 음전하 세기가 pH에 따라 달라지는 현상에 기인한 것으로 보여지며, 이를 저온 전자현미경을 이용한 분석이나, size 분포 조사를 통해 생물계면활성제의 구조를 확인하는 연구가 필요하다고 판단된다.
- 5에서 8까지 증가함에 따라, rhamnolipid의구조는 큰 lamellar sheet에서, vesicle과 micelle 구조로 변화한다. 본 실험결과와 기존의 rhamnolipid 구조와 관련된 보고를 고려해 볼 때, rhamnolipid의 phenan- threne에 대한 solubilization capacity는 그 구조가 la mellar; vesicle, micelle로 변화함에 따라 감소하는 것으로 보여진다. 용해 실험 결과, pH 변화로 인한 서로 다른 구조의 생물계면활성제 집합체는 용해능력에서도 큰 차이를 보였으며, 이는 생물학적 이용도(bio-availability)에서도 다른 영향을 줄 것으로 예상된다.
- 최근엔 오염물의 용해도를 증가시키기 위해, 생분해 도가 높은 생물계면활성제의 첨가하고자 하는 연구가 행해지고 있다. 본 연구결과에 따르면, 생물계면활성제 용액의 pH 변화가 phenanthrene solubility의 변화에 크게 영향을 주는 인자이며, 이는 실제 토양에서의 제거효율이 pH 변화에 따라 차이를 나타낼 수 있음을 의미한다. 또한, pH에 따라 나타나는 서로 다른 구조의 phenanthrene-rhamnolipid의 집합체는 생물학적 이용도 또한 달라질 수 있음을 생분해 실험을 통하여 확인할 수 있었다.
- (1997)의 연구 결과에 의하면, 계면활성제의 첨가가 소수성 유기물질의 탈착과 용해도는 크게 향상시키지만, 분해능 또는 생물학적 이용도는 좀더 완만하게 증가시킨다고 알려져 있다. 본 연구에서도 pH 5의 경우 생물 계면활성제의 첨가로 인해 phenanthrene의 용해도는 MSM만을 첨가하였을 때보다 5배 이상 증가하였지만, 비성장률의 증가는 1.5배 정도이다. 이러한 결과는 생물 계면활성제의 첨가로 인해 마이셀 구조안으로 용해되어진 phenanthrene의 경우 분해균주의 접근이 용이하지 않아 분해되기 어렵다는 것을 말해주며, pH에 따라 나타나는 서로 다른 구조의 phenanthrene- rhamnolipid의 집합체는 생물학적 이용도 또한 달라질 수 있음을 의미한다.
- 생물계면활성제 첨가로 인한 phenanthrene solu bilization 기작이 평형에 도달하기 위한 시간을 살펴본 결과 24시간 정도에 평형에 도달하는 것으로 나타났다. 임계마이셀 농도 이하인 30ppm의 rhamnolipid를 첨가한 경우, 증류수를 첨가한 샘플과 유사한 농도인 1.
- 6에 보여진다. 생물계면활성제를 첨가하지 않은 실험과 같은 방법으로 비성장률을 계산한 결과 pH 4를 제외하고 전체적으로 증가한 경향을 보였으며(Table 2), 전체 분해율도 증가하는 추세를 나타내었다. 첨가제가 존재하지 않았던 분해 실험과는 달리, 최대 비성장률을 나타낸 pH 값은 선행된 용해 실험에서 가장 높은 용해도 값을 가졌던 pH 5로 이동하였다.
- 첨가제가 존재하지 않았던 분해 실험과는 달리, 최대 비성장률을 나타낸 pH 값은 선행된 용해 실험에서 가장 높은 용해도 값을 가졌던 pH 5로 이동하였다. 생물계면활성제를 첨가한 생분해 실험에서도, 5일 배양후의 전체 phenanthrene 분해율을 측정한 결과, 가장 높은 비성장률을 나타낸 pH 5에서 가장 높은 분해율을 보였다. Zhang et al.
- 본 실험결과와 기존의 rhamnolipid 구조와 관련된 보고를 고려해 볼 때, rhamnolipid의 phenan- threne에 대한 solubilization capacity는 그 구조가 la mellar; vesicle, micelle로 변화함에 따라 감소하는 것으로 보여진다. 용해 실험 결과, pH 변화로 인한 서로 다른 구조의 생물계면활성제 집합체는 용해능력에서도 큰 차이를 보였으며, 이는 생물학적 이용도(bio-availability)에서도 다른 영향을 줄 것으로 예상된다.
- 5배 정도이다. 이러한 결과는 생물 계면활성제의 첨가로 인해 마이셀 구조안으로 용해되어진 phenanthrene의 경우 분해균주의 접근이 용이하지 않아 분해되기 어렵다는 것을 말해주며, pH에 따라 나타나는 서로 다른 구조의 phenanthrene- rhamnolipid의 집합체는 생물학적 이용도 또한 달라질 수 있음을 의미한다.
- 최대 비성장률은 pH 6에서 나타났지만, pH 5-7 범위에서 크게 변화하지 않았다. 이러한 비성장률의 차이가 분해능에 미치는 영향을 확인한 결과, 높은 비성장률은 결과적으로 높은 분해율을 나타내는 것으로 보여졌다(Fig. 5).
후속연구
- 또한, pH에 따라 나타나는 서로 다른 구조의 phenanthrene-rhamnolipid의 집합체는 생물학적 이용도 또한 달라질 수 있음을 생분해 실험을 통하여 확인할 수 있었다. 이러한 결과는 생물계면활성제인 rhamnolipid의 친수성 부분의 음전하 세기가 pH에 따라 달라지는 현상에 기인한 것으로 보여지며, 이를 저온 전자현미경을 이용한 분석이나, size 분포 조사를 통해 생물계면활성제의 구조를 확인하는 연구가 필요하다고 판단된다.
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