이상민
(대구 마리아 산부인과)
,
이주희
(대구 마리아 산부인과)
,
이상원
(대구 마리아 산부인과)
,
이승민
(대구 마리아 산부인과)
,
윤산현
(서울 마리아 병원)
,
임진호
(서울 마리아 병원)
,
박흠대
(대구대학교 식품 생명 화학공학부)
,
이성구
(대구 마리아 산부인과)
Objective: The purpose of this study was to evaluate the survival rate of vitrified blastocyst according to the freezing vessels, equilibration time in cryoprotectant and artificial dehydration method. Methods: Human blastocysts were vitrified after loading onto the plastic straw, open-pulled straw ...
Objective: The purpose of this study was to evaluate the survival rate of vitrified blastocyst according to the freezing vessels, equilibration time in cryoprotectant and artificial dehydration method. Methods: Human blastocysts were vitrified after loading onto the plastic straw, open-pulled straw (OPS), electron microscopy grid (EM grid) for 1.5 min or 3 min. They also were directly plunged into LN2 within 30sec. For artificial shrinkage of blastocysts, 36 gauge fine needle was pushed at the cellular junction of the trophectoderm into the blstocoele cavity until it shrank without damage of inner cell mass. Results: The survival rate of vitrified blastocysts on plastic straw, OPS, EM grid as freezing vessels were 26.7, 13.0 and 60.5%, respectively. The survival rate of EM grid was significantly higher than that of plastic straw and OPS (p<0.05). For 1.5 min equilibrium, the survival rates of early blastocyst (EB), middle blastocyst (MB) and late blastocyst (LB) were 64.4, 81.0, and 20.0% respectively. For 3 min equilibrium, the survival rates of EB, MB, and LB were 69.9, 50.0 and 57.5% respectively. The survival rates of EB and MB were significantly higher than that of LB in 1.5 min equilibrium group (p<0.05), however, the significance was not observed in 3 min equilibrium groups. In cytoplasmic shrinkage before vitrification, the survival rates of EB, MB and LB were 92.9, 100 and 75.9% respectively. The survival rate of MB was significantly higher than that of LB (p<0.05). The survival rates of vitrified blastocysts by artificial dehydration and slow-frozen blastocysts were not significantly different as 88.9 and 66.7%, respectively. Conclusion: This study showed that the vitrification of human blastocysts using EM grid and artificial dehydration is an effective method. Therefore, these methods would be an useful techniques for blastocyst cryopreservation.
Objective: The purpose of this study was to evaluate the survival rate of vitrified blastocyst according to the freezing vessels, equilibration time in cryoprotectant and artificial dehydration method. Methods: Human blastocysts were vitrified after loading onto the plastic straw, open-pulled straw (OPS), electron microscopy grid (EM grid) for 1.5 min or 3 min. They also were directly plunged into LN2 within 30sec. For artificial shrinkage of blastocysts, 36 gauge fine needle was pushed at the cellular junction of the trophectoderm into the blstocoele cavity until it shrank without damage of inner cell mass. Results: The survival rate of vitrified blastocysts on plastic straw, OPS, EM grid as freezing vessels were 26.7, 13.0 and 60.5%, respectively. The survival rate of EM grid was significantly higher than that of plastic straw and OPS (p<0.05). For 1.5 min equilibrium, the survival rates of early blastocyst (EB), middle blastocyst (MB) and late blastocyst (LB) were 64.4, 81.0, and 20.0% respectively. For 3 min equilibrium, the survival rates of EB, MB, and LB were 69.9, 50.0 and 57.5% respectively. The survival rates of EB and MB were significantly higher than that of LB in 1.5 min equilibrium group (p<0.05), however, the significance was not observed in 3 min equilibrium groups. In cytoplasmic shrinkage before vitrification, the survival rates of EB, MB and LB were 92.9, 100 and 75.9% respectively. The survival rate of MB was significantly higher than that of LB (p<0.05). The survival rates of vitrified blastocysts by artificial dehydration and slow-frozen blastocysts were not significantly different as 88.9 and 66.7%, respectively. Conclusion: This study showed that the vitrification of human blastocysts using EM grid and artificial dehydration is an effective method. Therefore, these methods would be an useful techniques for blastocyst cryopreservation.
* AI 자동 식별 결과로 적합하지 않은 문장이 있을 수 있으니, 이용에 유의하시기 바랍니다.
문제 정의
따라서 본 연구는 인간 체외수정-배아이식의 프로그램에서 생산된 배반포를 이용하여 동결보존시 유리화 동결법에 있어서 동결·융해 후 생존율에 미치는 세포내 효과적인 탈수방법과 더불어 노출시간 및 동결보존용기로서 EM grid의 사용효과를 검토하였다.
제안 방법
400 mesh copper EM grid (IGC 400; Pelco International)를 이용한 유리화 동결은 EG20에서 1.5~3분간 처리하고 EFS40으로 옮겨 EM grid 위에 배아를 놓고 액체질소에 침지하기까지 30초를 초과하지 않도록 하였다. 융해 및 동결액의 제거는 상기의 방법에 준하였다.
각 발생단계별 배반포를 동결보호제로 처리하기전 36 gauge needle을 이용하여 투명대를 찔러 세포 강내의 수분을 제거하고 세포질을 수축시킴으로써 인위적 탈수를 유도하였다. 그 후 동결보호제를 처리하여 유리화 동결 및 융해 후의 생존율의 결과는 Table 3과 같다.
대상 환자에서 GnRH-agonist (Buserelin, Suprefact, Hoechst)와 FSH/hMG를 병용한 황체기 장기투여법으로 과배란을 유도하였으며, 난포의 직경이 17~18 mm 이상인 것이 2개 이상 확인될 경우 hCG (profasi, Serono)을 투여하였고, 36~38시간 후 질식 초음파를 이용하여 난포란을 채취하였다.
5~3분간 처리한 후, EFS40에 옮겨 30초~1분 이내에 각각의 보존용기에 1~5개의 배반포를 장진하여 액체질소에 바로 침지하였다. 동결된 배아의 융해는 실온에서 0.5 M, 0.25 M Sucrose 용액에서 각각 5분, Sucrose 무첨가 기초동결액에서 5분 간을 순차적으로 처리하여 동결액을 제거하였다.
배반포강내의 탈수를 위해 동결전 모든 배반포의 투명대를 36 gauge needle (Hamilton, 90033)을 이용하여 찔러줌으로써 인위적으로 배반포강내의 수분을 제거하고 배반포강을 수축시킨 후 EM grid로 유리화 동결을 행하였다. 이때 사용된 EG20에서의 전처리시간은 3분 이었으며 EFS40에서는 최대한 빨리(30초 이내) 처리하여 액체질소내로 침지하였다.
체외수정 유도 후 14~18시간째에 정상 수정난자는 미리 준비한 난구세포와 37℃, 5% CO2 배양기에서 공동배양하였다. 배양 후 24시간마다 20% hFF 첨가된 신선 YS배양액으로 교환하면서 5일 동안 배양하여 배반포로의 발달을 관찰하고, 형태적으로 양질의 배아를 이식하였으며, 잉여의 배반포는 동결하였다. 한편, 제2극체가 존재 하면서 비정상적인 수정난자 (1개의 전핵 또는 3개 이상)를 구분하여 상기의 방법대로 별도로 5~6일 배양하여 발생한 배반포도 동결하였다.
5,7 그러나 동결보호제를 개선함으로써 오늘날에는 발달단계와는 관계없이 높은 생존율을 얻을 수 있다. 본 연구에서는 동결보호제로서 EG20과 EFS40을 사용한 2단계 동결법으로 유리화 동결을 행하였다. 그 결과 EB의 경우는 처리시간에 관계없이 생존율이 안정되었으며, MB의 경우는 처리시간이 길어짐으로써 생존율이 저하하였고, 배반포강이 큰 LB는 1.
본 연구는 본원의 IVF-ET 프로그램에 참여한 환자 중 배아이식 후 남은 배반포를 유리화 동결을 실시한 83주기를 대상으로 하였다. 실험적인 결과는 같은 기간 동안 생산된 비정상적인 수정란 유래의 배반포를 이용하여 동결융해 후의 생존율을 조사하였다.
채취된 난자는 성숙을 확인한 후 10%의 인간난포액이 함유된 YS배양액에서 정자의 최종농도를 1×105 cells/ml로 조정하여 37℃, 5% CO2 배양기에서 체외수정을 유도하였다. 체외수정 유도 후 14~18시간째에 정상 수정난자는 미리 준비한 난구세포와 37℃, 5% CO2 배양기에서 공동배양하였다.
대상 데이터
본 연구는 본원의 IVF-ET 프로그램에 참여한 환자 중 배아이식 후 남은 배반포를 유리화 동결을 실시한 83주기를 대상으로 하였다. 실험적인 결과는 같은 기간 동안 생산된 비정상적인 수정란 유래의 배반포를 이용하여 동결융해 후의 생존율을 조사하였다.
한편, 제2극체가 존재 하면서 비정상적인 수정난자 (1개의 전핵 또는 3개 이상)를 구분하여 상기의 방법대로 별도로 5~6일 배양하여 발생한 배반포도 동결하였다. 생산된 배반포는 배반포강의 형성시기 및 크기에 따라 EB (초기배반포), MB (중기배반포), LB (후기배반포)로 구분하여 실험에 공시하였다.11
데이터처리
실험결과의 통계적 유의성 검정은 SAS (statistical analysis system)를 이용한 chi-square (χ2 ) test에 의하여 분석하였다.
성능/효과
동결보존용기로서 plastic straw, OPS 및 EM grid 를 이용한 유리화 동결 및 융해한 배반포의 생존율은 Table 1과 같다. 각 실험구간의 생존율은 plastic straw구의 26.7% (4/15), OPS구의 13.0% (3/23), EM grid구의 60.5% (49/81)로서, 융해 후 회수율에서 다른 구에 비해 다소 낮지만 EM grid구에서 유의하게 높은 생존율을 얻을 수 있었다 (p<0.05).
본 연구에서는 동결보호제로서 EG20과 EFS40을 사용한 2단계 동결법으로 유리화 동결을 행하였다. 그 결과 EB의 경우는 처리시간에 관계없이 생존율이 안정되었으며, MB의 경우는 처리시간이 길어짐으로써 생존율이 저하하였고, 배반포강이 큰 LB는 1.5분 처리로는 충분한 탈수가 일어나지 않아 생존율이 낮았지만, 처리시간이 길어짐에 따라 생존율도 향상되었다. 따라서 적당한 동결 보호제를 선택한다면 평형시간보다는 오히려 세포내 탈수를 유도할 수 있는 방법의 개발이 더욱 필요하다고 사료된다.
6 반면 본 연구에서 이용한 인위적 탈수방법은 단지 배 반포의 투명대에 물리적 자극을 주어 세포질을 수축시킨다. 그 결과 융해 후의 높은 생존율도 얻었을 뿐만 아니라 투명대에 작은 구멍을 내어줌으로써 보조부화의 효과도 생각할 수 있다.
따라서 물리적 자극 후 세포질 수축 유도 후 유리화 동결을 실시하는 것이 효과적임을 알 수 있다. 인간에 있어서 시험관 아기센터에서 일반적으로 사용하는 방법은 완만동결법이다.
0% (3/15)에 비해 유의하게 높은 생존율을 나타내었다. 따라서 발생단계별로 보면 MB군은 1.5분 처리에서 LB군은 3분 처리에서 가장 높은 생존율을 보였으며 후기 배반포단계로 발달할수록 동결시 더 많은 평형시간을 필요로 할 것으로 사료된다.
1% (16/38)로서, LB구가 가장 낮았으며, 특히 다른 두 구에 비해 유의하게 낮았다. 따라서 인위적 탈수구에서의 EB, MB 및 LB 등 배반포의 발달단계와 관계없이 인위적 탈수를 하지않은 구에 비해 생존율이 상승하였으나 LB구를 제외하고는 유의차는 인정되지 않았다.
이상과 같이 동물 종에 따라서는 약간의 차이가 있지만, 비교적 유리화 동결 배의 생존율이 높았다. 본 연구에서도 인위적 탈수 후의 유리화 동결이 완만동결보다도 효과적이라는 것을 입증하였다. 따라서 본 연구에서 개발한 인위적 탈수 후의 유리화 동결법을 더욱 개량함으로써 임상적용으로의 응용에도 그 이용 가능성은 매우 높다고 사료된다.
인위적 탈수 후 유리화 동결의 효과를 검증하기 위하여 완만동결과 비교검토한 결과는 Table 4와 같다. 완만동결구의 동결 후 배반포의 생존율은 66.7%(10/15)이며, 인위적 탈수 후의 유리화 동결구는 88.9% (16/18)로서, 완만동결구보다 생존율이 다소 높았지만, 통계적인 유의차는 인정되지 않았다.
이상과 같이 동물 종에 따라서는 약간의 차이가 있지만, 비교적 유리화 동결 배의 생존율이 높았다. 본 연구에서도 인위적 탈수 후의 유리화 동결이 완만동결보다도 효과적이라는 것을 입증하였다.
인위적 탈수유도군에서 MB, MB 및 LB의 생존율은 각각 92.9% (13/14), 100% (17/17) 및 75.9% (41/54)로서, MB구가 가장 높았으며, 특히 LB구보다는 유의하게 높았다 (p<0.05). 인위적 탈수를 유도하지 않은 군에서는 각각 66.
후속연구
17 또 다른 동결보존용기로 EM grid는 Martino 등이 소 난자의 유리화 동결에 처음으로 보고한 이래,9,10 Park 등은 plastic straw와 EM grid의 비교 검토에서 EM grid의 효율성을 입증하였다.7 또한 본 연구를 통한 EM grid의 효과가 증명되었기 때문에 앞으로 인간 배아의 동결보존에 EM grid의 사용을 검토할 필요가 있다.
본 연구에서도 인위적 탈수 후의 유리화 동결이 완만동결보다도 효과적이라는 것을 입증하였다. 따라서 본 연구에서 개발한 인위적 탈수 후의 유리화 동결법을 더욱 개량함으로써 임상적용으로의 응용에도 그 이용 가능성은 매우 높다고 사료된다.
참고문헌 (23)
Miyamoto H, Ishibashi T. Survival of mouse embryos frozen-thawed slowly or rapidly in the presence of various cryoprotectants. J Exp Zool 1983; 226:123-7
Rall WF, Wood M. High in vitro and in vivo survival of day 3 mouse embryos vitrified or frozen in an non-toxic solution of glycerol and albumin. J Reprod Fertil 1994; 101: 681-8
Saha S, Otoi T, Takagi M, Boediono A, Sumantri C, Suzuki T. Normal calves obtained after direct transfer of vitrified bovine embryos using ethylene glycol, trehalose, and polyvinylpyrrolidone. Cryobiology 1996; 33: 291-9
Kasai M, Hamaguchi Y, Zhu SE, Miyake T, Sakurai T, Machida T. High survival of rabbit morulae after vitrification in an ethylene glycol-based solution by a simple method. Biol Reprod 1992; 46: 1042-6
Zhu SE, Kasai M, Otoge H, Sakurai T, Machida T. Cryopreservation of expanded mouse blastocysts by vitrification in ethylene glycol-based solutions. J Reprod Fertil 1993; 98: 139-45
Mahmoudzadeh AR, Van Soom A, Bols P, Ysebaert MT, de Kruif A. Optimization of a simple vitrification procedure for bovine embryos produced in vitro: effect of developmental stage, two-step addition of cryoprotectant and sucrose dilution on embryonic survival. J Reprod Fertil 1995; 103: 33-9
Park SP, Kim EY, Kim DI, Park NH, Won YS, Yoon SH, et al. Simple, efficient and successful vitrification of bovine blastocysts using electron microscope grids. Hum Reprod 1999; 14: 2838-43
Vanderzwalmen P, Delval A, Chatziparasidou A, Bertin G, Ectors F, Lejeune B. Pregnancies after vitrification of human day 5 embryos. Hum Reprod 1997; 12: O-198
Martino A, Pollard JA, Leibo SP. Effect of chilling bovine oocytes on their developmental competence. Mol Reprod Dev 1996; 45: 503-12
이석원, 윤산현, 윤혜균, 조현진, 허용수, 윤혜진 등. IVF-ET program에서 blastocyst 배아의 발생에 관한 연구: II. 난구세포 공동배양에 의한 blastocyst 배아의 발생. 대한불임학회지 1998;25: 35-41
Tachikawa S, Otoi T, Kondo S, Machida T, Kasai M. Successful vitrification of bovine blastocysts, derived by in vitro maturation and fertilization. Mol Reprod Dev 1993; 34: 266-71
Vajta G, Rindom N, Peura TT, Holm P, Greve T. Callesen H. The effect of media, serum and temperature on in vitro survival of bovine blastocysts after Open Pulled Straw (OPS) vitrification. Theriogenology 1999; 52: 939-48
Chen SU, Lien YR, Chen HF, Chao KH, Ho HN, Yang YS. Open pulled straws for vitrification of mature mouse oocytes preserve patterns of meiotic spindles and chromosomes better than conventional straws. Hum Reprod 2000; 15: 2598-603
Kong IK, Lee SI, Cho SG, Cho SK, Park CS. Comparison of open pulled straw (OPS) vs glass micropipette (GMP) vitrification in mouse blastocysts. Theriogenology 2000; 53: 1817-26
Uechi H, Tsutsumi O, Morita Y, Takai Y, Taketani Y. Comparison of the effects of controlled-rate cryopreservation and vitrification on 2-cell mouse embryos and their subsequent development. Hum Reprod 1999; 14: 2827-32
Leibo SP, Oda K. High survival of mouse zygotes and embryos cooled rapidly or slowly in ethylene glycol plus polyvinylpyrrolidone. Cryo-Letters 1993;14: 133-44
Van Wagtendonk-De Leeuw AM, Den Daas JH, Kruip TA, Rall WF. Comparison of the efficacy of conventional slow freezing and rapid cryopreservation methods for bovine embryos. Cryobiology 1995; 32: 157-67
Martinez AG, de Matos DG, Furnus CC, Brogliatti GM. In vitro evaluation and pregnancy rates after vitrification of in vitro produced bovine embryos. Theriogenology 1998; 50: 757-67
※ AI-Helper는 부적절한 답변을 할 수 있습니다.