선택한 단어 수는 입니다.
최소 단어 이상 선택하여야 합니다.
최소 단어 이상 선택하여야 합니다.
선택한 단어 수는 30입니다.
최대 10 단어까지만 선택 가능합니다.
최대 10 단어까지만 선택 가능합니다.
문제 정의
- 따라서 내분비계 장애물질의 독성 현상은 free radical 발생과 밀접한 관련이 있으며 최근 연구 결과에 따르면 합성수지 제품에 함유된 내분비계 장애물질이 매우 낮은 농도에서도 인간의 면역기능을 교란시킬 뿐만 아니라 과량이 되면 암이나 노화의 원인인 활성산소를 증가시킬 가능성이 있다고 보고하였다 (Dizdaraglu, 1991; Stadtman, 1998). 따라서 본 연구에서는 내분비계 장애물질의 free radical 생성을 통한 독성기전을 알아보고자 DES와 구조적 유사성을 가지며 간대사시 catechol 모핵을 가지는 대사체를 형성하는 bisphenol A의 대사과정 중 free radical 생성여부와 그에 따른 독성 현상을 알아보고자 하였다. 우선 bisphenol A의 대사적 활성화를 위해 rat의 간에서 유래한 S9 mixture를 사용하였으며 대사적 활성화에 따른 세포독성과 세포 증식률의 변화를 알아보았고 Cu(Ⅱ)와 같은 미량의 금속 원소는 catechol의 redox-cycling을 자극한다고 알려져 있으므로(A.
제안 방법
- GPx activity는 enzyme activity가 NA-DPH의 산화되는 양에 비례함을 이용하여 측정하였다. 0.01 M Tris-HCl (pH 8.0), 5 mM EDTA, 0.23 mM NADPH, 2 mM glutathione, 1 U/ml glutathione reductase, 0.33 mM t-butyl-hydroperoxide를 포함하는 1 ml의 reaction mixture에 20(11의 cell lysate 을 넣어 반응시켜 340nm에서 NADPH의 흡광도의 감소를 측정하였다. GPx의 activity는 bovine erythrocyte GPx (Sigma)의 standard curve를 사용하여 계산하였다.
- 흡광도를 측정하였다. 1,1,3,3-tetra-ethoxy-propane (TEP)의 산가수분해로 얻어진 Malondialdehyde (MDA)를 TBARS 정량을 위한 standard로 사용하였으며 1~10|iM MDA 0.1 ml를 SDS solution에 첨가하여 calibration하였다.
- , USA)과 1%의 penicillin-streptomycin을 포함한 Dulbec-co's modified Eagle's medium (DMEM)을 사용하였다. 3~4일마다 계대 배양 하였으며 자연발생적인 돌연변이의 생성을 최소화하고자 10번 미만으로 계대배양한 세포만을 실험에 사용하였다. 포화 습도하에서 5%CO2를 공급하는 37℃ Dual CO2 incubator에서 배양하였다.
- Cell lysate를 800 g에서 5분간 원심분리하여 가라앉힌 후 free radical scavenging enzymes의 활성을 측정하기 위하여 상 등액을 얻었다. Catalase activity는 240nm에서 흡광도의 감소로 나타나는 H2O2의 분해되는 양으로 측정하였다. l0mM H2O2을 포함하는 50mM phosphate buffer (pH 7.
- 6 M-1CM-1임을 이용하여 계산하였다. GPx activity는 enzyme activity가 NA-DPH의 산화되는 양에 비례함을 이용하여 측정하였다. 0.
- 33 mM t-butyl-hydroperoxide를 포함하는 1 ml의 reaction mixture에 20(11의 cell lysate 을 넣어 반응시켜 340nm에서 NADPH의 흡광도의 감소를 측정하였다. GPx의 activity는 bovine erythrocyte GPx (Sigma)의 standard curve를 사용하여 계산하였다. SOD activity는 pyrogallol의 자동산화를 억제하는 enzyme activity를 측정하였다.
- 자동산화된 pyrogallol의 양은 420nm에서 흡광도 증가로 나타난다. Mn-SOD의 activity는 cell lysate에 5 mM의 NaCN을 4℃에서 1시간 반응시켜 CuZnSOD를 불활성시킨 다음 reaction mixture에 cell lysate 20μl를 첨가하여 반응시킨 후 420nm에서 흡광도를 측정하여 대조군과 비교하였다.
- GPx의 activity는 bovine erythrocyte GPx (Sigma)의 standard curve를 사용하여 계산하였다. SOD activity는 pyrogallol의 자동산화를 억제하는 enzyme activity를 측정하였다. 1 mM EDTA를 포함하는 50 mM Tris-cacodylate buffer (pH 8.
- 고정액을 제거하고 수세한 후 종이 타월로 물기를 완전히 흡수시켜 상온에서 건조시켰다. 건조된 배양판에 0.4% SRB(1% acetic acid에 용해)를 well당 50μl씩 가하여 상온에서 30분정도 염색한 후, 100μl의 1% acetic acid로 4회 세척하고 상온에서 건조시켜 10 mM Tris-buffer(pH 10.5)를 well당 100식 분주한 다음 540nm에서 흡광도를 측정하여 세포수를 측정하였다.
- 대사 활성계에서 bisphenol A의 증식률을 측정하기 위하여 S9 mix를 사용하여 E-screen assay를 수행하였다. 시험 하루 전 시험에 사용될 세포의 배지를 교환하고, 시험 당일에 세포가 들어있는 T25cm2 플라스크의 배지를 흡인제거한 다음, phosphate buffered saline (PBS) 완충액으로 1회 세정하였다.
- 각 well에 6가지의 농도의 bisphenol A와 200 μM Cu(Ⅱ)를 넣어 72시간 배양하였다. 또한 bisphenol A에 의한 비가 역적 손상을 알아보기 위해두 개의 plate를 사용하여 다른 하나의 경우 72시간 후에 bisphenol A가 존재하지 않는 배지로 교환한 후 72시간 더 배양하였다. 세포 생존률은 MTT assay (김 등, 2002)를 사용하여 측정하였다.
- 배지를 15 ml 원심분리관으로 옮겨 원심분리시켜(295×g, 5분) 상징액을 흡인제거한 다음, 세포가 남아있는 원심분리관에 배지를 넣고 피펫팅하여 세포를 단일화시켜 세포수를 측정하였다. 2×103 cells/well로 96 well 배 양판에 분주한 후(well당 배지량 100μl) 배양판을 천천히 흔들어 세포가 균일하게 분산되도록 하고 5% CO2, 37℃로 조절된 배양기에서 24시간 배양시킨 후, well에 들어있는 배지를 흡인·제거하였다.
- 5%가 되도록 조절하였다. 시료가 첨가된 96-well plate를 5%CO2, 37℃로 조절된 배양기에서 6일간 배양한 후, SRB assay로 세포수를 측정하였다. 6일간 배양 후 96-well 배양판의 배지를 흡인.
- 시험 하루 전 시험에 사용될 세포의 배지를 교환하고, 시험 당일에 세포가 들어있는 T25cm2 플라스크의 배지를 흡인제거한 다음, phosphate buffered saline (PBS) 완충액으로 1회 세정하였다. 0.
- 따라서 본 연구에서는 내분비계 장애물질의 free radical 생성을 통한 독성기전을 알아보고자 DES와 구조적 유사성을 가지며 간대사시 catechol 모핵을 가지는 대사체를 형성하는 bisphenol A의 대사과정 중 free radical 생성여부와 그에 따른 독성 현상을 알아보고자 하였다. 우선 bisphenol A의 대사적 활성화를 위해 rat의 간에서 유래한 S9 mixture를 사용하였으며 대사적 활성화에 따른 세포독성과 세포 증식률의 변화를 알아보았고 Cu(Ⅱ)와 같은 미량의 금속 원소는 catechol의 redox-cycling을 자극한다고 알려져 있으므로(A.M seacat et al., 1997) Cu (Ⅱ)가 bisphenol A의 대사체의 redox cycling에 미치는 영향을 알아보고 자 사람 유래 세포주에서 지질과 산화 정도 free radical 발생에 따른 SOD, Catalase, GPx의 활성도 변화를 알아보았다.
- 따라서 bisphenol A는 간 대사에 의해 세포 독성이 낮은 물질로 대사되며 생체에 유입시 간 대사를 받는 만큼 생체 독성이 감소할 것임을 예상할 수 있다. 이러한 연구결과를 바탕으로 bisphenol A와 bisphenol A metabolites으로의 전환과정에서 redox cycling을 통한 free radical의 생성여부를 알아보기 위하여 Cu(Ⅱ)를 사용하였다. Cu(Ⅱ)를 배지에 첨가한 결과 S9mix에 의해 감소되었던 세포 독성이 S9mix를 첨가하지 않았을 때만큼 증가하였다.
- 대조군으로는 serum-free medium 또는 200μM Cu(Ⅱ)만을 배양하였다. 항산화제와 라디칼 소거제의 지질과 산화 억제 정도를 알아보기 위하여 SOD (incubation level: 100 units), catalase (incubation level: 100 units), Vit C (incubation level: 50μM)을 bisphenol A를 넣어주기 4시간 전에 세포와 반응시킨 후 72시간 배양하였다. 배양종료 후각각의 세포를 모두 eppendorf tube에 회수하여 3% SDS 1ml을 넣어 세포를 lysis 시켰다.
- 2×103 cells/well로 96 well 배 양판에 분주한 후(well당 배지량 100μl) 배양판을 천천히 흔들어 세포가 균일하게 분산되도록 하고 5% CO2, 37℃로 조절된 배양기에서 24시간 배양시킨 후, well에 들어있는 배지를 흡인·제거하였다. 혈청에 함유된 세포증식인자를 제거한 Charcoal-dextran 처리 FBS (CD-FBS)를 5% 함유한 DMEM 배지 90μl를 well에 넣고 시험물질의 농도를 0.05 μM부터 최고 5μM까지 조제하여 각 농도별로 10μl씩 well에 가하였다. 이때, 용매로 사용한 ethanol의 최종 농도는 0.
대상 데이터
- 3.5×105개의 세포를 T75㎠플라스크에 배양하였다. 3일 후 S9(10%)mix, 200μM Cu(Ⅱ)와 serumfree medium에 녹인 bisphenol A를 농도별로 72시간 배양하였다.
- 96-well에 well당 10,000개의 세포를 배양하였다. 24,48,72시간 배양 후 S9(10%)mix를 넣어 주었다.
- Bisphenol A, 17β-estradiol, Tamoxifen, Thiobarbituric acid, 1,1', 3,3'-tetraethoxypropane, Proteinase K, Agarose, Ascorbic acid 등의 시약은 Sigma Chemical Co. (St. Louis, MO, USA)에서 구입하였다.
- Dulbecco's modified Eagle's medium (DMEM), Fetal Bovine Serum (FBS) 등은 GIBCO-BRL (Gaithersburg, MD, USA)에서 구입하였다. 기타 시약 및 용매는 특급 또는 1급을 사용하였다.
- 분양받았다. MCF-7 cells, HepG2 cells and HaCaT cells-S] 배양액은 10% fetal bovine serum (FBS, Gibco BRL, Grand island, N.Y., USA)과 1%의 penicillin-streptomycin을 포함한 Dulbec-co's modified Eagle's medium (DMEM)을 사용하였다. 3~4일마다 계대 배양 하였으며 자연발생적인 돌연변이의 생성을 최소화하고자 10번 미만으로 계대배양한 세포만을 실험에 사용하였다.
- 3일 후 S9(10%)mix, 200μM Cu(Ⅱ)와 serumfree medium에 녹인 bisphenol A를 농도별로 72시간 배양하였다. 대조군으로는 serum-free medium 또는 200μM Cu(Ⅱ)만을 배양하였다. 항산화제와 라디칼 소거제의 지질과 산화 억제 정도를 알아보기 위하여 SOD (incubation level: 100 units), catalase (incubation level: 100 units), Vit C (incubation level: 50μM)을 bisphenol A를 넣어주기 4시간 전에 세포와 반응시킨 후 72시간 배양하였다.
- 사람 유래 세포로서 breast carcinoma, estrogen receptor positve MCF-7 cells, hepatoblastoma HepG2, epidermal cells인 HaCaT cells을 생명공학연구소로부터 분양받았다. MCF-7 cells, HepG2 cells and HaCaT cells-S] 배양액은 10% fetal bovine serum (FBS, Gibco BRL, Grand island, N.
이론/모형
- 또한 bisphenol A에 의한 비가 역적 손상을 알아보기 위해두 개의 plate를 사용하여 다른 하나의 경우 72시간 후에 bisphenol A가 존재하지 않는 배지로 교환한 후 72시간 더 배양하였다. 세포 생존률은 MTT assay (김 등, 2002)를 사용하여 측정하였다.
성능/효과
- GPx는 MCF-7 cells에서 bisphenol A의 농도가 증가함에 따라 activity가 감소(Fig. 9)하였으며 catalase activity 역시 Bisphenol A 농도가 증감함에 따라 대조군에 비해 약간 감소하는 경향을 보였다(Table 2).
- HaCaT cells에서는 50μM까지는 대조군과 비교하여 지질과산화를 일으키지 않았으나 100μM에서부터 유의성 있게 지질과 산화가 중가하기 시작하여 25μM에서는 TBARS값이 1,452nmol/mg으로 최대로 나타나 대조군에 비해 지질과산화가 52.57% 증가하였다 (Fig. 4). HepG2 cells에서는 100uM까지는 TBARS값에 있어 유의성 있는 변화가 없었으나 250μM에서 TBARS값이 1.
- MCF-7 cells에서 catalase, SOD, Vit C는 지질과산화를 각각 88.74±1.34%, 95.98±3.15%, 91.42±6.45% 억제하였고 HepG2 cells에서 catalase, SOD, VitC는 각각 74.65±4.15%, 78.01±4.6%, 78.53±4.7% 억제하였으며 HaCaT cells의 경우 catalase, SOD, VitC는 각각 81.33±3.46%, 82.1±3.82%, 84.76±8.26% 억제하였다. MCF-7 cells에서는 SOD가 HepG2 cells과 HaCaT cells에서는 Vit C가 억제효과가 가장 크게 나타났다(Fig.
- 26% 억제하였다. MCF-7 cells에서는 SOD가 HepG2 cells과 HaCaT cells에서는 Vit C가 억제효과가 가장 크게 나타났다(Fig. 7).
- MCF-7cells을 250㎛의 bisphenol A오+ 72시간 반응시킨 결과 SOD activity가 대조군에 비해 약 30% 감소하였으며 CuZnSOD를 억제하는 cyanide를 사용하여 MnSOD의 activity를 측정한 결과 대조군과 비교하여 차이를 보이지 않았다 (Fig. 8).
- 각 세포주의 50% 증식 억제 농도(IC50)는 대사활성화 존재 시 HaCaT cells와 HepG2 cells의 경우 1000μM 이하에서는 IC50을 구할 수 없었으며 MCF-7 cells의 경우 702.5μM으로 나타나 대사 활성화 존재 시 각세포에 대한 세포독성이 대사활성화 부재하에서 보다 크게 감소한 것으로 나타났다(Fig. 2).
- 대사 활성하에서 bisphenol A의 세포독성변화를 알아본 결과 bisphenol A의 세포에 대한 독성 이 크게 감소하였다. 따라서 bisphenol A는 간 대사에 의해 세포 독성이 낮은 물질로 대사되며 생체에 유입시 간 대사를 받는 만큼 생체 독성이 감소할 것임을 예상할 수 있다.
- 대사 활성화 존재 하에서 증가했던 생존률이 Cu(Ⅱ)를 첨가한 결과 생존률이 크게 감소하는 결과가 나타났다. 세포 각각의 IC50은 MCF-7 cellse 94.
- Cu(Ⅱ)를 배지에 첨가한 결과 S9mix에 의해 감소되었던 세포 독성이 S9mix를 첨가하지 않았을 때만큼 증가하였다. 따라서 DNA strand scission 과정 중Cu(Ⅱ)와 free radical 이 관여함을 알 수 있었다. 따라서 Cu(Ⅱ)를 넣어준 배지에서 bisphenol A는 S9 mix존재시 redox cycling을 거쳐 semiquinone과 quinone을 형성하며 이 과정에서 free radical을 형성한다고 여겨진다.
- 이러한 free radical의 형성을 확인하기 위해 세포에서의 지질과 산화와 항산화 효소의 활성도 변화를 측정한 결과 지질과산화 수치가 약간 증가하는 결과가 나타났으며 앞서 수행한 세포독성실험 결과에서 최대 독성을 나타내는 농도와 최대지질과 산화유발 농도가 유사하였다. 따라서 이들 결과를 종합해보면 bisphenol A에 의한 세포독성은 bisphenol A를 처리한 세포에 있어서 지질과산화 정도와 관련이 있으며 항산화 효소들의 활성이 감소한 것으로 보아 세포 내의 항산화 효소들이 cytotoxic lipid peroxidation product로부터 세포를 보호하지 못하였음을 알 수 있다.
- 따라서 이러한 결과들을 종합해 볼 때 cytochrome P450-class mixed function oxidase 혹은 peroxidase 같은 효소들은 bisphenol A의 산화를 촉진시켜 bispehnol A의 대사체로 catechol 구조를 갖는 5-hydroxybisphenol A을 형성하며 이러한 redox cycling 과정이 Cu(Ⅱ)에 의해 촉진되어 free radical을 형성한다고 추측된다. 그러나 생체 내에서 copper와 같은 미량금속은 Fenton reaction에 의한 free radical 생성을 자극 하나 catechol compound의 산화에 기인하는 다른 여러 pathway가 존재하므로 bisphenol A의 redox cycling통한 free radical 생성은 더 많은 연구를 통해 확인되어야 할 것이다.
- 현재 미국, 일본을 비롯한 선진국에서 내분비계 장애물질의 모니터링뿐만 아니라 독성기전 연구 및 인체에 미치는 영향에 관한 다양한 연구가 활발히 진행되고 있는데 최근 내분비계 장애물질의 free radical 생성에 따른 독성 현상에 관심이 집중되고 있다. 미국 CDC (Center for disease control and prevention)에서 분류한 48종의 내분비계 장애물질에 대하여 조사한 결과 50% 화학물질이 free radical을 형성하고 생식독성, 발암성, 변이원성, 면역독성 및 신경독성을 나타내는 화학물질은 각각 81%, 79%, 73%, 52% 및 51%임을 확인하였다. 따라서 내분비계 장애물질의 독성 현상은 free radical 발생과 밀접한 관련이 있으며 최근 연구 결과에 따르면 합성수지 제품에 함유된 내분비계 장애물질이 매우 낮은 농도에서도 인간의 면역기능을 교란시킬 뿐만 아니라 과량이 되면 암이나 노화의 원인인 활성산소를 증가시킬 가능성이 있다고 보고하였다 (Dizdaraglu, 1991; Stadtman, 1998).
- 세포 내의 SOD는 superoxide anion을 hydrogen peroxide로 전환시키며 결국에는 Cu(Ⅰ)와 같은 미량의 금속이온의 존재하에 반응성이 매우 높은 hydroxyl radical을 형성하게 될 것이다. 이러한 free radical의 형성을 확인하기 위해 세포에서의 지질과 산화와 항산화 효소의 활성도 변화를 측정한 결과 지질과산화 수치가 약간 증가하는 결과가 나타났으며 앞서 수행한 세포독성실험 결과에서 최대 독성을 나타내는 농도와 최대지질과 산화유발 농도가 유사하였다. 따라서 이들 결과를 종합해보면 bisphenol A에 의한 세포독성은 bisphenol A를 처리한 세포에 있어서 지질과산화 정도와 관련이 있으며 항산화 효소들의 활성이 감소한 것으로 보아 세포 내의 항산화 효소들이 cytotoxic lipid peroxidation product로부터 세포를 보호하지 못하였음을 알 수 있다.
후속연구
- 추측된다. 그러나 생체 내에서 copper와 같은 미량금속은 Fenton reaction에 의한 free radical 생성을 자극 하나 catechol compound의 산화에 기인하는 다른 여러 pathway가 존재하므로 bisphenol A의 redox cycling통한 free radical 생성은 더 많은 연구를 통해 확인되어야 할 것이다. 염색체내에서의 bisphenol A와 coppei의 상호작용은 Cu(Ⅱ)/Cu(Ⅰ)의 redox cycling을 자극하여 free radical을 생성하며 DNA에 인접한 곳에서 염색체 내의 copper와의 상호작용에 의한 free radical 의 발생은 산화적 DNA 손상 (oxidative DNA damage)을 일으킬 수 있다(Roy&wL, 1999).
※ AI-Helper는 부적절한 답변을 할 수 있습니다.