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제안 방법
- 효소기질용액(200μl)을 가한 후 차광상태에서 30분간 실온에서 반응시켰으며, 반응정지 액 (50μl)을 가하여 1~2분간 흔들어준 후, 405nm에서 ELISA reader로 흡광도를 측정하였다. Control 값들이 예상치 범위 내에 드는지를 확인 후 duplicate로서 시료를 평가하였다.
- ) 를 사용하여 채혈했으며, 운동선수들의 혈액은 경기 직후 채취하여 사용시까지 4℃에 보관하였다. Hematology systeme whole blood 상태의 시료를 사용하며, 분석 전에 시료를 실온으로 맞춘 후 rotator(Bamstea이 Thermolyne, IA, U.S.A.)로 약 5 분간 흔들어 균일한 상태로 만든 후 실험하였다. sTfR IEMA Kit 과 Ferritin MEIA Kit에 사용한 혈장시료는 hematology system 에서 실험한 직후 3, 000 rpm으로 4℃에서 10분간 원심분리하여 얻었다.
- 표준곡성이 적중범위 안에 들면, control과 시료(200μl) 를 사용하여 결과를 얻었다. control 값이 예상치 안에 드는지를 체크한 후, 각시료를 평가하였다. 표준곡선은 duplicate assay로, 시료는 single assay로 수행하였다.
- hEPO 기능성에 대한 효과를 간접적으로 측정하기 위한 일반혈액학적 검사항목으로서 헤모글로빈 농도(HGB g/dl), 헤마토크리트 용적비(% HCT), 신생적혈구 비율(% Retic)을 측정하였다. 예비시험으로서 일반 남여를 대상으로 진공 채혈기(vacutainer)의 진공상태와 채혈경과시간에 따른 변화를 30분 간격으로 조사하였다.
- 검체흡입모드는 3가지 형태로써, 자동으로 흡입할 수 있는 automated closed tube(AC)와 수동식으로 manual open tube(MO), manual closed tube(MC)를 사용할 수 있었다. 감염의 위험성과 안전도, 시간절약 등을 고려하여 실시한 결과, control에서 AC와 MC의 결과가 별차이가 없으므로 편리성에서 AC를 선택하였다. 혈액시료에서도 모드별에 따른 값의 차이가 적어 MC를 선택했으며, 채취한 혈액량이 적은 경우 부득이하게 M0 방식으로 행하였다.
- 기기 사용법에 따라 실험하였으며, 결과측정은 cytochemical staining 값과 light scattering 값 및 흡광도를 상호 비교, 보정하여 사용하였다. 필요한 검체량은 최소 300 μl이며, 3종류 control 이 hematology parameter(HGB, HCT Retie)들의 예상범위 내의 값을 갖는지를 체크한 후 각각의 시료에 대한 parameter를 평가하였다.
- 기기의 검체흡입모드를 선택하기 위해 control과 혈액 시료를 대상으로 예비실험을 수행하였다. 검체흡입모드는 3가지 형태로써, 자동으로 흡입할 수 있는 automated closed tube(AC)와 수동식으로 manual open tube(MO), manual closed tube(MC)를 사용할 수 있었다.
- 또한 측정한 변수들에 대한 통계분석을 통해 그 외의 유용한 지표인자를 조사하였다.
- 그러므로 신생적혈구를 검출하는 데는 이 핵물질을 염색하여 flow cytometry에 의해 적혈구와 분리하여 신생 적혈구만을 정량할 수 있다. 본 실험에서는 일반 혈액학적 변수를 측정하는데 hematology system을 사용하였다.
- 서울에서 실시한 2002 월드컵의 123명 운동선수들의 hEPO 약물검사를 위하여 혈액학적 지표인 헤모글로빈, 헤마토크리트와 신생적혈구를 평가하였고, sTfR과 ferritin의 혈장농도도 분석하였다. 또한 측정한 변수들에 대한 통계분석을 통해 그 외의 유용한 지표인자를 조사하였다.
- 측정하였다. 예비시험으로서 일반 남여를 대상으로 진공 채혈기(vacutainer)의 진공상태와 채혈경과시간에 따른 변화를 30분 간격으로 조사하였다. 그 결과 전반적으로 3시간 이후에 안정적인 수치를 나타냈으며, 성별에 따른 결과치에서 남자는 9시간, 여자는 8시간 정도까지 안정적인 수치를 나타냈다.
- 운동선수 122명의 혈액시료를 날짜에 따라 23번의 batch로 분석했으며, 3 level의 control 정도관리용으로 사용하여 그 결과를 얻었다. 일반혈액학 검사는 hematology system을 이용하여 혈액을 채취한 후 S시간이내에 측정하였고, 철지표에 대한 sTfR 와 ferritin의 검사는 28개의 혈액시료에서 혈장을 분리하여 면역분석법에 의해 정량분석을 실시하였다.
- 이는 혈구 구성 및 혈액성분 parameter들로서 헤모글로빈농도 (HGB g/dl), 헤마토크리트용적비 (% HCT), 신생적 혈구비율 (% Retic) 을 측정하도록 규정하였다. 이와 같이 rhEPO를 혈액에서 간접측정 후 양성으로 나타나면 뇨시료에서 isoelectrofocusing을 이용하여 hEPO 대사체를 직접 측정하도록 규정하고 있으며, 2001년 Salt Lake 동계올림픽에서는 이에 대한 양성반응이 3건이 나타난 바 있다.
- 일반 혈액검사 항목들과 sTfR 값, ferritin 값에 대한 11개 변수를 통계적 분석하여 변수들간의 유의적 관계를 조사하였다.14) 먼저 기술통계에서 평균(mean), 표준편차(SD), 최저치(min), 최대치 (max) 등을 알 수 있는 요약통계 (univariate)를 실시하였다.
- 일반 혈액학적 검사항목들과 철대사 지표(sTfR, ferritin)에 대해 각각의 상관관계를 조사하여 유의성을 비교하였다. 통계처리는 SAS(V8.
- 자동분석기기의 carrousel에 reaction cell을 넣고 reagent pack 을 사용하여 calibrator와 control에 대한 결과를 얻었다. 표준곡성이 적중범위 안에 들면, control과 시료(200μl) 를 사용하여 결과를 얻었다.
- 혈장 ferritin 농도는 일반적으로 체내 저장된 철 상태를 파악하는 검사로서 다른 골수검사를 통해 저장된 철 정도를 판정하는 것보다 용이하므로 혈장 중 ferritin 검출에 의존하는 경우가 많다. 자동화된 미립자효소면역법킷트를 이용하여 측정하였다.
- 혈액시료에서도 모드별에 따른 값의 차이가 적어 MC를 선택했으며, 채취한 혈액량이 적은 경우 부득이하게 M0 방식으로 행하였다. 측정한 혈액 시료 중 HGB 농도, % HCT, % Retie에 대해 책정한 판정 기준에서 벗어나는 시료는 5번 이상 더 측정하였다. 특히, % Retie 값이 계속해서 낮은 값을 나타내면 혈장희석제를 사용했을 가능성이 있으며, 높은 값을 나타내면 hEPO 도핑이 의심스러우므로 잠정적으로 양성판정을 하였다.
- 측정한 혈액 시료 중 HGB 농도, % HCT, % Retie에 대해 책정한 판정 기준에서 벗어나는 시료는 5번 이상 더 측정하였다. 특히, % Retie 값이 계속해서 낮은 값을 나타내면 혈장희석제를 사용했을 가능성이 있으며, 높은 값을 나타내면 hEPO 도핑이 의심스러우므로 잠정적으로 양성판정을 하였다.
- 표준곡선 및 표준곡선 범위 - 킷트마다 각각의 표준물질을 사용하여 보정한 calibrator를 사용했으며 , sTfR IEMA kit는 0~10 ㎍/㎖의 표준곡선범위를 사용하였고, Ferritin MEIA kit는 0~ 1000 ng/㎖ 범위를 사용하였다. Calibrator에 사용한 matrix는 각각 달라서 sTfR IEMA kit는 인간혈청을, Ferritin MEIA kit는 인간비장 페리틴을 buffer matrix에 희석하여 사용하였다.
- control 값이 예상치 안에 드는지를 체크한 후, 각시료를 평가하였다. 표준곡선은 duplicate assay로, 시료는 single assay로 수행하였다.
- 사용하였다. 필요한 검체량은 최소 300 μl이며, 3종류 control 이 hematology parameter(HGB, HCT Retie)들의 예상범위 내의 값을 갖는지를 체크한 후 각각의 시료에 대한 parameter를 평가하였다.
- 혈액시료에서 혈액학적 검사가 끝난 후, 혈장을 분리하여 sTfR 와 철대사 지표인 페리틴을 면역학적 분석법으로 정량하였다.
- 감염의 위험성과 안전도, 시간절약 등을 고려하여 실시한 결과, control에서 AC와 MC의 결과가 별차이가 없으므로 편리성에서 AC를 선택하였다. 혈액시료에서도 모드별에 따른 값의 차이가 적어 MC를 선택했으며, 채취한 혈액량이 적은 경우 부득이하게 M0 방식으로 행하였다. 측정한 혈액 시료 중 HGB 농도, % HCT, % Retie에 대해 책정한 판정 기준에서 벗어나는 시료는 5번 이상 더 측정하였다.
- 즉시 조제한 효소접합항체(200μl)를 가해 실온에서 1시간 흔들어 준 후, 위의 세척과정을 반복하였다. 효소기질용액(200μl)을 가한 후 차광상태에서 30분간 실온에서 반응시켰으며, 반응정지 액 (50μl)을 가하여 1~2분간 흔들어준 후, 405nm에서 ELISA reader로 흡광도를 측정하였다. Control 값들이 예상치 범위 내에 드는지를 확인 후 duplicate로서 시료를 평가하였다.
대상 데이터
- 이 킷트는 단일클론항체로 코팅된 microtitre strip(12 ×8 wells), standard, control(2 level), 효소접합항체, assay buffer, 농축효소기질액 (p-nitropheny] phosphate), 기질 buffer, 반응정지액, 시료희석액, 농축세척액으로 구성되어 있다. sTfR 표준액은 6 level(0, 0.4, 1.5, 2.8, 5.4, 9 ㎍/㎖)로서 인간혈청을 사용하였다. 효소접합항체는 alkaline phosphatase를 sTfR 단일클론항체에 접합시켰다.
데이터처리
- 조사하였다.14) 먼저 기술통계에서 평균(mean), 표준편차(SD), 최저치(min), 최대치 (max) 등을 알 수 있는 요약통계 (univariate)를 실시하였다. HGB의 경우 95%의 신뢰도의 범위는 12.
- hEPO 도핑검사시, 정확한 기준이 되는 유의적인 변수를 알아보고자 가장 유력한 5개의 변수인 HGB, HCT Retic, sTfR, ferritin에 대하여 모든 11개 변수와의 관계를 회귀분석 중 linear regression에 의해 실시하였다. 먼저 다중공산분석 (partial correlation)을 실시하였을 때, Pr>F의 수치가 0.
- 각 변수들간의 상관관계와 분포도는 SAS program을 이용하여 결과를 얻었으며, scatter plot에 의한 상관성과 막대그래프에 의한 분포도를 조사한 결과는 Fig. 3과 같다. 이때 두 변수간의 상관계수(r)와 p-value는 Table Ⅲ과 같다.
- 평가하였다. 그리고 이 표준곡선에서 얻은 정도관리용 control 값의 변화을 통계처리하여 intra-assay precision 값으로 적용하였다. 그 결과, 표준곡선 직선식의 기울기와 y축 intercept 의 변이상수 (coeffcient of variation)가 매우 낮아 표준곡선의 재현성이 우수함을 알 수 있었다.
- 날짜에 따른 23 batch assay의 HGB 농도, % HCT % Retie 값의 variation을 통계적으로 분석하여 intra-assay precision으로 표시하였다. HGB의 경우 control의 평균치 5.
- 위의 결과에서 상관성 있는 5가지의 경우, 변수들만을 가지고서 어느 정도의 상관관계가 있는 지를 simple linear regression 에 의하여 조사하였으며, 직선방정식 (Y=aX+b)과 상관계수(r)는 Table Ⅳ와 같다. 특히 HGB vs, HCT의 직선식 상관계수(r) 가 0.
- 통계처리는 SAS(V8.1) 통계프로그램을 이용하여 각 변수들에 대한 correlation과 regression을 시행하여 유의적인 변수를 조사하였고, 또한 각 항목별 상관관계를 구하여 P<0.05를 유의한 것으로 분석하였다.
- 표준곡선의 재현성 및 intra-assay precision - 표준곡선의 재현성은 표준곡선의 직선식 (log y=a log x+b)에서의 변수인 a와 b의 변수정도를 통계처리하여 얻었다. 표준곡선의 평균직선식은 sTfR IEMA kit의 경우 log y=0.
이론/모형
- 효소접합항체는 alkaline phosphatase를 sTfR 단일클론항체에 접합시켰다. 분석방법은 사용지침서를 따랐으며 , 405 nm에서 흡광도를 측정하여 결과를 얻었다.
- 이 킷트는 기기자동화된 미 립자효소면역분석 법 (microparticle enzyme immunoassay; MEIA)을 이용하였다. 효소접합항체, 미립자접합항체가 시료 중 ferritin과 반응하여 샌드위치형식의 면역항체복합체를 형성하면 이를 이ass fiber matrix에 여과시킨 후효소기질로 반응시켜 나타나는 형광물질의 생성율을 측정 (Ex/ Em=359~371 nm/450~455 nm)하여 정량 분석할 수 있다.
- 혈장 중 sTfR 농도는 적혈구 조혈의 활성도를 반영하고 조직 내 이용가능한 철분량을 반영한다. 이는 효소면역측정법 킷트를 사용하여 측정하였다. 혈장 ferritin 농도는 일반적으로 체내 저장된 철 상태를 파악하는 검사로서 다른 골수검사를 통해 저장된 철 정도를 판정하는 것보다 용이하므로 혈장 중 ferritin 검출에 의존하는 경우가 많다.
- 혈액시료에 대한 일반 혈액검사는 hematology 측정기기인 ADVIA 120을 이용하여 측정하였다. 이 기기에 사용하는 시약은 calibrator, control, 검사항목에 따른 특정시약들과 기기세척시약들로 구성되어 있다.
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