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문제 정의
- 유연관계의 분석은 unweighted pair group mdhod using arithmetic average (UPGMA) 및 maximum parsimony (MP) 등 두 가지 방법에 의하여 수행되었다. UPGMA 법은 단순히 유전적 거리 (genetic distance=d)에 의한 유전적 유사성을 계산하는 반면, MP법은 변이요 인간의 진화적 고려를 하는 러h 두 가지 방법을 사용함으로 유연관계의 신뢰성을 높이고자 하였다. UPGMA는 numerical taxonomy and multivariate analysis system (NTSYS, ver.
- 따라서 본 연구는 들깨 품종 (종) 중 재래종 들깨를 대상으로 RAPD법예 의한 유전적 변이를 비교하고, 이들 품종간의계통분석을 실시함으로써 RAPD 결과가 재래종 들깨에 있어 각 품종의 마디수, 화방수, 천립증 그리고 유지 함량 등의 형질특성 및 재배지역 정보를 반영하는지를 분석하여 들깨 유전자원의 평가와 선발을 위한 기초자료를 얻고자 실시하였다.
- 본 연구는 들깨 유전자원의 유전적 특성 분석을 위해 들깨 계통 및 품종의 유전적 변이를 DNA 수준예서 비교하고, 이들의 유전적 근연성 및 변이정도를 규명하여 육종의 기초자료로 제공하기 위하여 수행한 연구로 그 주요 결과는 다음과 같다. RAPD를 이용하여 국내예서 수집한 들깨 계통 및 품종 의 DNA polymorphism을 관찰한 결과, 220개 의 primer 중 13 개의 변별력 있는 primer가 선발되었고, 이들 primer는 144개의 밴드를 나타났으며 이 중 polymorphic 밴드는 115개 였고, 29개는 monomorphic 밴드였다.
제안 방법
- 72℃에서 7분간 실시 하였다. PCR 반응 후 ethidium bromide가 첨가된 1.4% agarose gel 상에서 50V 로 130분간 전기영동 한 후 UV램프 위예서 DNA 증폭양상을 관찰하였다.
- PCR 반응은 Gene Amp PCR system 2400 (Perkin-Elmer, USA)을 사용하여 pre-heating time이 없이 denaturatioii은 94℃ 에서 30초, anne aling 은 45℃ 에서 30초, extension은 72℃ 에서 2분간 실시하여 45회 반복하였으며, 마지막 cycle예서의 extension은 72℃에서 7분간 실시 하였다. PCR 반응 후 ethidium bromide가 첨가된 1.
- 수량형질 툭성을 Table 1에 나타내었다. RAPD 분석을 위하여 어린 잎을 채취하였으며 이들은 DNA 추출시까지 -70℃에보관하였다.
- 상기 계통분석으로 얻어진 그룹이 마디수, 천립증과 관련이 있는 지를 확인하기 위하여 두 계통그룹 (그룹 A 및 그룹 B)에 속한 품종을 기준으로 이들 수치를 비교하였다. 우선 마디 수와 비교한 결과, 그룹 A의 평균 마디수는 12.
- 선발된 12개의 Operon pnmer를 이용하여 들깨 42개 계통 및 품종에 대한 RAPD 분석을 실시하였고, 이때 적용된 PCR 조건은 Jeong 등 (2000) 이 보고한 바와 같다. 즉, 50 ng 의 template DNA, 2.
- 선발된 12개의 primer로부터 얻은 115개의 polymorphic band를 이용하여 NTSYS에 의한 품종간유전적 유사도를 파악하였다 (자료생략). 들깨 42계통 및 품종의 유사도계수는 0 〜0.
- 증폭된 DNAband 의 존재 유무 (유는 1, 무는 0)에 따라 data matrix를 작성한 후 (자료생략), 품종간의 유전적 유사성 (상이성) 및 유연관계를 파악하였다. 유연관계의 분석은 unweighted pair group mdhod using arithmetic average (UPGMA) 및 maximum parsimony (MP) 등 두 가지 방법에 의하여 수행되었다.
- 상등액에 3 M sodium acetate 75μL와 isopropanol 500 μL를 넣고, 다시 원심분리 (13,000 rpm, 10분, 4℃)하여 DNA를 회수하고 80% ethanol로 세척하여 건조시킨 후 몉균수 (30〜50 μL)에 용해시켰다. 추출된 DNA는 0.7% agarose gel예서 약 25분간 전기영동 하여, genomic DNA를 관찰하였으며, 아울러 260 nm 와 280nm에서 홉광도를 측정하여 농도를 확인하였다.
대상 데이터
- Operon사로부터 각 20개의 random primer로 구성된 OPA, OPB, OPC, OPD, OPF, OPJ, OPN, 0P0, OPP, OPV, OPX 등의 kit를 구입하여 총 220개의 primer를 사용하여 polymor- phism을 나타내는 12개의 priller를 최종 선발하여 사용하였다 (Table 2).
- Operon사의 random primer 220개 중 재현성이 우수하고 다형화 현상을 나타내는 13개의 primer를 선발하였고 (Table 2), 그 결과 중 일부 profile을 Figure 1에 나타내었다. RAPD-PCR 결과, 약 400〜10, 000 bp 범위에서 다양한 크기의 밴드가 확인되었다.
- 국내에서 수집한 들깨 42품종을 이용하여 220개의 pnmer 중 polymorphic band를 보이는 primer 13개를 선발하였다. 각 primer당 평균 12개의 밴드를 얻었으며, 총 144개의 밴드로 약 115개 (79.
- 본 연구예 사용된 들깨 (Perilla frutescens) 종자는 각 지방에서 수집된 42계통 및 품종으로 이들 들깨의 대표적인 생육 및 수량형질 툭성을 Table 1에 나타내었다. RAPD 분석을 위하여 어린 잎을 채취하였으며 이들은 DNA 추출시까지 -70℃에보관하였다.
- 5 μL의 lOXbuffer를 넣어 전체 반응 용량이 25 μL가 되도록 몉균수로 조정하였다. 이때 사용된 dNTP, Taq polymerase 및 10X buffer는 Takara (Japan) 제품을 사용하였다.
데이터처리
- 1)을 사용하였다. 품종간의 유전적 거리는 mean pairwise distance를 사용하였으며 유연관계분석은 heuristic 법을 사용하였고 계통수의 신뢰도는 bootstrap법으로 100반복 실시하였다 (Felsenstein 1985).
이론/모형
- UPGMA 법은 단순히 유전적 거리 (genetic distance=d)에 의한 유전적 유사성을 계산하는 반면, MP법은 변이요 인간의 진화적 고려를 하는 러h 두 가지 방법을 사용함으로 유연관계의 신뢰성을 높이고자 하였다. UPGMA는 numerical taxonomy and multivariate analysis system (NTSYS, ver. 2.02i) computer program을 이용하였으며, 이때 품종간의 유전적 유사도 계수 (similarity coefficient) 는 Sokal 와 Sneath (1963)의 방법에 따라 구하였다. 이와 달리 parsimony법에 의한 품종간의 유전적 분화정도와 유연관계를 파악하기 위하여 Swofford (1990)의 phylogenetic analysis using parsimony (PAUP, ver.
- 및 유연관계를 파악하였다. 유연관계의 분석은 unweighted pair group mdhod using arithmetic average (UPGMA) 및 maximum parsimony (MP) 등 두 가지 방법에 의하여 수행되었다. UPGMA 법은 단순히 유전적 거리 (genetic distance=d)에 의한 유전적 유사성을 계산하는 반면, MP법은 변이요 인간의 진화적 고려를 하는 러h 두 가지 방법을 사용함으로 유연관계의 신뢰성을 높이고자 하였다.
- 02i) computer program을 이용하였으며, 이때 품종간의 유전적 유사도 계수 (similarity coefficient) 는 Sokal 와 Sneath (1963)의 방법에 따라 구하였다. 이와 달리 parsimony법에 의한 품종간의 유전적 분화정도와 유연관계를 파악하기 위하여 Swofford (1990)의 phylogenetic analysis using parsimony (PAUP, ver. 3.1)을 사용하였다. 품종간의 유전적 거리는 mean pairwise distance를 사용하였으며 유연관계분석은 heuristic 법을 사용하였고 계통수의 신뢰도는 bootstrap법으로 100반복 실시하였다 (Felsenstein 1985).
- 총지질의 추출은 Bhgh와 Dyer법 (Bligh and Dyer 1959)에 따라 시료 10 g을 냉동유발에 넣은 후 적당량의 액체질소를 붓고 마쇄 한 다음 여기에 chloroform methanol (2:1, v/v) 의 혼합 용액을 넣는다. 이상의 혼합액은 24시간 동안 냉장고에 방치한 후 여과지로 여과한 후, l%NaCl 용액을 가하여 수용성믈질을 제거한 뒤 분리된 chloroform층만을 회수하여 rotary vacuum evaporator예서 용매를 제거하여 총지질을 얻었다.
성능/효과
- RAPD-PCR 결과, 약 400〜10, 000 bp 범위에서 다양한 크기의 밴드가 확인되었다. 각 primer당 평균 12개의 band를 얻었으며 이들은 총 144개의 밴드로 115개 (79.
- 본 연구는 들깨 유전자원의 유전적 특성 분석을 위해 들깨 계통 및 품종의 유전적 변이를 DNA 수준예서 비교하고, 이들의 유전적 근연성 및 변이정도를 규명하여 육종의 기초자료로 제공하기 위하여 수행한 연구로 그 주요 결과는 다음과 같다. RAPD를 이용하여 국내예서 수집한 들깨 계통 및 품종 의 DNA polymorphism을 관찰한 결과, 220개 의 primer 중 13 개의 변별력 있는 primer가 선발되었고, 이들 primer는 144개의 밴드를 나타났으며 이 중 polymorphic 밴드는 115개 였고, 29개는 monomorphic 밴드였다. UPGMA법애 의한 유사도 계수는 0~0.
- RAPD를 이용하여 국내예서 수집한 들깨 계통 및 품종 의 DNA polymorphism을 관찰한 결과, 220개 의 primer 중 13 개의 변별력 있는 primer가 선발되었고, 이들 primer는 144개의 밴드를 나타났으며 이 중 polymorphic 밴드는 115개 였고, 29개는 monomorphic 밴드였다. UPGMA법애 의한 유사도 계수는 0~0.7842였고 유사도 계수 matrix를 이용한 유연관계의 분석결과 42 들깨 계통 및 품종은 크게 두 가지 그룹을 형성하였으며 이 결과는 전반적으로 MP법에 의해 얻어진 결과 와 일치하였다. 농업형질인 마디수,천립증,유지함량과 이들 두 그룹과의 관련을 비교한 결과 전반적으로 그룹 A에는 마디수가 많은 품종이, 천중립이 높은 품종이 그리고 유지함량이 높은 품종이 다수 포함되어 있었으나 구체적으로는 이들 농업형질과의 밀접한 관련성을 확인하지 못하였다.
- RAPD-PCR 결과, 약 400〜10, 000 bp 범위에서 다양한 크기의 밴드가 확인되었다. 각 primer당 평균 12개의 band를 얻었으며 이들은 총 144개의 밴드로 115개 (79.9%)가 품종간 polymorphism을 보였으며 29개 (20.1 %)는 monomorphism을 보였다. 주요 밴드를 대상으로 한 품종간의 차이를 비교한 결과 OPN11 primer 로부터 얻은 밴드 (Figure 1)의 경우 Tongyeong (1) 등 24개의 품종에서는 DNA 증폭이 확실한 반면, Kimhae 2 ⑺를 포함한 7개 품종에서는 그 밝기가 비교적 약하였고 Suwon 8 ⑵을 포함한 9개의 품종은 전혀 증폭되지 않았다 (Figure 1).
- 각 primer당 평균 12개의 밴드를 얻었으며, 총 144개의 밴드로 약 115개 (79.9%) 의 polymqphic band와 29개 (20.1 %)의 mono morphic band가 나타났다. 원추리속 (Genus Hemerocallis의 RAPD primer 선발 (Han et al.
- 아울러 PAUP에 의한 유전적 분화율에 대한 분석 결과 42 계통 및 품종을 기준으로 했을 경우, 가장 낮은 분화율은 Pyeongtaek (38)과 Cheongyang (39) 사이예서 관찰되는 등 PAUP에 의한 분석 결과는 전반적으로 NTSYS에 의한 분석 결과와 일치하는 경향이었다.
- 속한 품종을 기준으로 이들 수치를 비교하였다. 우선 마디 수와 비교한 결과, 그룹 A의 평균 마디수는 12.35로 10.76인 그룹 B에 비해 상당히 높은 수치를 보였으며 전반적으로 마디 수가 14〜15개 사이로 상대적으로 높은 수치를 나타내는 품종 및 계통들은 그룹 A에 많이 속하는 경향이 있는 반면 마디 수가 10〜13개로 낮은 품종은 그룹 B예 속하는 경우가 있었다. 그러나 많은 품종들이 이러한 원칙에 따라 확연히 구분이 되는 것은 아니었다.
- 유지함량과 비교한 결과, 그룹 A의 평균 유지함량은 44.2% 로 39.29%인 그룹 B와 상당한 함량차이를 보였다. 그룹 A에 속하는 품종 중 Ok-dong (4), Kimhae2 (7), Daegu (8), Jeju (17) 은 50〜53%의 유지함량을 나타내며 그룹 A예 속한 반면 Andong(32)은 유지함량이 52%로 매우 높은 편이었지만 그룹 A에 속하지는 않았다.
- 이상의 유사도계수 matrix를 이용하여 UPGMA 법에 의한 들깨 42계통 및 품종의 계통수를 구한 결과, 42계통 및 품종은 2개의 큰 그룹으로 나뉘어졌다 (Figure 2; group A 및 group B로 명명). 그룹 A는 약 0.
- 1 %)는 monomorphism을 보였다. 주요 밴드를 대상으로 한 품종간의 차이를 비교한 결과 OPN11 primer 로부터 얻은 밴드 (Figure 1)의 경우 Tongyeong (1) 등 24개의 품종에서는 DNA 증폭이 확실한 반면, Kimhae 2 ⑺를 포함한 7개 품종에서는 그 밝기가 비교적 약하였고 Suwon 8 ⑵을 포함한 9개의 품종은 전혀 증폭되지 않았다 (Figure 1).
- 천립증과 비교한 결과, 그룹 A의 평균 천립증은 3.456 g으로 2.69 g인 그룹 B에 비해 상당히 낮은 수치를 보였다. 구체적으로 그룹 A에는 Tongyeong (1), Geuimieung (9), Okcheon (12) 등 천립증이 4.
- 총 144개의 밴드 중 polymorphism을 보이는 115개를 이용하여 UPGMA와 MP 분석을 실시한 결과, 사용된 들깨는 전반적으로 두 개의 그룹을 형성하였지만 각 품종의 마디수, 천립증, 유지함량 등의 농업형질과 관련하여서는 뚜렷한 구분이 되지 않았다. 그러나 전반적으로는 그룹A에는 마디수가 많은 품종이, 천중립이 높은 품종이 그리고 유지함량이 높은 품종이 다수 포함되어 향후 추가적인 연구가 진척된다면 유전 및 육종연구에 유용한 기초자료가 될 수 있음을 확인할 수 있었다.
후속연구
- 않았다. 그러나 전반적으로는 그룹A에는 마디수가 많은 품종이, 천중립이 높은 품종이 그리고 유지함량이 높은 품종이 다수 포함되어 향후 추가적인 연구가 진척된다면 유전 및 육종연구에 유용한 기초자료가 될 수 있음을 확인할 수 있었다.
- 7842였고 유사도 계수 matrix를 이용한 유연관계의 분석결과 42 들깨 계통 및 품종은 크게 두 가지 그룹을 형성하였으며 이 결과는 전반적으로 MP법에 의해 얻어진 결과 와 일치하였다. 농업형질인 마디수,천립증,유지함량과 이들 두 그룹과의 관련을 비교한 결과 전반적으로 그룹 A에는 마디수가 많은 품종이, 천중립이 높은 품종이 그리고 유지함량이 높은 품종이 다수 포함되어 있었으나 구체적으로는 이들 농업형질과의 밀접한 관련성을 확인하지 못하였다.
- 1996)시 76개의 밴드가 나타난 것과 비교해 볼 때 다소 높은 수의 polymorphic 밴드를 나타내었다. 이러한 결과는 추후 들깨의 RAPD 분석을 통한 다형성 연구 및 유연관계, 형질과 관련된 유용 마커의 선발시 많은 다양한 primer 의 screening 이 필요함을 의미한다.
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