주성분분석은 잘 알려진 데이터 분석 방법으로써 높은 차원의 데이터를 낮은 차원의 데이터로 표현하는데 효과적이어서 얼굴인식, 데이터 압축 등에 이용되고 있다. 주성분분석을 하게 되면 원 데이터의 공분산 행렬로부터 정규직교한 고유벡터와 해당하는 고유치를 얻게 되고 그 중 큰 값을 가지는 고유벡터 들을 선택하여 선형 변환함으로써 데이터의 차원을 줄일 수 있게 된다. 망막에 빛 자극이 인가되면 시세포 층에서 전기신호로 변환된 후 복잡한 신경회로를 거쳐 최종적으로 신경절세포 층에서 활동전위의 형태로 출력되게 된다. 본 연구에서는 다채널전극을 사용하여 여러 개 망막 신경절세포로부터 유래되는 활동전위를 기록한 후 개개의 신호를 구분하는 과정을 거치고, 이어서 그 신호를 만들어 내는 각 뉴론들끼리의 시간적, 공간적 흥분발사 패턴을 이해함으로써 궁극적으로 시각정보 인코딩 기전을 밝히려는 연구 목표하에 그 첫 단계로서 망막 신경절세포의 활동전위를 기록한 후 분류하는 과정을 성공적으로 수행하였기에 그 내용을 서술하고자 한다. 망막에서 기록되는 신경절세포 활동전위는 불규칙하고 확률적이기 때문에 주성분분석을 통하여 그 유형을 분류할 수 있었다. 토끼 눈으로부터 망막을 박리하여 망막조각을 얻은 후 신경절세포 층이 전극표면을 향하도록 전극에 부착하였다. 8${\times}$8의 microelectrode array (MEA)를 전극으로 사용하였고, 증폭기는 MEA 60 system을 사용하여 신경절세포 활동전위를 기록하였다. 활동전위 기록 후 파형 분류를 하였다. 잡음이 섞여있는 기록으로부터 신호를 검출하기 위하여, 잡음역치($\pm$3$\sigma$)를 설정하였다. 역치를 넘는 파형 만을 획득한 후 주성분분석을 통해 각 파형의 첫 번째 주성분, 두 번째 주성분을 계산하여 2차원 평면에 투사함으로써 몇 개의 의미있는 클러스터를 얻었다. 이 클러스터는 곧 각 신경절세포에서 유래되는 파형을 반영하므로 주성분분석을 통하여 망막 신경절세포의 활동전위를 각 세포별로 분류할 수 있음을 확인하였다.
주성분분석은 잘 알려진 데이터 분석 방법으로써 높은 차원의 데이터를 낮은 차원의 데이터로 표현하는데 효과적이어서 얼굴인식, 데이터 압축 등에 이용되고 있다. 주성분분석을 하게 되면 원 데이터의 공분산 행렬로부터 정규직교한 고유벡터와 해당하는 고유치를 얻게 되고 그 중 큰 값을 가지는 고유벡터 들을 선택하여 선형 변환함으로써 데이터의 차원을 줄일 수 있게 된다. 망막에 빛 자극이 인가되면 시세포 층에서 전기신호로 변환된 후 복잡한 신경회로를 거쳐 최종적으로 신경절세포 층에서 활동전위의 형태로 출력되게 된다. 본 연구에서는 다채널전극을 사용하여 여러 개 망막 신경절세포로부터 유래되는 활동전위를 기록한 후 개개의 신호를 구분하는 과정을 거치고, 이어서 그 신호를 만들어 내는 각 뉴론들끼리의 시간적, 공간적 흥분발사 패턴을 이해함으로써 궁극적으로 시각정보 인코딩 기전을 밝히려는 연구 목표하에 그 첫 단계로서 망막 신경절세포의 활동전위를 기록한 후 분류하는 과정을 성공적으로 수행하였기에 그 내용을 서술하고자 한다. 망막에서 기록되는 신경절세포 활동전위는 불규칙하고 확률적이기 때문에 주성분분석을 통하여 그 유형을 분류할 수 있었다. 토끼 눈으로부터 망막을 박리하여 망막조각을 얻은 후 신경절세포 층이 전극표면을 향하도록 전극에 부착하였다. 8${\times}$8의 microelectrode array (MEA)를 전극으로 사용하였고, 증폭기는 MEA 60 system을 사용하여 신경절세포 활동전위를 기록하였다. 활동전위 기록 후 파형 분류를 하였다. 잡음이 섞여있는 기록으로부터 신호를 검출하기 위하여, 잡음역치($\pm$3$\sigma$)를 설정하였다. 역치를 넘는 파형 만을 획득한 후 주성분분석을 통해 각 파형의 첫 번째 주성분, 두 번째 주성분을 계산하여 2차원 평면에 투사함으로써 몇 개의 의미있는 클러스터를 얻었다. 이 클러스터는 곧 각 신경절세포에서 유래되는 파형을 반영하므로 주성분분석을 통하여 망막 신경절세포의 활동전위를 각 세포별로 분류할 수 있음을 확인하였다.
The Principal component analysis (PCA) is a well-known data analysis method that is useful in linear feature extraction and data compression. The PCA is a linear transformation that applies an orthogonal rotation to the original data, so as to maximize the retained variance. PCA is a classical techn...
The Principal component analysis (PCA) is a well-known data analysis method that is useful in linear feature extraction and data compression. The PCA is a linear transformation that applies an orthogonal rotation to the original data, so as to maximize the retained variance. PCA is a classical technique for obtaining an optimal overall mapping of linearly dependent patterns of correlation between variables (e.g. neurons). PCA provides, in the mean-squared error sense, an optimal linear mapping of the signals which are spread across a group of variables. These signals are concentrated into the first few components, while the noise, i.e. variance which is uncorrelated across variables, is sequestered in the remaining components. PCA has been used extensively to resolve temporal patterns in neurophysiological recordings. Because the retinal signal is stochastic process, PCA can be used to identify the retinal spikes. With excised rabbit eye, retina was isolated. A piece of retina was attached with the ganglion cell side to the surface of the microelectrode array (MEA). The MEA consisted of glass plate with 60 substrate integrated and insulated golden connection lanes terminating in an 8${\times}$8 array (spacing 200 $\mu$m, electrode diameter 30 $\mu$m) in the center of the plate. The MEA 60 system was used for the recording of retinal ganglion cell activity. The action potentials of each channel were sorted by offline analysis tool. Spikes were detected with a threshold criterion and sorted according to their principal component composition. The first (PC1) and second principal component values (PC2) were calculated using all the waveforms of the each channel and all n time points in the waveform, where several clusters could be separated clearly in two dimension. We verified that PCA-based waveform detection was effective as an initial approach for spike sorting method.
The Principal component analysis (PCA) is a well-known data analysis method that is useful in linear feature extraction and data compression. The PCA is a linear transformation that applies an orthogonal rotation to the original data, so as to maximize the retained variance. PCA is a classical technique for obtaining an optimal overall mapping of linearly dependent patterns of correlation between variables (e.g. neurons). PCA provides, in the mean-squared error sense, an optimal linear mapping of the signals which are spread across a group of variables. These signals are concentrated into the first few components, while the noise, i.e. variance which is uncorrelated across variables, is sequestered in the remaining components. PCA has been used extensively to resolve temporal patterns in neurophysiological recordings. Because the retinal signal is stochastic process, PCA can be used to identify the retinal spikes. With excised rabbit eye, retina was isolated. A piece of retina was attached with the ganglion cell side to the surface of the microelectrode array (MEA). The MEA consisted of glass plate with 60 substrate integrated and insulated golden connection lanes terminating in an 8${\times}$8 array (spacing 200 $\mu$m, electrode diameter 30 $\mu$m) in the center of the plate. The MEA 60 system was used for the recording of retinal ganglion cell activity. The action potentials of each channel were sorted by offline analysis tool. Spikes were detected with a threshold criterion and sorted according to their principal component composition. The first (PC1) and second principal component values (PC2) were calculated using all the waveforms of the each channel and all n time points in the waveform, where several clusters could be separated clearly in two dimension. We verified that PCA-based waveform detection was effective as an initial approach for spike sorting method.
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문제 정의
그러나 국소적인 부위에 빛 자극이 가해지더라도 이를 처리하기 위하여는 수많은 뉴론들이 관여하여야 하므로 시각 정보를 처리하는 과정에 있어서 신경절세포 집단이 인코딩하는 방법은 기존의 단일 신경절 세포에서 얻은 정보로부터 유추한 처리 방법과는 분명 차이점을 보일 것이다. 그리고 기존의 세포 외 기록법에서 전제로 한 "망막 신경절 세포는 서로 독립적이다 가정 자체가 의문시되므로 본 연구에서는 최근에 개발된 멀티채널 기록법을 사용하여 망막 신경절 세포 집단의 활동 전위를 기록, 분석함으로써 개개의 뉴론이 아닌 망막신경망 전체에서의 신호처리를 연구하고자 하는 장기적인 연구 목표 하에 그 첫 단계로서 망막 신경절 세포 활동전위를 기록한 후, 오프라인에서 주성분 분석을 통하여 신호의 통계적 특성을 반영하는 클러스터를 그려내고, 그 클러스터가 반영하는 파형을 분류할 수 있음을 보였다. 본 연구진이 토끼 망막 신경절 세포의 직경을 조직학적으로 확인한 결과 10 /㎛ (미발표 데이터)이었으므로, 본 실험에서 직경 30 ㎛ 전극간 거리 200 ㎛ 인 다채널 전극을 사용하였다는 점을 감안할 때 다채널 전극의 각각의 채널에 기록된 신호는 의심의 여지없이 서로 다른 신경절 세포에서 유래된 활동전위임이 확실하다.
본 논문에서는 이러한 연구 과정의 제 첫 단계인 망막 신경절 세포의 활동 전위를 다채널 전극으로 기록한 후각 채널별로 활동 전위를 분류하는 과정을 직접 실험을 통하여 성공적으로 수행하였기에 그 내용을 서술하고자 한다. 뉴론의 활동전위를 구분하는 접근법은 크게 1) 파형으로부터 각종 파라미터를 도출하는 방법, 2) 주형과 비교하는 방법 (template matching) 3) 주성분 분석을 이용하는 방법으로 나눌 수 있다.
가설 설정
- Retinal piece attached on MEA - Real time recording window of retinal ganglion cell activity : 60 channels are shown. (b) Schematic cross-section of MEA, not to scale.
Duration of window was set with 1600 psec. (c) Waveform window shows the superimposed waveforms aligned at the threshold crossing times.
제안 방법
반면 독립성분분석 (Indeperient component analysis; ICA)은 공분산(covariance)의 비선형적이고 독립적인 패턴을 알아보는 데 적합한 방법이다27). 그러므로 각각의 활동 전위를 만들어내는 각 뉴론들끼리의 시간적, 공간적 흥분발사 패턴을 이해함으로써 궁극적으로 시각 정보 인코딩 기전을 밝히고자 하는 본 연구 목적에서는 주성분 분석이 독립성분 분석보다 적절한 분석 방법이므로 본 연구에서는 주성분분석을 사용하였다.
본 연구진이 토끼 망막 신경절 세포의 직경을 조직학적으로 확인한 결과 10 /㎛ (미발표 데이터)이었으므로, 본 실험에서 직경 30 ㎛ 전극간 거리 200 ㎛ 인 다채널 전극을 사용하였다는 점을 감안할 때 다채널 전극의 각각의 채널에 기록된 신호는 의심의 여지없이 서로 다른 신경절 세포에서 유래된 활동전위임이 확실하다. 그러므로 본 실험에서는 망막 신경절 세포 활동 전위 파형 분류를 통하여 각각의 신경절 세포를 찾아내는 방법을 국내에서는 최초로 확립하였을 뿐만 아니라 아직 미개척 분야인 망막신경망을 연구하는 전기생리학적 연구기법을 확립하였다.
망막 분리 방법은 Stett 등19)과 Grumet 등20)의 방법을 변형 하여 사용하였다. 체중 2 kg 정도의 토끼에 럼푼 (Xyla- zine hydrochloride, 한국바이엘)과 케타라(염산케타민, 유한양행)를 1:4로 혼합한 용액을 정맥주사(~1 ml/kg)하여 마취시킨 후 양쪽 안구를 적출한다.
망막신경절 세포활동전위를 기록한 후 오프라인에서 파형을 구분하였다. 측정된 원데이터에서 신호가 없는 부분(잡음 부분)의 표준편차(σ)를 구한 후 ±3σ 의 값을 잡음의 역치로 설정하였다.
첫 번째와 두 번째 주성분 만을 이용하더라도 전체 활동 전위 신호에너지의 80- 90%를 반영하므로 다채널 전극을 이용하여 방대한 양의 원데이터를 얻었을 때 가장 널리 사용되는 방법이다18). 망막의 출력신호인 신경절 세포의 활동 전위는 불규칙적이고 확률적 이기 때문에 본 논문에서는 주성분 분석을 통하여 각 신경절 세포에 해당하는 통계적인 클러스터를 2차원적으로 그려낸 후 이로부터 활동 전위를 분류하였다.
공막으로부터 망막을 분리하기 위하여 망막과 공막 사이에 주사기로 인공 뇌척수액을 주입하여 틈을 벌린 후 최종적으로 시신경이 부착되어 있는 중심부 공막을 가위로 자른다. 얇은 투명종이 형태의 망막(두께: ~200 ㎛) 을 얻어낸 다음, 전극에 붙이기 적합한 크기(<1 cm×l cm)로 자른 후, 신경 절세 포부 위가 전극 쪽을 향하도록 뒤집어 붙이고 망막의 활동전위를 기록하였다. 온도조절기를 통하여 망막의 온도를 32℃로 일정하게 유지하면서 활동 전위를 기록하였다.
얇은 투명종이 형태의 망막(두께: ~200 ㎛) 을 얻어낸 다음, 전극에 붙이기 적합한 크기(<1 cm×l cm)로 자른 후, 신경 절세 포부 위가 전극 쪽을 향하도록 뒤집어 붙이고 망막의 활동전위를 기록하였다. 온도조절기를 통하여 망막의 온도를 32℃로 일정하게 유지하면서 활동 전위를 기록하였다.
체중 2 kg 정도의 토끼에 럼푼 (Xyla- zine hydrochloride, 한국바이엘)과 케타라(염산케타민, 유한양행)를 1:4로 혼합한 용액을 정맥주사(~1 ml/kg)하여 마취시킨 후 양쪽 안구를 적출한다. 적출한 안구에 이후 인공 뇌척수액(artificial cerebrospinal fluid; ACSF solution) (단위 : mM, 124 NaCl, 10 glucose, 1.15 KH2PO4, 25 NaHCO3, 1.15 MgSO4, 2.5 CaCI2, 5 KCl; pH =7.4)을 주입하면서 망막 분리를 위한 수술을 실시한다. 먼저 망막의 전면에 있는 구조물(각막, 수정체, 초자체)을 모두 제거한다.
하여 사용하였다. 체중 2 kg 정도의 토끼에 럼푼 (Xyla- zine hydrochloride, 한국바이엘)과 케타라(염산케타민, 유한양행)를 1:4로 혼합한 용액을 정맥주사(~1 ml/kg)하여 마취시킨 후 양쪽 안구를 적출한다. 적출한 안구에 이후 인공 뇌척수액(artificial cerebrospinal fluid; ACSF solution) (단위 : mM, 124 NaCl, 10 glucose, 1.
데이터처리
이 시스템이 제공하는 최대 표본화 속도는 50 kHz/channel 이며 본 실험에서는 25 kHz/channel 을 사용하였다. 데이터 분석은 Offline sorter (Plexon Inc, USA)를 사용하여 주성분 분석을 하였다.
구분하였다. 측정된 원데이터에서 신호가 없는 부분(잡음 부분)의 표준편차(σ)를 구한 후 ±3σ 의 값을 잡음의 역치로 설정하였다. 역치 이상의 신호를 대상으로 하여 파형 윈도우에 중 첩해서 나타내었다.
이론/모형
망막의 활동 전위를 기록하기 위한 전극으로써 MEA 를사용하였다. MEA 는 5 cm× 5 cm 의 glass plate 의 중심부에 8×8 배열로 구성되어 있는 전극이다(conducting layer: TiN, insulating cover : Si23N4).
신호기록을 위한 시스템으로는 MEA60 system (Multichannel systems GmbH, Germany)을 사용하였다. MEA60 system 은 크게 1.
성능/효과
2에서 찾은 파형의 숫자가 모두 1945개였으며 원데이터는 1945×40 차원이 되었고 공분산 행렬로부터 고유벡터와 고유치를 구했다. 그 중 가장 큰 2개의 고유치에 해당하는 고유벡터값으로부터 첫 번째 주 성분과 두 번째 주성분을 계산한 후, 그 값을 각각 X축, Y축에 투영하여 몇 개의 클러스터를 이루는 패턴을 관찰할 수 있었다. Fig.
그리고 기존의 세포 외 기록법에서 전제로 한 "망막 신경절 세포는 서로 독립적이다 가정 자체가 의문시되므로 본 연구에서는 최근에 개발된 멀티채널 기록법을 사용하여 망막 신경절 세포 집단의 활동 전위를 기록, 분석함으로써 개개의 뉴론이 아닌 망막신경망 전체에서의 신호처리를 연구하고자 하는 장기적인 연구 목표 하에 그 첫 단계로서 망막 신경절 세포 활동전위를 기록한 후, 오프라인에서 주성분 분석을 통하여 신호의 통계적 특성을 반영하는 클러스터를 그려내고, 그 클러스터가 반영하는 파형을 분류할 수 있음을 보였다. 본 연구진이 토끼 망막 신경절 세포의 직경을 조직학적으로 확인한 결과 10 /㎛ (미발표 데이터)이었으므로, 본 실험에서 직경 30 ㎛ 전극간 거리 200 ㎛ 인 다채널 전극을 사용하였다는 점을 감안할 때 다채널 전극의 각각의 채널에 기록된 신호는 의심의 여지없이 서로 다른 신경절 세포에서 유래된 활동전위임이 확실하다. 그러므로 본 실험에서는 망막 신경절 세포 활동 전위 파형 분류를 통하여 각각의 신경절 세포를 찾아내는 방법을 국내에서는 최초로 확립하였을 뿐만 아니라 아직 미개척 분야인 망막신경망을 연구하는 전기생리학적 연구기법을 확립하였다.
후속연구
즉 다채널 전극을 사용하여 여러 개 망막 신경절 세포로부터 유래되는 활동 전위를 기록한 후 개개의 신호를 구분하는 과정을 거치고, 이어서 그 신호를 만들어내는 각 뉴론들끼리의 시간적, 공간적 흥분발사 패턴을 이해함으로써 궁극적으로 시각정보인 코딩 기전을 밝히는 것이 가능할 것이다10).
현재 본 연구진은 다양한 빛 자극에 따른 망막 신경망의 반응패턴을 이해하고 분류하는 연구를 진행하고 있으며 이는 곧 현재 국내에서 초미세 생체전자시스템 연구센터 주관으로 진행되고 있는 한국형 인공시각장치(visual prosthesis) 의 개발에 큰 도움을 줄 것으로 사료된다. 왜냐하면 시력을 상실한 환자에서 시각 경로상의 여러 단계에서 신경을 자극함으로써 시력을 회복시키려는 인공시각장치가 개발되기 위하여는
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