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문제 정의
- 본 논문에서는 3종류의 유전자 그룹을 이용한 원핵생물의 분류와 그 결과를 16S rRNA 유전자를 이용한 분류와의 비교를 목적으로 한다.
제안 방법
- 원핵생물 (procaryote)의 분류에 16S rRNA 유전자가 많이 이용되어 있으나 제한된 해상력과 유전자의 수에 차이가 있는 등의 문제가 있어 이를 보완할 수 있는 새로운 생체분자를 찾고 그 분류 결과를 16S tRNA의 결과와 비교하였다. COG (Clusters of Orthologous of protein) 방법을 이용하여 43종의 미생물중에서 진핵생물을 제외한 42종의 원핵생물 (procaryote)에서만 발견되는 3종류의 COG인 Transcription elongation factor인 COG0195과 bacterial DNA primase인 COG0358 그리고 uridylate kinase인 COG0528를 구하였다. 이 중 유사도와 유전자 수를 바탕으 로 새로운 분류의 키로 uridylate kinase를 설정하여 분석한 결과, 같은 속(genus)에 속하는 세균들은 아주 높은 bootstrap value를 갖고 분류도에서 같은 위치에 분포하고 고세균 (Archaebacteria) 내부의 응집성이 높은 등의 유사성을 보였다.
- 분석대상 원핵생물은 고세균(Archebacteria)가 9종, 세균 중 Finnicutes가 9종, Proteobacteria가 16종' 기타 8종 이었다[12]. COGs 데이터베이스의 자료를 종(species)과 orthologs에 따라 2차원으로 재정렬하여 개별 orthologs 를 종을 기준으로 분류하였다. 이후 각 그룹별로 보존적 유전자의 항목을 배열화하였다.
- 보존적 유전자 탐색 과정을 진핵생물인 효모를 포함하는 43종의 미생물에 대하여 수행하여 총 72종의 COG를 얻었다[12]. 보존적 유전자 탐색 과정을 42종의 원핵생물에 대하여 수행하였고[1 이 여기서 구한 COG 중 43종의 미생물에서 보존적인 것을 제외한 것들은 원핵생물들이 공통 적으로 보유하는 COG로 간주하였다.
- 원핵생물 (procaryote)의 분류에 16S rRNA 유전자가 많이 이용되어 있으나 제한된 해상력과 유전자의 수에 차이가 있는 등의 문제가 있어 이를 보완할 수 있는 새로운 생체분자를 찾고 그 분류 결과를 16S tRNA의 결과와 비교하였다. COG (Clusters of Orthologous of protein) 방법을 이용하여 43종의 미생물중에서 진핵생물을 제외한 42종의 원핵생물 (procaryote)에서만 발견되는 3종류의 COG인 Transcription elongation factor인 COG0195과 bacterial DNA primase인 COG0358 그리고 uridylate kinase인 COG0528를 구하였다.
- 원핵생물 42종에 보존적인 COG를 선정한 후에 COG 홈페이지[15]를 경유하여 NCBI에서 각 원핵생물의 COG에 해당하는 핵산염기서열과 아미노산 서열을 구하였다.
- 원핵생물 수준에서 보존적인 COG에 속하는 각 원핵생 물 보유의 염기서열과 16S rDNA의 염기서열들은 ClustalX (ver. 1.64b) 프로그램을 이용하여 multiple alignmnent를 수행하고 manual alignment-1- 통하여 보정하였다. Neighbor joining method와 bootstrap method (n=1000)로 상관관계를 분석하였다[16].
- COGs 데이터베이스의 자료를 종(species)과 orthologs에 따라 2차원으로 재정렬하여 개별 orthologs 를 종을 기준으로 분류하였다. 이후 각 그룹별로 보존적 유전자의 항목을 배열화하였다.
- 전체 유전자 염기서열에서 rRNA 그룹을 조사하여 16S rRNA 유전자의 염기서열을 추출하였고, 이것이 불가능한 경우에는 RDP-II (http://rdp.cme.msu.edu)의 hierarchy browser를 이용하여 16S rRNA 유전자의 염 기서 열이 1200 bp 이상인 것만을 추출하였다.
- 또한 COG0195와 COG0358의 경우는 한 생물내에 중복되는 유전자와 관찰되는 반면 COG0528의 경우 하나의 미생물에 하나의 유전자만 존재하므로 각 미생물은 유전자의 중복성에 의한 문제를 피할 수 있다는 것을 알 수 있었고 세균 각종에 대해 정량적인 비교와 진화적 관점의 파악이 유리하다고 사료되었다. 한편 고세균의 경우 COG0358 (bacterial primase)을 그리고 진정세균의 경우 COG0195 (transcription elongation factor) 를 이용한 분류도 가능할 것으로 사료되었지만 (Table 1) Ilyina 등[6]이 primase를 그리고 Baldauf 등[기이 elonga tion factor를 이용한 분류를 시도한 보고가 있어 본 논문에서는 분류의 새로운 분자로서 uridylate kinase를 적용하 였다.
대상 데이터
- Table 1에 표시된 분석에 이용한 42종의 원핵생물(procaryote) 유전체(genome)는 National Center for Bio technology Information (NCBI)의 공개 서버로부터 추출 하였다[14]. 미생물 유전자의 유사성에 관한 자료는 COGs 에서 정리된 자료를 이용하였는데[15] 이들은 2002년 4월 현재 43종의 미생물 유전체를 ortholog 그룹으로 분류하여, 총 77, 069개의 유전자들을 3, 852개 의 단백질 그룹으로 분류해 놓았다.
이론/모형
- 64b) 프로그램을 이용하여 multiple alignmnent를 수행하고 manual alignment-1- 통하여 보정하였다. Neighbor joining method와 bootstrap method (n=1000)로 상관관계를 분석하였다[16].
성능/효과
- COG0528인 uridylate kinase의 경우 16S rRNA 유전자처럼 보존성이 아주 높지는 않았지만 (Table 1) 오히려 이러한 점이 16S rRNA 유전자의 아주 높은 보존성에 의해서 생기는 유연관계의 과소 혹은 과대평가를 줄일 수 있을 것이며 16S rRNA와 상호 보완적인 결과로 원핵생물의 정확한 분류에 기여할 수 있을 것으로 사료되었다[5]. 한편 고세균의 경우 COG0358 (bacterial primase)을 그리고 Eub- acteria 의 경우 COG0195 (transcription elongation factor)를 이용한 분류까지 첨가된다면 보다 정확한 분류가 가능 할 것으로 사료되었다.
- 이 중 유사도와 유전자 수를 바탕으 로 새로운 분류의 키로 uridylate kinase를 설정하여 분석한 결과, 같은 속(genus)에 속하는 세균들은 아주 높은 bootstrap value를 갖고 분류도에서 같은 위치에 분포하고 고세균 (Archaebacteria) 내부의 응집성이 높은 등의 유사성을 보였다. 한편 alpha와 epsilon 그룹의 Proteobacteria?} 분류도에서 다르게 위치하고 진정세균 (Eubacteria)의 Spi- rochaetales에 속하는 Treponema pallidum (Tpa)와 Borrelia burgdorferi (Bbu)가 고세균과 유연관계가 높게 나타나는 등 차이점도 보였다. Uridylate kinase를 이용한 분류는, 아주 높은 보존성에 의해서 생기는 16S rRNA 유전자를 이용한 문제점을 보완하여 원핵생물의 정확한 분류에 기여할 수 있을 것으로 사료되었다.
- 16S rRNA 유전자를 이용한 분류에서는 고세균, 진정세균에 속하는 Firmicutes와 Proteobacteria 그리고 기타진 정세균의 4 그룹으로 나누어졌다. 고세균은 진정세균의 Firmicutes와 상관관계가 높은 것을 알 수 있었고 Pro teobacteria 5]- Firmicutes에 속하지 않는 기타 진정세균과의 상관관계도 어느 정도 높은 것을 알 수 있었다 (Fig. la).
- 1을 보면 uridylate kinase 유전자를 이용한 분류에서는 16S rRNA 유전자를 이용한 분류와 공통점과 차이점 이 있는 것을 알 수 있었다. 공통점은 첫째 uridylate kinase 를 이용한 분류가 16S rRNA를 이용한 분류처럼 같은 속(genus)에 속하는 세균들은 아주 높은 bootstrap value를갖고 같은 위치에 분포하는 것으로 드러났다. 둘째 고세균 내부의 응집성이 높은 것을 알 수 있었고 16S rRNA와 같이 Crenarchaeota인 Aeropyrum pernix (Ape)가 상대적인 상관관계가 낮게 나왔다.
- 이런 유전자 그룹은 세균 각종에 대해 정량적인 비교와 진화적 관점의 파악이 유리하다고 할 것이다. 그러나 16S rRNA 유전자 이외의 유전자 그룹 중 일부는 COG 검색을 해보면, 42종의 원핵생물 모두가 이러한 유전자를 가지고 있지는 않는 것으로 드러나 비교대상 미생물이 한정될 수 밖에 없거나 진핵생물과 공통적으로 존재하여 원핵생물만의 분류를 위한 분자가 아니라는 것을 알 수 있었다. Table 1에 나타난 COG0195, COG0358, COG0528 그룹은 42종의 원핵생물에서만 분포하는 분자들로 원핵생물들 만의 분류를 위한 새로운 분자(molecular clock)의 후보가 될 수 있다고 추측되었다.
- 셋째 기타 진정세균으로 분류하였던 세균들이 16S rRNA에서 하나의 그룹을 형성했던 것과는 달리 진정세균의 Spirochaetales0]] 속하는 Treponema pallidum (Tpa)와 Borrelia burgdorferi (Bbu)가 고세균과 유연관계가 높은 것으로 드러났다. 넷째 16S rRNA를 이용한 분류에서는 gamma-ProteobacteTia가 고세균과 유연관계가 먼 것으로 나타났는데 uHdylate kinase를 이용한 분류에서는 gamma-Proteobacteria일부는 16S rRNA보다 고세균과 유연관계가 높은 것으로 나타났다. 이러한 양상은 최대절 약법(parsimony)을 이용한 결과에서도 유사한 것으로 나타났다.
- 하지만 16S rRNA와의 차이점을 보이는 부분도 있었는데 첫째 Firmucutes에 속하는 세균들이 3 군데로 흩어지고 gamma-Proteobacteria에 속하는 일부 세균도 다른 세균들과 그룹을 형성하는 것으로 나타났다. 둘째 Proteobacteria의 alpha와 epsilon 그룹들이 분류도에서 16S tRNA와 다 른 결과를 보였다. 셋째 기타 진정세균으로 분류하였던 세균들이 16S rRNA에서 하나의 그룹을 형성했던 것과는 달리 진정세균의 Spirochaetales0]] 속하는 Treponema pallidum (Tpa)와 Borrelia burgdorferi (Bbu)가 고세균과 유연관계가 높은 것으로 드러났다.
- 공통점은 첫째 uridylate kinase 를 이용한 분류가 16S rRNA를 이용한 분류처럼 같은 속(genus)에 속하는 세균들은 아주 높은 bootstrap value를갖고 같은 위치에 분포하는 것으로 드러났다. 둘째 고세균 내부의 응집성이 높은 것을 알 수 있었고 16S rRNA와 같이 Crenarchaeota인 Aeropyrum pernix (Ape)가 상대적인 상관관계가 낮게 나왔다. 셋째 고세균 그룹이 진정세균의 Firmicutes 그룹 일부와 상관관계가 상대적으로 높게 나왔다.
- Table 1에 나타난 COG0195, COG0358, COG0528 그룹은 42종의 원핵생물에서만 분포하는 분자들로 원핵생물들 만의 분류를 위한 새로운 분자(molecular clock)의 후보가 될 수 있다고 추측되었다. 또한 COG0195와 COG0358의 경우는 한 생물내에 중복되는 유전자와 관찰되는 반면 COG0528의 경우 하나의 미생물에 하나의 유전자만 존재하므로 각 미생물은 유전자의 중복성에 의한 문제를 피할 수 있다는 것을 알 수 있었고 세균 각종에 대해 정량적인 비교와 진화적 관점의 파악이 유리하다고 사료되었다. 한편 고세균의 경우 COG0358 (bacterial primase)을 그리고 진정세균의 경우 COG0195 (transcription elongation factor) 를 이용한 분류도 가능할 것으로 사료되었지만 (Table 1) Ilyina 등[6]이 primase를 그리고 Baldauf 등[기이 elonga tion factor를 이용한 분류를 시도한 보고가 있어 본 논문에서는 분류의 새로운 분자로서 uridylate kinase를 적용하 였다.
- 미생물 유전자의 유사성에 관한 자료는 COGs 에서 정리된 자료를 이용하였는데[15] 이들은 2002년 4월 현재 43종의 미생물 유전체를 ortholog 그룹으로 분류하여, 총 77, 069개의 유전자들을 3, 852개 의 단백질 그룹으로 분류해 놓았다. 분석대상 원핵생물은 고세균(Archebacteria)가 9종, 세균 중 Finnicutes가 9종, Proteobacteria가 16종' 기타 8종 이었다[12]. COGs 데이터베이스의 자료를 종(species)과 orthologs에 따라 2차원으로 재정렬하여 개별 orthologs 를 종을 기준으로 분류하였다.
- 둘째 고세균 내부의 응집성이 높은 것을 알 수 있었고 16S rRNA와 같이 Crenarchaeota인 Aeropyrum pernix (Ape)가 상대적인 상관관계가 낮게 나왔다. 셋째 고세균 그룹이 진정세균의 Firmicutes 그룹 일부와 상관관계가 상대적으로 높게 나왔다.
- 둘째 Proteobacteria의 alpha와 epsilon 그룹들이 분류도에서 16S tRNA와 다 른 결과를 보였다. 셋째 기타 진정세균으로 분류하였던 세균들이 16S rRNA에서 하나의 그룹을 형성했던 것과는 달리 진정세균의 Spirochaetales0]] 속하는 Treponema pallidum (Tpa)와 Borrelia burgdorferi (Bbu)가 고세균과 유연관계가 높은 것으로 드러났다. 넷째 16S rRNA를 이용한 분류에서는 gamma-ProteobacteTia가 고세균과 유연관계가 먼 것으로 나타났는데 uHdylate kinase를 이용한 분류에서는 gamma-Proteobacteria일부는 16S rRNA보다 고세균과 유연관계가 높은 것으로 나타났다.
- Mycobacterium leprae (Mie)와 Mycobacterium tuberculosis (Mtu) 그리고 Escherichia coli K12 (Eco)와 Escherichia coli 0157 (EcZ)의 경우 같은 속(genus)에 속하는데 COG0195 의 구성원들을 보면 각각 ML1558와 Rv2841 그리고 nusA 와 ZnusA 유전자를 보유하였다. 유사도 측면에서 보면 각각 핵산에서는 82.78%와 99.40%의 유사도를 보인 반면 아 미노산에서는 100%의 유사도를 보였다. 아미노산의 유사 도가 핵산의 유사도 보다 높은 것은 redundancy5.
- COG0195와 COG0358은 각각 기능별로 보면 K (transcription)와 L (DNA replication, recombi nation and repair)에 속하는 것이었다. 유전정보의 저장과 발현에 관계되는 것으로 진핵생물을 포함하는 43종의 미생 물이 보유하는 72종의 COG중 translation에 관여하는 COG 가 52종 이었고 transcription에 관련되는 COG가 4종 그리고 replication에 관여하는 COG가 3종인 것과 비교하면 [12], 원핵생물이 진핵생물과는 transcription과 translation에서 차이를 보이는 진화적 분기가 있었다고 사료되었다. Uridylate kinase는 COG site의 기능분류상 F (Nucleotide transport and metabolism)에 속하는 것으로 ATP와 UMP 를 이용하여 ADIN UDP을 만들어내는 효소로 pyrimidine ribonucleotide의 de novo biosynthesis에 관여하며 cytosol과 membrane 근처에 분포하는 것으로 알려져 있다[17, 18],
- COG (Clusters of Orthologous of protein) 방법을 이용하여 43종의 미생물중에서 진핵생물을 제외한 42종의 원핵생물 (procaryote)에서만 발견되는 3종류의 COG인 Transcription elongation factor인 COG0195과 bacterial DNA primase인 COG0358 그리고 uridylate kinase인 COG0528를 구하였다. 이 중 유사도와 유전자 수를 바탕으 로 새로운 분류의 키로 uridylate kinase를 설정하여 분석한 결과, 같은 속(genus)에 속하는 세균들은 아주 높은 bootstrap value를 갖고 분류도에서 같은 위치에 분포하고 고세균 (Archaebacteria) 내부의 응집성이 높은 등의 유사성을 보였다. 한편 alpha와 epsilon 그룹의 Proteobacteria?} 분류도에서 다르게 위치하고 진정세균 (Eubacteria)의 Spi- rochaetales에 속하는 Treponema pallidum (Tpa)와 Borrelia burgdorferi (Bbu)가 고세균과 유연관계가 높게 나타나는 등 차이점도 보였다.
- COG0195, COG0358, COG0528은 비교대상 원 핵생물에 모두 존재하는 유전자로 각 COG에서 보이는 핵산과 아미노산의 유사도는 Table 2에 나타내었다. 전체적으로 보면 핵산의 유사도보다 아미노산의 유사도가 높은 것을 알 수 있으며, 변이도를 보면 고세균 (Archaebacteria) 에서 COG0195가 진정세균 (Eubacteria)에서는 COG0358이 핵산과 아미노산 모두에서 큰 것을 알 수 있었다. 진화 속도의 문제가 있겠지만 수치상으로는 원시조상 고세균에 서 COG0195가 아주 오래전부터 존재하여 많은 변이가 있는 것으로 추측할 수 있었다.
- 전체적으로 보면 핵산의 유사도보다 아미노산의 유사도가 높은 것을 알 수 있으며, 변이도를 보면 고세균 (Archaebacteria) 에서 COG0195가 진정세균 (Eubacteria)에서는 COG0358이 핵산과 아미노산 모두에서 큰 것을 알 수 있었다. 진화 속도의 문제가 있겠지만 수치상으로는 원시조상 고세균에 서 COG0195가 아주 오래전부터 존재하여 많은 변이가 있는 것으로 추측할 수 있었다.
- 하지만 16S rRNA와의 차이점을 보이는 부분도 있었는데 첫째 Firmucutes에 속하는 세균들이 3 군데로 흩어지고 gamma-Proteobacteria에 속하는 일부 세균도 다른 세균들과 그룹을 형성하는 것으로 나타났다. 둘째 Proteobacteria의 alpha와 epsilon 그룹들이 분류도에서 16S tRNA와 다 른 결과를 보였다.
- 하지만 COG0358과 COG0528의 경우에는 진정세균 서로간의 변이정도가 고세균 서로간의 변이정도보다 범위가 넓고 최소치도 낮아, 하나의 유전자로 생물군의 진화정도 를 파악하기에는 오류가 있을 가능성이 높음을 알 수 있었다. 한 유전자가 수평전달 (horizontal gene transfer)이 되면 다른 유전자들의 유사도보다 훨씬 높은 유사도가 발생할 수 있다는 보고도 있었다[19, 2이.
후속연구
- 한편 alpha와 epsilon 그룹의 Proteobacteria?} 분류도에서 다르게 위치하고 진정세균 (Eubacteria)의 Spi- rochaetales에 속하는 Treponema pallidum (Tpa)와 Borrelia burgdorferi (Bbu)가 고세균과 유연관계가 높게 나타나는 등 차이점도 보였다. Uridylate kinase를 이용한 분류는, 아주 높은 보존성에 의해서 생기는 16S rRNA 유전자를 이용한 문제점을 보완하여 원핵생물의 정확한 분류에 기여할 수 있을 것으로 사료되었다.
- 강 등[12]은 COG를 이용하여 42종의 원핵생물과 1종의 진핵생물 모두에 분포하는 유전자 72종을 밝혔으며, 이 등[13]은 원핵생물 42종 모두에 분포하는 75종의 유전자를 밝혔다. 두 보고[12, 13]에서 차이가 나는 3종류의 유전자 그룹은 원핵생물에서만 발견되는 것으로 이들은 원핵생물의 분류에 이용될 가능성이 높다고 할 것이다.
- 한편 고세균의 경우 COG0358 (bacterial primase)을 그리고 Eub- acteria 의 경우 COG0195 (transcription elongation factor)를 이용한 분류까지 첨가된다면 보다 정확한 분류가 가능 할 것으로 사료되었다. 본 연구결과는 16S rRNA 유전자만을 이용하여 분류할 때 단점을 보완하는데 이용가능할 것이며, 특히 bootstrap value가 높은 같은 속이나 종에서는 16S rRNA를 이용한 분류와 동등하게 사용될 수 있을 것 이다.
- 원핵생물에서만 발견되는 유전자는 16S rRNA 등과 함께 원핵생물을 분류하는 분자로서의 기능을 수행할 수 있을 것이다. 분류에 사용되는 분자의 조건은 비교대상생물 에서 모두 발견되어야 하고 보존성이 높아야하며 동시에 각 생물이 구분될 수 있는 변이가 있어야 하는 것으로 알려져 왔다.
- COG0528인 uridylate kinase의 경우 16S rRNA 유전자처럼 보존성이 아주 높지는 않았지만 (Table 1) 오히려 이러한 점이 16S rRNA 유전자의 아주 높은 보존성에 의해서 생기는 유연관계의 과소 혹은 과대평가를 줄일 수 있을 것이며 16S rRNA와 상호 보완적인 결과로 원핵생물의 정확한 분류에 기여할 수 있을 것으로 사료되었다[5]. 한편 고세균의 경우 COG0358 (bacterial primase)을 그리고 Eub- acteria 의 경우 COG0195 (transcription elongation factor)를 이용한 분류까지 첨가된다면 보다 정확한 분류가 가능 할 것으로 사료되었다. 본 연구결과는 16S rRNA 유전자만을 이용하여 분류할 때 단점을 보완하는데 이용가능할 것이며, 특히 bootstrap value가 높은 같은 속이나 종에서는 16S rRNA를 이용한 분류와 동등하게 사용될 수 있을 것 이다.
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