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문제 정의
- 본 연구는 (쥐 대웅제약에서 개발한 DWP413의 적혈구 생성족진 효능을 평가하기 위하여 normocythemic model, 정상모델, 급성실혈모델* cisplatin 신장해 빈혈모델을 이용하여 실시하였다.
- 또한 DWP413은 국내개발 기존제품과는 달리 그 제형에 인혈 청알부민을 포함하고 있지 않아 바이러스 등의 외부 감염원으로부터 안전하다. 본 연구는 재조합 사람erythropoietin인 DWP413의 생물학적인 활성을 normocy- themic model에서 평가하여 역가를 구한후, 정상, 급성줄 혈성 빈혈 및 cisplatin 유발 신장해 빈혈모델을 이용하여 EPO의 약효를 확인하고자 실시되었다
제안 방법
- Cisplatin에 의한 신장해 빈혈 랫드에 미치는 rh-EPO의 영향을 평가하기 위해 Matsunaga 등(1991)의 실험방법대로 실시하였다. 7주령 랫드에 cisplatin(7 mg/kg)를 1회 미정맥내투여하여 신장독성을 유발시킨 후 18일째부터DM413을 0, 50, 100, 200IU/kg의 용량으로 5일간, 1일 1회 미정맥으로 투여하였다. 투여전, 투여개시후 18, 21, 25, 28, 32, 35일째에 혈액을 채취하여 혈액학적인 변화를 측정하였고, 최종 혈액을 채취한 후.
- 2)을 희석용액으로 사용하였으며, EPO 국제표준품인 erythropoietin BRP(British Reference Product)와 역가추정치를 구한 DWT413 원액을 20, 40, 80IU/ml로 희석시켰다. B6D2F1 mouse에 미리당 0.5 ml의 용량으로 1회 피하주사한 뒤, 4일후에 혈액을 채취하여 세망적혈구를측정한 후 BRP standard EPO와 EWP413의 농도별 세망 적혈구수를 parallel line test를 실시하여 생물학적 활성을 구하였다.
- Cisplatin : Cisplatin(cis-diamimminodichloroplatinum (IT))는 Sigma(USA)시약을 구입하여 생리식염수에 7 mg/ml로 용해시켜 kg당 1ml씩 정맥내 투여하였다.
- 투여전, 투여개시후 18, 21, 25, 28, 32, 35일째에 혈액을 채취하여 혈액학적인 변화를 측정하였고, 최종 혈액을 채취한 후. 실험동물을 희생시킨 후 신장을 10% 중성포르말린 용액에 고정하여 통상적인 조직 처리과정을 거쳐 Hematoxylin & Eosin 염색후 병리 조직 학적인 소견을 관찰하였다.
- IKW4I3 의 생물학적 활성측정을 위해 유럽약전(European Phamiacopeia, 2002)에 기재된 nomiocythemicmice 시험법을 이용하였다. 인혈청알부민이 첨가된 인산완충용액 (pH 7.2)을 희석용액으로 사용하였으며, EPO 국제표준품인 erythropoietin BRP(British Reference Product)와 역가추정치를 구한 DWT413 원액을 20, 40, 80IU/ml로 희석시켰다. B6D2F1 mouse에 미리당 0.
- 정상랫드에서의 실험 : DWF413의 투여는 정상랫드에 0, 50, 250, 1250IU/kg의 용량으로 5일간, 1일 1회 미정맥으로 부여하였다. 투여전과, 투여개시후 3, 7, 10 및 14일째에 혈액을 채취하여 혈액학적인 변화를 측정하였다.
- 5%)를 실혈시킨 후 1일 후에 DWP413을 0, 15Q 450, I350IU/kg의 용량으로 5일간, 1일 1회 꼬리정맥으로 투여하였디. 투여전, 투여개시후 1, 3, 5, 10, 15일째에 혈액을 채취하여 혈액학적인 변화를 측정하였다.
- 7주령 랫드에 cisplatin(7 mg/kg)를 1회 미정맥내투여하여 신장독성을 유발시킨 후 18일째부터DM413을 0, 50, 100, 200IU/kg의 용량으로 5일간, 1일 1회 미정맥으로 투여하였다. 투여전, 투여개시후 18, 21, 25, 28, 32, 35일째에 혈액을 채취하여 혈액학적인 변화를 측정하였고, 최종 혈액을 채취한 후. 실험동물을 희생시킨 후 신장을 10% 중성포르말린 용액에 고정하여 통상적인 조직 처리과정을 거쳐 Hematoxylin & Eosin 염색후 병리 조직 학적인 소견을 관찰하였다.
- 정상랫드에서의 실험 : DWF413의 투여는 정상랫드에 0, 50, 250, 1250IU/kg의 용량으로 5일간, 1일 1회 미정맥으로 부여하였다. 투여전과, 투여개시후 3, 7, 10 및 14일째에 혈액을 채취하여 혈액학적인 변화를 측정하였다.
- 흡입 마취 (Isoflurane/oxygen/nitrogen)하에서 심장첨자하여 총 혈액의 20%(체중의 1.5%)를 실혈시킨 후 1일 후에 DWP413을 0, 15Q 450, I350IU/kg의 용량으로 5일간, 1일 1회 꼬리정맥으로 투여하였디. 투여전, 투여개시후 1, 3, 5, 10, 15일째에 혈액을 채취하여 혈액학적인 변화를 측정하였다.
- 흡입 마취 (Isoflurane/oxygen/nitrogen)후 안와정 맥 총으로 부터 heparinized capillary tube(Fisher Scientific Ltd.CANADA)를 사용하여 채혈한 후 지-동혈구측정기(Cell- Dyn 3500, ABBOT, USA)를 이용하여 적혈구수, 헤마토크리트치, 헤모글로빈 농도를 측정하였다. 또한 세망적혈구는 채취한 혈액 2μl를 reticOne reagent kit(Beckmann coulter, PN7547059)시약으로 500배 희석하여 상온에서 20분간 반응시킨 후 유세포 분석기 (EPICS XL-MCL (Beckmann Coulter Co.
대상 데이터
- DWP413:(쥐대웅제약 생명과학연구소에서 생산한recombinant human eiythropoietin(rh-EPO, code name DWP413; Lot No. PU002)을 사용하였다. 투여전 시험물질 은 -2CFC에서 보관하였고 사용시에는 투여전일에 희석용 용매로 처치군의 시험물질을 조제하여 1일 필요량씩 분주하여 냉장보관하였다.
- 체중 250 g 전후의 응성 Sprague Dawley 랫드와 7주 령의 웅성 B6D2F1 mouse는 일본 Chailes River사 (Atsugi, Japan)에서 구입하여 (주)대웅제약 실험동물 사육 실에서 1주간 순화시킨 후 건강한 동물만을 선별하여 실험에 사용하였다. 순화기간과 실험기간중의 동물 사육환경은 온도 22 ± 3℃, 상대 습도 55 ±15%, 조명 시 간 12시 간 (08:00 점등~20:00 소등), 조도 150~300Lux 및 환기횟수 15회/시간의 조건을 유지하였으며, 사료와 물은 자유섭취 시켰다
- 효능시험에 사용하는 DWP413 원액의 역기롤 구하기 위해서, 국제표준품인 erythropoietin ERP과의 bioassay를 싵시한 결과 22.43%의 활성을 나타냈으며, 이를 기준으로 역가를 구하여 효능시험에 사용하였다.
- 0로 조정하였다. 희석용 용매의 조제를 위한 시약은 모두 Sigma사에서 구입하여 사용하였다.
데이터처리
- 모든 실혐결과는 mean ±S.E.로 표현하였으며 대조군과 처치군의 평균값의 차이는 student's l-test를 실시히-여, 대조군과 비교하여 p값이 0.05 미만일때 통계학적으로 유의성이 있다고 판정하였고, normocythemic mouse에서의 생물학적 활성평가는 유럽약전(2002)에 따라 parallel line assay를 실시하여 판정하였다.
이론/모형
- Cisplatin에 의한 신장해 빈혈 랫드에 미치는 rh-EPO의 영향을 평가하기 위해 Matsunaga 등(1991)의 실험방법대로 실시하였다. 7주령 랫드에 cisplatin(7 mg/kg)를 1회 미정맥내투여하여 신장독성을 유발시킨 후 18일째부터DM413을 0, 50, 100, 200IU/kg의 용량으로 5일간, 1일 1회 미정맥으로 투여하였다.
- IKW4I3 의 생물학적 활성측정을 위해 유럽약전(European Phamiacopeia, 2002)에 기재된 nomiocythemicmice 시험법을 이용하였다. 인혈청알부민이 첨가된 인산완충용액 (pH 7.
성능/효과
- 01) 증가를 보였고 7일째에 최고치를 나타낸 후. 10일째(cisplatin 투여 28일째)에 모든 군에서 vehicle에 비해 유의적인 감소경향이 나타났다. 시험 최종일에 부검하여 관찰한 신장의 병리조직학적 소견에서 cisplatin 에 의한 독성변회는 주로 피질부위에서 나타났으며, 신 사구체와 보우만씨 낭의 유착(adhesion), 원위곡세뇨관(distal convoluted tubule) 또는 집합관(collecting tubule) 의 낭성 확장과 세뇨관 증식성 변화(tubular hyperplasia)를 보였다.
- 랫드에 cisplatin(7 mg/kg)을 1회 정맥투여한 결과 적혈구수, 헤마토크리트 치, 혜모글로빈 농도의 현저한 감소가 관찰되었디-.Cisplatin 투여후 18일째부터 DWP413을 1일 1회 5일동 안 정맥투여하였으며, 투여개시 3일째 (cisplatin 투여 21 일째)에 모든 투여군에서 RBC수의 증가가 나타나기 시작하여 DWP413 투여개시 7일째에 최고치를 나타낸 후 감소하는 경향을 보였다. 헤마토크리트치 에 서는DWP413 투여개 시 3일째에 100, 200 IU/kg 투여군에서 vehicle에 비헤 유의성있는(p<0.
- Cisplatin에 의한 빈혈은 cisplatin의 직접적인 신징헤에 의한 EPO의 생성 감소, 조혈조직에 대한 EPO 의 작용억제, 골수내의 CFU-E에 직접적인 독성작용 등에 의해 일어난다(Rossof 등, 1972; Rothmann과 Weick, 1981; Doll과 Weiss, 1983; Rothmann 등, 1985). Cisplatin유발 빈혈랫드에서 DWP4I3을 5일간 연속투여한 결과, 적혈구수, 헤마토크리트치 , 헤모글로빈농도, 세망적 혈구수가 DWP413 투여게시 후 3일째부터 증가하기 시작하여 7일째 최고치를 나타내다가 이후 감소하였다. 이 결과는Wood 등(1995)이 cisplatin을 투여한 랫드에 EPO를 주2 회 2주간 투여한 경우 cisplatin만을 투여한 랫드에 비등!1 빈혈증상이 개선되었다고 보고하였고, Nam 등(1998)이 cisplatin유발 빈혈랫드에서 EPO를 5일간 연속투여한 결과 200IU/kg 농도에서 적혈구수, 헤마토크리트치, 헤모글로빈 농도, 세망적혈구수가 투여개시후 4일째부터 증가하기 시작하여 6일, 8일, 10일째에 유의성 있는 증가를 나타내었고 8일째에 세망적혈구수가 최고치를 나타낸후 급격한 감소를 나타내었다고 보고한 것과 일치하다.
- 1-a, b, c). DWP413의 200 lU/kg 투여군에서는 세뇨관 및 집합콴의 경도의 확장과 세뇨관의 재생상이 관찰되었고, 신사구체와 보우만씨낭의 유착, 세뇨관 주위의 국소성 임파구 침윤은 cisplatin 단독투여군 에 비해 다소 완화됨이 관찰되었다(Photo, 1-d).
- 01) 증가가 관찰되었디-. RBC의 경우 실혈후 10일째에 450, 1350IU/kg 투여군에서 대조군에 비해 유의한 증가가 관찰되었다. 급 성실혈후 30%까지 헤마토크리트치가 내려간 후 1350 IU/kg EPO 5일 연속 투여군에서 초기 헤마토크리트치 회복은 5.
- 10일과 M일째에 세망적혈구수가 vehicle에 비하여 유의성있게 감소한 것은 생리적 항상성을 유지하기 위한 피드백 작용이라고 생각된다. 따라서 본 실험의 결과로 DWP413은 정상동물에서 뚜렷한 적혈구 생성 촉진 효과가 있음을 확인하였다.
- 01) 증가를 나타내 었고, 헤모글로빈에서는 200 IU/kg 투여군에서 유의적 인 증가를 보인 후 투여개시 7일째에 최고치를 나타낸 후 감소하는 경향을 보였다. 또한 세망적혈구에서는 모든 투여군에서 투여개시 후 3일째부터 유의성있는 (p<0.01) 증가를 보였고 7일째에 최고치를 나타낸 후. 10일째(cisplatin 투여 28일째)에 모든 군에서 vehicle에 비해 유의적인 감소경향이 나타났다.
- 시험 최종일에 부검하여 관찰한 신장의 병리조직학적 소견에서 cisplatin 에 의한 독성변회는 주로 피질부위에서 나타났으며, 신 사구체와 보우만씨 낭의 유착(adhesion), 원위곡세뇨관(distal convoluted tubule) 또는 집합관(collecting tubule) 의 낭성 확장과 세뇨관 증식성 변화(tubular hyperplasia)를 보였다. 또한 증식한 세뇨관 주위에 국소성 임파구 침윤이 관찰되었고, 세뇨관 변성(degeneration) 및 간질의 섬유화의 소견과 확장한 세뇨관의 상피세포와 근위 세뇨관의 일부에서 거핵세포가 관찰되었다. 수질부위에 서는 집합관의 확장과 함께 균질성의 초자적 (hyaline droplet)으로 생각되는 호산성 또는 염기성 물질이 관찰되었다(Photo.
- 본 실험에서 전체 혈액의 20%를 실혈시킨 랫드에 DVT413을 투여하였을 띠], 실혈 후 3일째부터 세망적혈 구는 증가하여 5일째에 유의성있는 증기-를 나타내었으며 그후 급격히 감소하였다. 이러한 결과는 Kim 등(1994)의 실험에서 20% 급성실혈동물에 EPO를 7일간 투여한 후 세망적혈구를 측정한 결과, 투여후 3~5일에는 증가를 보이다가 그후 급격히 감소하였다는 보고와 유사하다.
- 생물학적 활성 : DWP413의 생물학적 활성은 noimocy- themic mouse에서 bioassay를 통해서 구하였고, eiytbro-poietin BRP에 비하여 102.43%의 활성을 나타내었다 (Fig. 1).
- 체중 250 g 전후의 응성 Sprague Dawley 랫드와 7주 령의 웅성 B6D2F1 mouse는 일본 Chailes River사 (Atsugi, Japan)에서 구입하여 (주)대웅제약 실험동물 사육 실에서 1주간 순화시킨 후 건강한 동물만을 선별하여 실험에 사용하였다. 순화기간과 실험기간중의 동물 사육환경은 온도 22 ± 3℃, 상대 습도 55 ±15%, 조명 시 간 12시 간 (08:00 점등~20:00 소등), 조도 150~300Lux 및 환기횟수 15회/시간의 조건을 유지하였으며, 사료와 물은 자유섭취 시켰다
- 10일째(cisplatin 투여 28일째)에 모든 군에서 vehicle에 비해 유의적인 감소경향이 나타났다. 시험 최종일에 부검하여 관찰한 신장의 병리조직학적 소견에서 cisplatin 에 의한 독성변회는 주로 피질부위에서 나타났으며, 신 사구체와 보우만씨 낭의 유착(adhesion), 원위곡세뇨관(distal convoluted tubule) 또는 집합관(collecting tubule) 의 낭성 확장과 세뇨관 증식성 변화(tubular hyperplasia)를 보였다. 또한 증식한 세뇨관 주위에 국소성 임파구 침윤이 관찰되었고, 세뇨관 변성(degeneration) 및 간질의 섬유화의 소견과 확장한 세뇨관의 상피세포와 근위 세뇨관의 일부에서 거핵세포가 관찰되었다.
- 이 결과는Wood 등(1995)이 cisplatin을 투여한 랫드에 EPO를 주2 회 2주간 투여한 경우 cisplatin만을 투여한 랫드에 비등!1 빈혈증상이 개선되었다고 보고하였고, Nam 등(1998)이 cisplatin유발 빈혈랫드에서 EPO를 5일간 연속투여한 결과 200IU/kg 농도에서 적혈구수, 헤마토크리트치, 헤모글로빈 농도, 세망적혈구수가 투여개시후 4일째부터 증가하기 시작하여 6일, 8일, 10일째에 유의성 있는 증가를 나타내었고 8일째에 세망적혈구수가 최고치를 나타낸후 급격한 감소를 나타내었다고 보고한 것과 일치하다. 신장의 병리초직학적 소견에 서 cisplatin 단독투여 군에서는 신사구체와 보우만씨 낭의 유착, 원위곡세뇨관 또는 집합관의 낭성 확장과 세뇨관 증식성 변화를 보였고, 증식한 세뇨관 주위에 국소성 임파구 침윤, 세뇨관 변성, 간질의 섬유화 등이 관찰되었으나, DWP413 200 IU/kg 투여군에서는 이러한 병리조직 소견이 완화됨이 관찰되었다. Vaziri ND 등(1994)은 cisplatin에 의한 신부전 빈혈랫드에서 EPO투여후 세뇨관 재생과 신장 피질부의 DNA 합성 증가를 확인하였고, Nam 등(1998)은 cisplatin 단독 투여에서 나타나는 신사구체의 위죽과 mesangium의 증식, 요세관 확장에 의한 상피의 편평화, 요세관의 위축, 변성 및 간질의섬유화 등의 소견이 관찰되었으나 EPO 투여군에서는 요세관의 경도의 확장만이 관찰되었다고 보고하였으며, 이는 EPO 부여가 신징피질부의 세포성장을 촉진하는 것이라 하였고, 이는 본 실험의 결과와 유사하다.
- 족, 실혈 1일 후에 모든 투여군에서 적혈구수, 혜마토크리트치의 뚜렷한 감소가 관찰되었다. 실혈 후 5 일째에 헤마토크리트치와 세망적혈구는 450, 1350IU/kg 투여 군에서, 헤모글로빈은 1350 IU/kg투여 군에서 vehicle 에 비하-여 유의성있는(p<001) 증가가 꽌찰되었고, 실혈 후 10일째에 1350HJ/kg 투여군에서 적혈구수, 헤마토크 리트치, 헤모글로빈의 유의적인 이) 증가가 나타난 반면, 세망적혈구는 vehicle에 비해 유의적으로(p<0.01) 감소하였디-.
- Vaziri ND 등(1994)은 cisplatin에 의한 신부전 빈혈랫드에서 EPO투여후 세뇨관 재생과 신장 피질부의 DNA 합성 증가를 확인하였고, Nam 등(1998)은 cisplatin 단독 투여에서 나타나는 신사구체의 위죽과 mesangium의 증식, 요세관 확장에 의한 상피의 편평화, 요세관의 위축, 변성 및 간질의섬유화 등의 소견이 관찰되었으나 EPO 투여군에서는 요세관의 경도의 확장만이 관찰되었다고 보고하였으며, 이는 EPO 부여가 신징피질부의 세포성장을 촉진하는 것이라 하였고, 이는 본 실험의 결과와 유사하다. 이러한 결과들로 보아 cisplatin으로 인한 신장헤 빈혈을 DWP413의 투여로 회복시킬 수 있을 것으로 사료된다.
- 이는 EPO의 투여가 급 성실혈성 빈혈의 회복에 효과적으로 작용함을 의미한다. 이러한 결과로 보아 DWP413은 급성 출혈성 빈혈에도 효과적인 조혈작용을 가지는 것으로 생각된다.
- 이상의 결과로 보아 (주)데웅체약의 DWP413은 정상상태, cisplatin 등의 항암제에 의해 유발된 빈혈싱-태, 급성 실혈에 의한 빈혈상태에서 효과적인 조혈작용이 있는것으로 사료된다.
- 정상렛드에 DWP413을 투여하였을 때 용량의존적으로 적혈구수, 헤마토리트치, 헤모글로빈치가 10일째 가장 높은 값을 나타네다가 점차 감소하였고, 세망적혈구는 7 일째에 가장 높은 수치에 도달한 후 감소하였다. 이것은 생성된 세망적혈구가 성숙적혈구로 변화되는 기간이 1~2일 정도 소요되므로, 생성된 세망적혈구가 성숙하여 정상적혈구가 되면서 축적된 결과라고 생각된다(Landschulz 등, 1992).
- 2에 나타난 바와 같다. 즉, DWP413의 50, 250, 1250 lU/lcg 투여군에서 적혈구수, 헤모글로빈 농도가 10일째에, 헤마토크 리트치는 7일째에 최고치에 도달되어 vehicle에 비해 유의성 있는 증가가 관찰되었으며 (p<0.01), 그후 첨차 감소 하였다, 한편 세망적혈구에 있이서는 250, 1250IU/l<g 투여군에서 3일째부터 유의성있는 증가가 관찰되었고 7일 째에 모든 투여군에서 최고의 증가치가 나타났다. 그러나 10일째는 50, 250, l250IU/kg을 투여한 동물군 모두에서 vehicle에 비해 유의적으로(p<0.
- Cisplatin 투여후 18일째부터 DWP413을 1일 1회 5일동 안 정맥투여하였으며, 투여개시 3일째 (cisplatin 투여 21 일째)에 모든 투여군에서 RBC수의 증가가 나타나기 시작하여 DWP413 투여개시 7일째에 최고치를 나타낸 후 감소하는 경향을 보였다. 헤마토크리트치 에 서는DWP413 투여개 시 3일째에 100, 200 IU/kg 투여군에서 vehicle에 비헤 유의성있는(p<0.05, p<0.01) 증가를 나타내 었고, 헤모글로빈에서는 200 IU/kg 투여군에서 유의적 인 증가를 보인 후 투여개시 7일째에 최고치를 나타낸 후 감소하는 경향을 보였다. 또한 세망적혈구에서는 모든 투여군에서 투여개시 후 3일째부터 유의성있는 (p<0.
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