[논문]번식주기의 단계별로 회수한 고양이 난자의 체외수정과 체외발생에 관한 연구

박상훈; 이명헌; 김무강; 김상근

[국내논문] 번식주기의 단계별로 회수한 고양이 난자의 체외수정과 체외발생에 관한 연구
Study on the Developmental Rate of In Vitro Cultured Cats Oocytes Recovered from Ovaries Collected at Different Stages of the Reproductive Cycle 원문보기

韓國受精卵移植學會誌 = Korean journal of embryo transfer, v.18 no.2, 2003년, pp.157 - 161

박상훈 (충남대학교 수의과대학) , 이명헌 (수의과학검역원) , 김무강 (충남대학교 수의과대학) , 김상근 (충남대학교 수의과대학)

초록
AI-Helper

본 연구는 소형 고양이의 불임 해결과 체외수정란을 생산하기 위한 방안으로서 난자의 형태, 번식주기, 배양시간 및 활성화 처리가 난포란의 체외수정 및 체외발생에 미치는 영향을 조사하였다. 1. 신선 및 salt에 보존한 난소로부터 회수한 난구세포부착 및 나화 난자를 각각 배양했을때 체외수정율 및 분할율은 65.7%와 17.1%, 28.6%와 8.6% 및 57.1%와 13.3%, 23.3%와 3.3%로서 난구세포 부착 신선난자가 나화 난자에 비해 높은 체외발생률을 나타냈다. 2. 휴지기, 발정기 및 황체기 단계로 구분하여 채취한 난포란을 성숙배양 후 수정시켰을 때 체외수정율은 각각 68.9%, 44.4%, 48.9%였으며, 분할율은 각각 17.8%, 8.9%, 12.8%로 나타났다 3. 24, 36 및 48시간 각각 배양한 난포란을 성숙 배양 후 수정시켰을 때 체외수정율은 각각 66.7%, 46.7%, 48.9%였으며, 분할율은 각각 17.8%, 11.1%, 8.5%로 나타났다. 4. 난자를 활성화처리 및 비활성화처리 후 각각 체외수정시켰을 때 체외수정율은 각각 57.4%와 31.4%였고, 체외분할율은 22.9%와 11.4%로서 활성화 처리를 한 난자가 높은 체외발생율을 나타냈다.

Abstract ▼ AI-Helper

The study was carried out to investigate the effects of morphology, reproductive cycle, incubation time and activation of oocytes in vitro maturation of cats oocytes and development of IVM/IVF embryos. The results were summarized as follows : 1. The fertilization and developmental rate of fresh and salts-stored oocytes with and whithout cumulus cells were 65.7%, 17.1% and 28.6%, 8.6% and 57.1%, 13.3%, 23.3%, 3.3%, respectively. The rate of oocytes with cumulus cells(13.3%∼65.7%) was higher than that of denuded oocytes(3.3%∼28.6%). 2. The fertilization and developmental rate of oocytes recovered from ovaries collected at different stages of the reproductive cycle were 68.9%, 44.4%, 48.9% and 17.8%, 8.9%, 12.8%, respectively. 3. The fertilization and developmental rate of oocytes in vitro cultured at different time of incubation(24, 36 and 48 h) were 66.7%, 46.7%, 48.9% and 17.8%, 11.1%, 8.5%, respectively. respectively. The rate of oocytes incubated 24 h(66.7%) was higher than that oocytes incubated 36 and 48 h(46.7%∼48.9%). 4. The fertilization and developmental rate of oocytes treated activation and non-activation oocytes were 57.4%, 31.4% and 22.9%, 11.4%, respectively. The rate of oocytes treated activation was higher than that oocyte treat non-activation.

Keyword

AI 본문요약
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문제 정의

본 연구는 소형 고양이의 불임 해결과 체외수정란을 생산하기 위한 방안으로서 난자의 형태, 번식 주기, 배양시간 및 활성화 처리가 난포란의 체외수정 및 체외발생에 미치는 영향을 조사하였다.
이에, 본 연구는 고양이의 불임해결과 체외수정란을 생산 할 목적으로 번식주기의 단계별로 난소로부터 회수한 고양이 난자의 체외수정 및 체외 발생에 미치는 영향을 조사하였다.

제안 방법

암코양이로부터 적출한 난소를 세절한 후 m- PBS에 부유시켜 난자를 회수한 후 난포란은 2 IU/ml 의 hCG(Sigma, U.S.A.)와 1 μg/ml의 β-estradi- ol(Sigma, U.S.A.)과 10%(v/v)의 FCS(Sigma, U.S. A.)7} 첨가된 TCM-199(Whittaker, U.S.A.) 배양액으로 배양하였다. 난포란의 체외성숙은 배양액 50μl의 소적을 mineral oil(Squibb, U.
) 배양액으로 배양하였다. 난포란의 체외성숙은 배양액 50μl의 소적을 mineral oil(Squibb, U.S.A.)로 피복된 소적내에 5개의 난포란을 주입하여 CO₂ 배양기내(5% CO₂ , 95% air, 38.5℃)에서 배양하였다. 신선한 난소와 salt에 보존한 난소로부터 회수한 난구 세포부착 난자와 나화 난자를 각각 24시간 또는 36 및 48시간 배양에 따른 체외성숙율과 난포의 직경이 2mm 이하를 휴지기, 1〜2개 이상의 황체가 존재할 때 황체기, 많은 난포가 존재할 때를 발정기로 구분하여 채취한 난포란을 배양하였을 때 체외수정율 및 체외발생율을 조사하였다.
5℃)에서 배양하였다. 신선한 난소와 salt에 보존한 난소로부터 회수한 난구 세포부착 난자와 나화 난자를 각각 24시간 또는 36 및 48시간 배양에 따른 체외성숙율과 난포의 직경이 2mm 이하를 휴지기, 1〜2개 이상의 황체가 존재할 때 황체기, 많은 난포가 존재할 때를 발정기로 구분하여 채취한 난포란을 배양하였을 때 체외수정율 및 체외발생율을 조사하였다.
성숙한 수컷 고양이로부터 고환을 적출한 후 고환으로부터 정소상체를 분리하여 미부를 세절한다음 37°C의 m-PBS에 dish에 부유시켰다. 부유액은 500×g로 5분간 원심분리한 다음 상청액을 제거하고 남은 정자 pellets에 대해 활력검사 후 50% 이상의 정자만을 동결 보존하였다.
난구세 포를 제거하기 위 하여 0.2% hyaluroni- dase(Sigma, U.S.A.)가 첨가된 PBS 배지에서 난구세포를 제거하였으며, 난구세포가 제거된 난자중제1 극체가 방출된 난자만을 선별하여 7% ethanol 에서 5 분간 처리 후 2.0 mM dimethylamino-puri- ne(Sigma, U.S.A.)에서 1시간 활성화 처리후 시험에 이용하였다.
난자를 0.2%의 hyaluronidase(Sigma, U.S.A.)를1〜5분간 처리에 의하여 난구세포를 제거하고 나화된 난자는 acetic acid : ethanol(l : 3)액에 24시간 고정하고 1% aceto-orcein 또는 10 μg/ml bis- benzimide(Hoechst 33342, Sigma, U.S.A.) 염색액으로 염색한 다음 세포 및 핵 분열상을 관찰하여 난자의 체외성숙을 판정하거나 배양액 내에서 배양하면서 웅성전핵 형성과 배의 발생상태를 관찰하여 판정하였다.

데이터처리

반복실험을 통하여 얻어진 결과는 분산분석에 의해 평균치를 구하였으며, 처리간의 차이를 평가하기 위하여 Duncan의 다중검증을 실시하였다.

이론/모형

부유액은 500×g로 5분간 원심분리한 다음 상청액을 제거하고 남은 정자 pellets에 대해 활력검사 후 50% 이상의 정자만을 동결 보존하였다. 정자의 동결은 Kim(2001)의 방법에 따라 수행하였는데, 정자 부유액은 extender-1 과 2로 희석한 다음 5분간 평형 시킨 후 0.25 ml의 스트로에 충전하여 자동 세포동결기 (Forma Co., U.SA.)로 동결 후 LN₂ container에 보존하면서 시험에 이용하였다. 동결정액의 융해는 straw내 정액을 tris-buffer에 옮겨 2분간 30°C의 항온수조에서 융해하였으며, 정자의 활력이 50% 이상의 정자만을 시험에 이용하였다.

성능/효과

휴지기, 발정기 및 황체기 단계로 구분하여 채취한 난포란을 성숙배양 후 수정시켰을 때 체외수정율은 각각 68.9%, 44.4%, 48.9%였으며, 분할율은 각각 17.8%, 8.9%, 12.8%로 나타났다. 이러한결과는 고양이 난포란을 24시간 성숙배양 후 체외수정시켰을 때 수정율이 55.
24, 36 및 48시간 각각 배양한 난포란을 성숙배양 후 수정시켰을 때 체외수정율은 각각 66.7%,46.7%, 48.9%였으며, 분할율은 각각 17.8%, 11.1%, 8.5%로 나타났다. 이러한 결과는 고양이 난포란을 24시간 성숙배양 후 체외수정시켰을 때 수정율이 55.
난자를 활성화 처리 및 비활성화 처리 후 각각 체외수정 시켰을 때 체 외수정 율은 각각 57.4%와 31.4 %였고, 체외분할율은 22.9%와 11.4%로서 활성화 처리를 한 난자가 높은 체외발생율을 나타냈다. 이러한 결과는 고양이 난자의 활성화처리가 IVF에 미치는 보고를 접할 수 없어 정확하게 비교할 수는 없었다.
1. 신선 및 salt에 보존한 난소로부터 회수한 난구 세포부착 및 나화 난자를 각각 배양했을때 체외수정율 및 분할율은 65.7%와 17.1%, 28.6%와 8.6% 및 57.1%와 13.3%, 23.3 %와3.3%로서 난구세포 부착 신선난자가 나화 난자에 비해 높은 체외발생률을 나타냈다.
2. 휴지기, 발정기 및 황체기 단계로 구분하여 채취한 난포란을 성숙배양 후 수정시켰을 때 체외수정율은 각각 68.9%, 44.4%, 48.9%였으며, 분할율은 각각 17.8%, 8.9%, 12.8%로 나타났다
3. 24, 36 및 48시간 각각 배양한 난포란을 성숙배양 후 수정시켰을 때 체외수정율은 각각 66.7%, 46.7%, 48.9%였으며, 분할율은 각각 17.8%, 11.1%, 8.5%로 나타났다.
신선 및 salt에 보존한 난소로부터 회수한 난구 세포부착 및 나화 난자를 각각 배양했을 때 체외수정율 및 분할율은 65.7%와 17.1%, 28.6%와 8.6% 및 57.1%와 13.3%, 23.3%와 3.3%로서 난구세포 부착 신선난자가 나화 난자의 체외발생률에 비해 높은 체외성숙률을 나타냈다. 이러한 결과는 형태적으로 우수하며, 난구세포가 치밀하게 부착된 신선 난자 만을 선별하여 배양했을 때 높은 체외발생율을 나타냈다.
3%로서 난구세포 부착 신선난자가 나화 난자의 체외발생률에 비해 높은 체외성숙률을 나타냈다. 이러한 결과는 형태적으로 우수하며, 난구세포가 치밀하게 부착된 신선 난자 만을 선별하여 배양했을 때 높은 체외발생율을 나타냈다. 고양이 난자를 대상으로 한 연구보고는 없지만, 개 난자를 이용하여 salt 및 4 °C에 48시간 배양했을 때 GVBD 및 MI기로의 체외발생율은 각각 33.
4. 난자를 활성화처리 및 비활성화처리 후 각각 체외수정시켰을 때 체외수정율은 각각 57.4 %와 31.4%였고, 체외분할율은 22.9%와 11.4%로서 활성화 처리를 한 난자가 높은 체외발생율을 나타냈다.

참고문헌 (14)

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저자의 다른 논문 :

표제어: PCR

동의어: Packet Collision Rate

용어 설명 출처 목록 (6)

용어 설명: PCR은 세균 특이성이 있는 primer를 이용하여 적은 수의 세균이 있을지라도 쉽게 검출할 수 있는 유용한 방법이며, 이를 이용하여 구강 내 치면세균막이나 타액에서 직접 세균을 검출할 수 있게 되었다[8].

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