16S rDNA염기서열에 의한 불가사리(Asterias amurensis) 장내에서 분리된 종속영양세균 군집의 다양성 The Diversity of Heterotrophic Bacteria Isolated from Intestine of Starfish(Asterias amurensis) by Analysis of 16S rDNA Sequence원문보기
본 연구는 2000년 7월에 전남 장흥군에서 채집한 불가사리의 장내에 존재하는 종속영양세균의 다양성에 대해서 알아보았다. 불가사리 장내에 존재하는 균체수를 측정하였으며, 순수 분리된 균주를 대상으로 16S rDNA 증폭기법을 이용하여 세균의 다양성을 조사하였다. 불가사리 장내에 분포하는 종속영양세균의 균체수는 8.65${\pm}$0.65${\times}10^3\;dfu\;g^{-1}$이었다. 29 균주의 세균이 순수 분리되었으며, 그 중 그람양성 세균은 분리된 균주의 59% (17균주)를 차지하였다. 불가사리 장내에서 분리된 균주는 Bacillus속, Microbacterium 속, 그리고 Marinobacter 속 등이 우점이었으며, 이외에도 Staphylococcus 속, Psychrobacter 속, Paracoccus 속, Erythrobacter 속, Zoogloea 속, Kocuria 속과 Arthrobacter 속 등이 포함되었다. 분리된 균주 가운데 Bacillus 속에 속하는 8균주 중 3균주는 type strain과 97% 이상의 유사도를 보인 반면, 5 균주는 유사도가 90%로 비교적 낮은 유사도를 보여 현재까지 알려지지 않은 신종일 가능성이 높다고 하겠다.
본 연구는 2000년 7월에 전남 장흥군에서 채집한 불가사리의 장내에 존재하는 종속영양세균의 다양성에 대해서 알아보았다. 불가사리 장내에 존재하는 균체수를 측정하였으며, 순수 분리된 균주를 대상으로 16S rDNA 증폭기법을 이용하여 세균의 다양성을 조사하였다. 불가사리 장내에 분포하는 종속영양세균의 균체수는 8.65${\pm}$0.65${\times}10^3\;dfu\;g^{-1}$이었다. 29 균주의 세균이 순수 분리되었으며, 그 중 그람양성 세균은 분리된 균주의 59% (17균주)를 차지하였다. 불가사리 장내에서 분리된 균주는 Bacillus속, Microbacterium 속, 그리고 Marinobacter 속 등이 우점이었으며, 이외에도 Staphylococcus 속, Psychrobacter 속, Paracoccus 속, Erythrobacter 속, Zoogloea 속, Kocuria 속과 Arthrobacter 속 등이 포함되었다. 분리된 균주 가운데 Bacillus 속에 속하는 8균주 중 3균주는 type strain과 97% 이상의 유사도를 보인 반면, 5 균주는 유사도가 90%로 비교적 낮은 유사도를 보여 현재까지 알려지지 않은 신종일 가능성이 높다고 하겠다.
To study the diversity of heterotrophic bacteria isolated from intestine of starfish, Asterias amurensis, we collected starfishes from the coastal area near Jangheung-Gun, Jeollanam-Do, Korea during July, 2000. Population density and bacterial diversity in the intestine of starfish were measured. Th...
To study the diversity of heterotrophic bacteria isolated from intestine of starfish, Asterias amurensis, we collected starfishes from the coastal area near Jangheung-Gun, Jeollanam-Do, Korea during July, 2000. Population density and bacterial diversity in the intestine of starfish were measured. The results were as follows; The population densities of heterotrophic bacteria in the intestine of starfish were 8.65${\pm}$0.65${\times}10^3\;dfu\;g^{-1}$. Gram positive bacteria occupied 59% among 29 isolates. The community structure of dominant heterotrophic bacteria in the intestine of starfish consisted of Bacillaceae in the low G+C gram positive bacteria subphylum, Microbacteriaceae in the high G+C gram positive bacteria subphylum, and Alteromonadaceae in ${\gamma}$-Proteobacteria subphylum. Among eight strains of Bacillus spp., three strains showed more than 97% identity, but five strains showed about 90% identity with type strain on the basis of partial 16S rDNA sequence.
To study the diversity of heterotrophic bacteria isolated from intestine of starfish, Asterias amurensis, we collected starfishes from the coastal area near Jangheung-Gun, Jeollanam-Do, Korea during July, 2000. Population density and bacterial diversity in the intestine of starfish were measured. The results were as follows; The population densities of heterotrophic bacteria in the intestine of starfish were 8.65${\pm}$0.65${\times}10^3\;dfu\;g^{-1}$. Gram positive bacteria occupied 59% among 29 isolates. The community structure of dominant heterotrophic bacteria in the intestine of starfish consisted of Bacillaceae in the low G+C gram positive bacteria subphylum, Microbacteriaceae in the high G+C gram positive bacteria subphylum, and Alteromonadaceae in ${\gamma}$-Proteobacteria subphylum. Among eight strains of Bacillus spp., three strains showed more than 97% identity, but five strains showed about 90% identity with type strain on the basis of partial 16S rDNA sequence.
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문제 정의
본 연구에서는 불가사리를 대상으로 16S rDNA 염기서열을이용하여 불가사리 장내에 서식하는 종속영 양세균 군집의 다양성에 대하여 연구하였다. 이러한 연구는 최근 양식어장 피해의주범 중의 하나이며, 신물질의 탐색과 칼슘 비료제의 대상으로주목을 받고 있는 불가사리를 연구하는데 필요한 기초 자료로활용될 것으로 기대한다.
제안 방법
16S rDNA 유전자서열을 분석하기 위해 증폭된 PCR 산물을 agarose gel에서 분리 한 후, Gel extraction Kit (Spin Kit; Nucleo- gen, Korea)을 이용하여 정제하였다. 유전자 서열 분석은 BioDye Cycle sequencing kit (PE Applied Biosystems, Foster City, CA) 에 의하여 수행하였으며, 유전자 서열 분석을 위한 primer로는 8F를 사용하였다.
17 균주의 그람양성세균와』2 균주의 그람음성세균의 16S rDNA의 부분적인 염기서열에 대하여 PHYDIP (version 3.1)program을 이용하여 연관된 표준 균주와 비교하여 염기 서열의배열을 정리하였고, 배열된 자료로부터 NEIGHBOR program을이용하여 계통수(饵hylogenetic tree)를 나타내었다(Fig. 1과 Fig. 2).
5 kb의 PCR 산물을 얻었다. 30 개의 PCR 산물을 gel extraction kit 을 이용하여 정제한 후, autosequencer를 이용하여 16S rDNA의부분 염기 서열을 파악하였다.
불가사리 장내에 분포하는 종속영양세균 수의 측정을 위하여 불가사리의 내장을 1 g 채취하여 9 ml의 생리 식염수에 넣고 교반기(Modular MSI, IKA, Germany)를 이용하여 균질한 현탁액이 될 때까지 교반하였다. 현탁액은 멸균된 희석액에 1/10단위로 희석한 후 Bacto Marine Agar 2216(Difbo, USA) 평판 배지에 도말하여 25 ± 2℃에서 7일간 배양하여 형성된 균체수를 측정하였다(Lee 1996).
불가사리 장내에 존재하는 종속영양세균의 균체수를 측정하기 위한 평판배지에서 콜로니의 형상에 따라 29 균주를 선별하고, 평판 도말법을 이용하여 각각의 종속영양세균을 순수 분리하였다. 순수 분리된 종속영양세균으로부터 genomic DNA/를 추출하고, 추출된 genomic DNA를 template로 이용하였다.
불가사리의 장내에서 분리한 종속영 양세균의 16SrDNA의 부분 염기 서 열을 Blast network service를 이용하여 EMBL/ Gene- Bank database의 염기 서열을 비교하여 속명을 확정하고(Alts- chul et al. 1997), PHYDIT (version 3.1)을 이용하여 Ribosomal Database Project (RDP) U database의 표준 균주의 염기서 열과 비교함으로써 계통분류학적 유연 관계를 분석하였다(Maidak et al. 2000). 종속영양세균의 16S rDNA의 부분 염기 서열의 배열은우선 CLUSTAL W를 사용하여 결정하였으며, PHYDIT을 이용하여 RDP의 대표적인 세균의 염기 서열을 참조하여 재배열을수행하였다.
세균의 16S rDNA를 증폭하기 위하여 세균의 공통 primer인 8F (5'-AGAG-TTTGATCMTGGCTCAG-3')를 forward primer로 1492R (5‘ -GGTTACCITGTrACG-ACTT-3')을 reverse primer로사용하여 PCR을 수행하였다(Eden et al. 1991). PCR 조건은 10X PCR buffer (final concentrations: 50 mM KC1, 0.
순수 분리된 종속영양세균으로부터 genomic DNA/를 추출하고, 추출된 genomic DNA를 template로 이용하였다. 세균의공통 primer인 8F와 1492R을 사용하여 PCR 증폭을 수행 하여 1.5 kb의 PCR 산물을 얻었다. 30 개의 PCR 산물을 gel extraction kit 을 이용하여 정제한 후, autosequencer를 이용하여 16S rDNA의부분 염기 서열을 파악하였다.
순수 분리된 종속영양세균으로부터 genomic DNA/를 추출하고, 추출된 genomic DNA를 template로 이용하였다. 세균의공통 primer인 8F와 1492R을 사용하여 PCR 증폭을 수행 하여 1.
Korea)을 이용하여 정제하였다. 유전자 서열 분석은 BioDye Cycle sequencing kit (PE Applied Biosystems, Foster City, CA) 에 의하여 수행하였으며, 유전자 서열 분석을 위한 primer로는 8F를 사용하였다.
2000). 종속영양세균의 16S rDNA의 부분 염기 서열의 배열은우선 CLUSTAL W를 사용하여 결정하였으며, PHYDIT을 이용하여 RDP의 대표적인 세균의 염기 서열을 참조하여 재배열을수행하였다. 또한, 염기 서열의 키메라 여부는 CHIMERACHECK program을 이용하였다(Joung 2001).
종속영양세균이 배양된 용액 1 血을 12,000Xg에서 5분간 원심분리하여 세균을 농축하였다. 농축된 세균으로부터 genomic DNA 추출을 위하여 SDS, CTAB (cetyl-trimethyl ammonium bromide), phenol-chloroform, isopropanol 처리 과정을 거쳤다(Gerhardt 1994).
때까지 교반하였다. 현탁액은 멸균된 희석액에 1/10단위로 희석한 후 Bacto Marine Agar 2216(Difbo, USA) 평판 배지에 도말하여 25 ± 2℃에서 7일간 배양하여 형성된 균체수를 측정하였다(Lee 1996). 이때 불가사리 장내의 균체수는 cfWg 단위로 환산하였다.
이때 불가사리 장내의 균체수는 cfWg 단위로 환산하였다. 형태적으로 다른 콜로니 29개를 선별하여 Bacto Marine Agar 2216 평판 배지를 이용하여 3차에 걸쳐 순수분리를 하였다. 순수분리된 종속영양세균의 genomic DNA를 분리하기 위하여 Bacto Marine Broth 2216 (Difco USA) 배지가 든 시험관에서 2일간 배양하였다.
대상 데이터
본 실험에서 사용된 아무르 불가사리amwenxis)는 2000년 7월에 전라남도 장흥군 수문리 인근 연안에서 채집하였다. 채집한 불가사리는 4℃가 유지되는 냉장 장비를 이용하여 실험실로 운반하였다.
본 연구에서 분석된 29 종류의 16S rDNA 계통형에 대한 부분 염기서열을 GeneBank database에 제출하여 승인번호(AY437610 - AY437638)를 부여 받았다.
형태적으로 다른 콜로니 29개를 선별하여 Bacto Marine Agar 2216 평판 배지를 이용하여 3차에 걸쳐 순수분리를 하였다. 순수분리된 종속영양세균의 genomic DNA를 분리하기 위하여 Bacto Marine Broth 2216 (Difco USA) 배지가 든 시험관에서 2일간 배양하였다.
데이터처리
5)를 사용하여 작성하였다. 그리고, SEQBOOT program (PLYLIP, version 3.5)을 이용하여 1,000번의 bootstr叩ped replicate resampling data set를 분석하여 bootstrap value를 계산하였다(Felsenstein 1985).
이론/모형
또한, 염기 서열의 키메라 여부는 CHIMERACHECK program을 이용하였다(Joung 2001). 계통수(phylogenetic tree)는 neighbor-joining method (Saitou and Nei 1987)를 이용하는프로그램 인 NEIGHBOR (PLYLIP, version 3.5)를 사용하여 작성하였다. 그리고, SEQBOOT program (PLYLIP, version 3.
종속영양세균의 16S rDNA의 부분 염기 서열의 배열은우선 CLUSTAL W를 사용하여 결정하였으며, PHYDIT을 이용하여 RDP의 대표적인 세균의 염기 서열을 참조하여 재배열을수행하였다. 또한, 염기 서열의 키메라 여부는 CHIMERACHECK program을 이용하였다(Joung 2001). 계통수(phylogenetic tree)는 neighbor-joining method (Saitou and Nei 1987)를 이용하는프로그램 인 NEIGHBOR (PLYLIP, version 3.
성능/효과
나머지 3 균주(AI-9, 11, 22)는 Staphylococcus 속과유사성이 있었다. AL9와 AL11은 Staphylococcus aureus ATCC 12600 (T)와 유사성이 각각 99.6%와 97.8%로 상당히 높았으며, AI-22는 Staphylococcus warneri ATCC 27836 (T)와 99.4%의 유사성을 보였다. High G+C 그람양성세균으로 분리된 6 균주 중 Microbacterium sp.
불가사리 장내에서 분리된 균주는 Bacillus 속이 8 균주로 가장 많았으며, Marinobacter 속은 5 균주, 그리고 Microbacterium 속은 4 균주가 존재하였다. Staphylococcus 속은 3 균주였으며, Psychrobacter 속, Paracoccus 속과 Erythrobacter 속은 각각 2 균주씩 존재 하였고, Zoogloea 속, Kocuria 속, Arthrobacter 속은 각각 1 균주씩 존재하였다. 불가사리 장내에 존재하는 종속영양세균은 low G+C 그람 양성이 37.
보였다. a -Proteobacteria0!] 속하는 4균주(AI-14, 16, 21, 23) 중 AI-14와 AI-21은 각각 Paracoccus amiophilus JCM 7686 (T) (96.2%)와 Paracoccus kocurii JCM 7684 (T) (92.3%)와 높은유사성을 보였으며, AI-16과 AL23은 Erythrobacter litoralis DSM 8509 (1) (각각 96.4와 97.4%)와 유사성을 보였다. 나머지 7 균주는 7-Proteobacteria에 속하는 2개의 속으로 분류되었다.
그람음성세균 중 P -Proteobacteria는 1 균주(AL20)만이 존재하였으며, Zoogloea uncultured proteobacterium OCS7과 98, 4%의유사도를 보였다. a -Proteobacteria0!] 속하는 4균주(AI-14, 16, 21, 23) 중 AI-14와 AI-21은 각각 Paracoccus amiophilus JCM 7686 (T) (96.
5%)을 보였으나, 계통도에서는 5 균주 중 AI-10, 19, 25는 Marinobacteria 必位z頌와 연관성이 높은 결과를 보였다. 그리고나머지 2 균주(AI-1과 AI-2)는 Psychrobacter phenylpyruvicus ATCC 23333 (T)와 94.2%와 93.7%의 유사성을 각각 보였다. 그람양성세균의 경우 Bacillus 속의 5 균주를 제외하고는 비교적높은 유사도를 보인 반면, 그람음성세균의 경우에는 대부분 95%의 유사도를 보여 표준 균주와 상당히 차이를 보임을 알 수 있다.
1968) 보다 낮았다. 또한, 굴 외투막의 액에 분포하는 균체수 (3.5 X 104 ~ 2.6 X 105 bacteria m'1) (Lovelace 1968)와 성게 (Echinus 의 장에서 측정한 균체수(4.0 x 105 ~ 2.1 x 107 cell g'1) (Unkles 1977)보다 본 연구에서 측정한 불가사리의장내에 존재하는 종속영양세균의 균체수가 약간 낮게 측정되었다. 해 양 동물의 표피 와 장내에 존재하는 미생 물의 수는 측정 방법에 따라 많은 차이를 보이며, 현재까지 많은 논란이 되고 있다.
Staphylococcus 속은 3 균주였으며, Psychrobacter 속, Paracoccus 속과 Erythrobacter 속은 각각 2 균주씩 존재 하였고, Zoogloea 속, Kocuria 속, Arthrobacter 속은 각각 1 균주씩 존재하였다. 불가사리 장내에 존재하는 종속영양세균은 low G+C 그람 양성이 37.9% (11 균주)를, high G+C 그람 양성은 20.7% (6 균주)를 차지하여, 그람양성세균이 차지하는 비율은 분리된 균주의 58.6% 이 었다. 그람음성세균의 경우에는, 7 -Proteobacteria (7 균주), a -Proteobacteria (4 균주), #-Proteobacteria (1 균주) 순으로 존재 하였다(Table 2).
불가사리 장내에서 분리된 29 종류의 세균으로부터 얻은 염기 서열을 GeneBank database의 염기 서 열과 비교한 결과 10 개 그룹으로 분류되었다(Table 1). 불가사리 장내에서 분리된 균주는 Bacillus 속이 8 균주로 가장 많았으며, Marinobacter 속은 5 균주, 그리고 Microbacterium 속은 4 균주가 존재하였다.
분류되었다(Table 1). 불가사리 장내에서 분리된 균주는 Bacillus 속이 8 균주로 가장 많았으며, Marinobacter 속은 5 균주, 그리고 Microbacterium 속은 4 균주가 존재하였다. Staphylococcus 속은 3 균주였으며, Psychrobacter 속, Paracoccus 속과 Erythrobacter 속은 각각 2 균주씩 존재 하였고, Zoogloea 속, Kocuria 속, Arthrobacter 속은 각각 1 균주씩 존재하였다.
그람음성세균의 경우에는, 7 -Proteobacteria (7 균주), a -Proteobacteria (4 균주), #-Proteobacteria (1 균주) 순으로 존재 하였다(Table 2). 산(acid)의 농도가 높은 환경에서 잘 생장하는 Bacillus, Staphylococcus와 같은 low G+C 그람양성세균이 불가사리 장내에서 분리된 균주의 우점을 차지하였고, 또한 산의 독성에 민감한 군집으로 알려진 high G+C 그람양성세균도 분리된 균주의 상당수를 차지하였다. 이와 같은 결과는 불가사리 장내 환경이 상당히 다양함을 시사한다.
나머지 7 균주는 7-Proteobacteria에 속하는 2개의 속으로 분류되었다. Mannobacteria 속에 속하는 5 균주(AI-10, 12, 18, 19, 25)는 Marinobacteria hydrocarb아?시asticus와 가장 높은 유사성(94, 0~ 99.5%)을 보였으나, 계통도에서는 5 균주 중 AI-10, 19, 25는 Marinobacteria 必位z頌와 연관성이 높은 결과를 보였다. 그리고나머지 2 균주(AI-1과 AI-2)는 Psychrobacter phenylpyruvicus ATCC 23333 (T)와 94.
High G+C 그람양성세균으로 분리된 6 균주 중 Microbacterium sp.에 속하는 4 균주(AI-25, 26, 28, 29)는 Microbacterium hominis IFO 15708 (T)와 97.2~99.0%의 유사성을보였으며, AL8은 Arthrobacter ramosus DSM 20546(T)와 99.1%의높은 유사성을 보였다. 그러나, AI-13은 Kocuria rosea DSM 20447(T)와는 95.
전라남도 장흥군 수문리 연안에서 채집한 불가사리의 장내에분포하는 종속영양세균을 평판배지법으로 측정한 균체수는 8.65 ± 0.65 X 103 cfii g‘이었다. 이러한 측정값은 혀가자미 (Dover sole) 미성어의 내장에서 측정한 값(5.
후속연구
대하여 연구하였다. 이러한 연구는 최근 양식어장 피해의주범 중의 하나이며, 신물질의 탐색과 칼슘 비료제의 대상으로주목을 받고 있는 불가사리를 연구하는데 필요한 기초 자료로활용될 것으로 기대한다.
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