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문제 정의
- 그러나, 우리나라의 지황에 발생하는 바이러스의 분리 및 동정이 정확하게 보고되어 있지 않아 본 실험에서는 지황의 지역별 바이러스 조사와 접종 실험을 통한 기주반응, 혈청학적 진단, 전자현미경을 이용한 입자관찰 등을 통해 정확한 동정과 RT-PCR을 이용하여 TMV 지황 계통의 신속한 진단과 외피 단백질의 염기서열을 분석하여 gene bank(NCBI)에 등록된 다른 TMV계통과 비교 및 분석하여 지황 바이러스의 동정 및 유연 관계를 조사하고자 실시하였다.
제안 방법
- Cloning은 RT-PCR 결과 얻어 진 생 산물을 QIAquick PCR purification kit(QIAGEN Co.)를 이 용하여 정제하고 에탄올 침전법에 따라 침전시켜 사용하였다. Ligation반응은 합성물(90 ng)과 pT7 Blue(Novagen Co.
- )를 이 용하여 정제하고 에탄올 침전법에 따라 침전시켜 사용하였다. Ligation반응은 합성물(90 ng)과 pT7 Blue(Novagen Co. 50 ng)벡터를 이용하였고, Escherichia coli JM109 competent cell에 형질전환 시켰으며, Sequencing은 ABI PRISM dye primer cycle sequencing core kit(Perkin elmer Co.), MKZR reverse 및 MK1F forward primer를 이용하여 반응시키고, ABI PRISM 377 DNA sequencing system을 이용하여 sequencing 하였다.
- PCR 반응조건은 94 ℃ /1 min, 55 ℃/2 min 및 72 ℃/ 3 min에서 30 cycle의 조건으로 수행하였고 72℃/7 min간 신장반응을 시켰다. PCR 증폭산물은 1.2% agarose gel에 전기 영동하고 ethium bromide(l mg/µl)에 염색 후 전기영동대를 확인하였다.
- TMV에 단독 감염된 지황잎(서천배양)을 재료로 핵산추출 시약인 Sepa Gene Kit(三光)를 이용하여 total RNA를 분리하였다. 이 병 잎 3 mg과 tris-buffer(sol.
- 또 Ch. amaranticolor 및 N. glutinosa에 즙액접종한 후, 단일 반점을 얻어 계대증식하여 접종원 바이러스로 이용하였으며, 즙액접종은 병징이 뚜렷한 이병엽 2~3엽에 약 5배량(w/v)의 0.1 M 인산완충액(pH 7.0) 및 금강사(600 mesh)를 멸균된 유발에 넣고 마쇄하여 1.5~2 엽기의 지황 수집종의 유묘잎에 상이접종 시켰다. 접종 30 분 후 증류수로 접종 잎을 수세하고 반차광막이 설치된 유리 온실에서 생육시켰다.
- 상등액에 glycogen 1 µl 및 iso-propanol 250 µl를 혼합하고 -70℃에 10분간 방치 후 원심 분리시켜 핵산을 침전시켰다. 그리고 70% 에탄올로 수세한 후 진공건조기(Vision, Cetra-Vac)를 이용하여 5분간 건조시켜 멸균증류수에 재희석하여 RT-PCR시료로 사용하였다.
- 이 병조직의 관찰은 발병된 잎을 면도날로 1 mm2 크기로 절단하고 3% 글루타알데하이드 0.1 M 인산 완충액(PBS, pH 7.0)으로 2시간 전 고정 후, 0.1 M 인산 완충액(pH 7.0)으로 충분히 수세하고, 1% OsO4(0.1 M PBS, pH 7.0)에서 2시간 후 고정 하였다. 고정한 시료는 에칠 알콜로 탈수시켜, 100% propylene oxide로 치환하여 epoxy 수지(Epon 812)에 포매하였다.
- 절편 제작은 초박절편기(Ultramicrotome, LKB type V)로 초박절편을 만들고, 4% 우라닐아세테이트 (50% 에탄올 포화) 및 2% lead citrate로 염색 하였다. 검경은 전자현미경(Carl Zeiss EM 10C)을 이용하여 관찰하였다.
- 접종원 바이러스는 전북 진안약초 시험장의 '서천배양' 수집종에서 병징이 뚜렷한 이병엽 2~3엽을채 취 하여 ELISA법으로 TMV, PVX와 broad bean wilt virus(BBWV), cucumber mosaic virus(CMV)바이러스의 감염 여부를 확인하였다. 또 Ch.
- 기주반응의 조사는 명아주 2종, 담배 3종, 오이, 호박, 무, 순무, 콩(대두) 등을 접종 실험에 이용하였다. 즙액접종 후 1~2주 사이에 병징을 육안으로 조사하였으며, 병징이 뚜렷하지 않은 것은 ELISA로 검정하였다.
- 지황에서 sequencing한 data와 다른 TMV계통과 유연관계를 비교해 보기 위해서 한국에서 분리한 Tomato 및 Pepper 계통(Accession No. L35073, L35074), 중국에서 분리 한 Fujian 및 Vicia faba 계통 (Accession No. AF395127, AJ011933), TMV-152 계통 (Acecssion No. AF395129), TMV RNA중 Coat protein 부분(Acecssion No. X68110, NC001367), TMV rakkyo계통(Accession No. D63809)을 이용하였다. 유연관계 분석은 Genetyx-Win 프로그램을 이용하여 분석하였다.
대상 데이터
- RT-PCR 재료는 전라북도 진안에서 채취한 TMV의 감염주를 순수분리 하여 N. glutinosa에 계대접종 중인 재료를 채취 하여 total RNA를 분리하여 TMV의 RNA를 RT-PCR을 실시한 결과 Fig. 6에서 보는 바와 같다. 즉 531 bp에서 band가 형성되어 증폭되는 것을 알 수 있다.
- RT-PCR재료는 전라북도 진안약초시 험장에서 TMV에 이병된 개체를 N glutinosa에 계대 접종시킨 이병엽에서 total RNA를 분리하여 사용하였다.
- quinoa, Nicotiana glutinosa를 이용하였다.
- 접종 30 분 후 증류수로 접종 잎을 수세하고 반차광막이 설치된 유리 온실에서 생육시켰다. 기주반응의 조사는 명아주 2종, 담배 3종, 오이, 호박, 무, 순무, 콩(대두) 등을 접종 실험에 이용하였다. 즙액접종 후 1~2주 사이에 병징을 육안으로 조사하였으며, 병징이 뚜렷하지 않은 것은 ELISA로 검정하였다.
- 우리나라 지황 포장에 발생하고 있는 지황 바이러스의 분포를 알기 위해, 전라북도의 진안 약초시험장, 정읍, 장수 등 3개 지역에 지황 바이러스병 이병주를 채취하여 (Fig. 1) ELISA 검정을 한 결과 Table 1과 같다.
데이터처리
- D63809)을 이용하였다. 유연관계 분석은 Genetyx-Win 프로그램을 이용하여 분석하였다.
이론/모형
- 하였다. 검경은 전자현미경(Carl Zeiss EM 10C)을 이용하여 관찰하였다.
성능/효과
- Genetyx win program을 통하여 바이러스의 외피 단백질을 비교 분석한 결과 염기 수준에서는 TMV- T, V, To 세 계통에서 각각 94.83%로 가장 높게 나타났고, TMV-P 계통에서 67.35%로 가장 낮게 나타났다.
- N. glutinosa를 이용, 순수분리 및 증식한 이병주의 바이러스 입자를 관찰한 결과, 폭 18 nm, 길이 300 nm의 막대 모양의 바이러스가 관찰되었다.
- N. glutinosa를 이용, 순수분리 및 증식한 이병주의 바이러스 입자를 관찰한 결과, 폭 18 nm, 길이 300 nm의 막대모양의 바이러스였다. 이러한 결과는 최 등(1995), 박(1998)이 보고한 TMV 크기의 결과와 일치하였다.
- RT-PCR을 이용하여 TMV의 감염 여부를 조사하기 위해 이병주로부터 total RNA를 분리하여 RT- PCR을 수행한 결과 531 bp 부위에 증폭산물을 얻었다. 이러한 결과는 최 등(1998)의 결과와 일치하였다
- TMV의 병징은 즙액접종 4주 후부터 담배 잎의 본엽에 부분적으로 반점이 보이다가 4~6주 후에는 황화현상과 괴사현상이 나타났다. 이병주로부터 total RNA를 분리하여 RT - PCR을 수행한 결과 531 bp DNA 증폭 산물을 얻었으며 genetyx win program을 이용하여 외피단백질의 염기수준에서 비교 분석한 결과, TMV-T, V, To 세 계통에서 각각 94.
- 담배 모자이크 바이러스(TMV) 및 동부 위조 바이러스(BBWV)는 3개 지역 모두에서 ELISA 양성 반응을 나타내 었으나, CMV 및 PVX는 장수지역에서 만양성 반응을 나타내었다(Table 1).
- 또한 TMV common 계통과 TMV-P, T에 대한 외피단백질의 아미노산을 분석한 결과, 81%와 86%로 나타난 반면 서천배양에서 분리한 TMV-RE계통과 TMV-P, T 계통을 비교하였을 때 는 72%와 97%로 나타 났다.
- 63% 유사도를 나타냈다(Table 3). 염기 수준에서는 TMV- Tomato, Vicia faba, To 세 계통에서 각각 94.83%로 가장 높게 나타났고, TMV- Pepper계통에서 67.35%로 가장 낮게 나타났다(Table 3).
- 우리나라 지황재배지에 발생하고 있는 바이러스이 병주를 3개 지역에서 채취하여, ELISA 방법으로 TMV의 감염여부를 확인한 결과 진안, 장수, 정읍 등의 3개 지역 모두에서 ELISA 양성반응을 나타내었다. 뿐만 아니라 TMV외에 BBWV, CMV, PVX 등의 바이러스도 재배 포장에 발생하였다.
- 5와 같다. 이병 조직의 세포질에서 바이러스 입자가 군집을 이루고 있는 것이 관찰되었고, 세포질 내에 바이러스 입자가 산재해 있는 것이 관찰되었다.
- 이병된 서천배양 수집 종을 담배에 접종하여 뚜렷한 괴사증상이 나타난 이병 잎을 면도날로 잘라 엽 면에서 나오는 즙액을 그리드에 올려 전자염색한 후 투과 전자현미경으로 관찰한 결과 TMV의 입자는 막대 모양이었다(Fig. 4). 또한 이병주를 epoxy 수지에 포매하여 전자현미경으로 관찰한 결과 Fig.
- 괴사현상이 나타났다. 이병주로부터 total RNA를 분리하여 RT - PCR을 수행한 결과 531 bp DNA 증폭 산물을 얻었으며 genetyx win program을 이용하여 외피단백질의 염기수준에서 비교 분석한 결과, TMV-T, V, To 세 계통에서 각각 94.83%로 가장 높게 나타났고, TMV-P계통에서 67.35%로 가장 낮게 나타났다. 아미노산 수준에서 는TMV-T, V, To 세 계통에서 각각 97.
- 전라북도의 진안, 장수, 정읍 등의 3개 지역에서 재배하고 있는 지황에 바이러스 병징이 관찰되어 ELISA 방법으로 TMV의 감염 여부를 확인한 결과 3 개 지역 모두에서 ELISA 양성 반응을 나타내었다.
- 전북 진안 약초시험장의 서천배양으로부터 분리한 TMV를 13종의 지표 식물에 즙액접종한 결과, 접종 2주 후부터 초기 병징으로 담배 잎의 경우 본엽에만 necrotic ring spots 증상이 보이다가 2~4주의 시간이 경과하면서 chlorotic ring spots 되면서 괴사하였다(Fig. 2). 접종한 지표식물 중 Ch.
- 지황에서 분리한 TMV-Re와 Gene bank에 등록된 한국에서 분리된 두 계통 TMV - Pepper, Tomato(Accession No. L35073, L35074), 중국에서 분리된 계통 TMV-Fujian, Vicia faba(Accession No. AF395127, AJ011933), TMV-152 계통(Acecssion No. AF395129), TMV RNA중 coat protein 부분(Acecssion No. X68110, NC001367) TMV-rakkyo 계통(Acecssion No. D63809)을 Genetyx win program을 통하여 바이러스의 외피단백질을 비교 분석한 결과 아미노산 수준에서 TMV-T, V, To 세 계통에서 각각 97.65%로 가장 높게 나타났고, TMV-P계통에서 72.22%로 가장 낮게 나타났다. 기타 계통들간에는 TMV-152, F 계통에서 94.
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