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문제 정의
- 중금속독성에 관한 연구는 실제 자연에서 발생되는 생체와 세포의 활성도 변화에 대한 이해를 전제로 하여 확실한 기전을 알 수 있다. 본 연구에서는 녹조류의 일종인 Selenastrimi capricormgm을 카드뮴에 노출시켰을 때 세포 내에서의 반응 즉, 세포생존율의 감소를 포함한 활력도 변화에 대한 분석 방법으로서 Flow-cytometry 를 사용하여 그 객관적 해석을 편리하게 하고 무독화 반응에 관여하는 효소들 (APX, GST, GPX) 의 활성도 변화를 부연함으로써 카드뮴이 녹조류의 세포 활성에 대응하는 변화를 알아보고자 하였다.
제안 방법
- 50 mM KPO4 buffer, 1 mM Na2~EDTA, 114 mM NaCl, 1 mM GSH, 0.2 mM NADPH, 0.25 mM H2O2, 1 unit (mM · min-1) GSSG-reductase의 혼합액을 시료 수만큼 만들고 50gg 단백질을 첨가한 후 340 nm에서 흡광도가 증가하는 것을 측정하였다.
- 5μl씩 처리하여 0℃ 이하에서 30분간 방치하였다. FDA 염색과 마찬가지로 PI만의 형광도를 비교하기 위해서 같은 농도의 세포를 100℃에서 10분간 끓인 세포를 대조군으로 하였다.
- 5㎕씩 처리하여 0℃ 이하에서 30분간 방치하였다. FDA만의 형광도를 비교하기 위해서 같은 농도의 세포를 ioo℃에서 10분간 끓인 것 올 대조군으로 하였다. Membrane integrity 측정을 위하여 Propidium iodide (PI, Sigma P-4170)는 100 ㎍/ml의 농도로 tris buffer나 PBS (phosphate buf- fer)에 용해하여 4℃에 암보관하였다.
- 이 상층액을 sample로 사용하였다. Native PAGE gel (5% stacking gel, 10% separating gel)을 이용하여 4℃에서 30분간 pre-running한 후 sample 을 loading bufer (3 mM Tris-HCl pH 6.8, 25% Glycerol, 0.005% Bromophenol Blue)와 섞어 gel에 loading하였다. 200 V, 40 mA 상태에서 전기 영동 후 gel은 equilibration solution (50 mM sodium phos phate buffer, 2 mM ascorbate)을 이용하여 10 분간반응을 시키고 equilibration solution을 교체하여 3 회 반복했다(Mittler, 1993; Jin, 1995).
- Lysate는 차가운 PBS로 bead의 색깔이 반투명해질 때까지 세척하였다. Pippet을 이용하여 상층 액을 제거한 후 PBS를 10 ㎕ 를 첨가하여 vortex- ing하고 95℃에서 3분간 끓여서 SDS-PAGE를 수행하였다.
- m「'가 되도록 무균 대에서 접종하였다. 각 배지는 3개씩 반복구를 조성하여 세포접종 후 4일째에 각 배지에 Oppm, 5 ppm의 농도로 카드뮴을 투여하였다. 배양조건은 온도 25℃, 광도 45 μM photon .
- APX의 활성이 높아짐에 따라 ascorbate가 합성올 조절하는 세포벽 구성물질 중에 하나인 chitin의 합성이 조절되지 못해 세포벽 합성이 계속되어 세포팽창과 같은 현상이 관찰되었다. 또 APX로 추정되는 단백질이 카드뮴에 의해 induction되는 것올 확인하였다.
- 3 으로 분석하였다. 살아있는 세포의 활력도와 형광발색을 위하여 세포막의 활성도를 esterase를 이용한 Fluorescein diacetate 세포염색을 활용하였다. 배지내의 세포를 1 × 106cells · m1-1의 농도로 취하여 멸균한 새 배지로 약하게 세척하였다.
- 세포의 활력도는 FACS Calibur Flow Cytometer system (Becton Dickinson, Inc.)를 이용하여 측정한 후, 'CellQuest' program version 3.3 으로 분석하였다. 살아있는 세포의 활력도와 형광발색을 위하여 세포막의 활성도를 esterase를 이용한 Fluorescein diacetate 세포염색을 활용하였다.
대상 데이터
- 실험재료인 Selenastrum capricornutum (Chloro- phyceae) (NIERT0005, Korea)는 담수에서 서식하는 녹조류의 일종으로 Bold(1949)에 의하여 조성된 Bristol solution을 50%로 희석하여 배양하였다. 삼각 플라스크(5/)에 배양액 21를 채워 멸균기 (AutoClave : KMC-1221, Vison Scientific Co.
성능/효과
- 7). APX는 native PAGE를 이용해서도 활성도를 보였는데, gel에 내린 결과도 카드뮴을 처리하지 않은 세포에서 보다 눈에 띄게 증가하였다(Fig. 7. A).
- APX의 활성이 높아짐에 따라 ascorbate가 합성올 조절하는 세포벽 구성물질 중에 하나인 chitin의 합성이 조절되지 못해 세포벽 합성이 계속되어 세포팽창과 같은 현상이 관찰되었다. 또 APX로 추정되는 단백질이 카드뮴에 의해 induction되는 것올 확인하였다.
- Esterase의 활성으로 세포에 대한 viability가 높다고 볼 수 있는 right area에 대한 각 조류의 상대적 분포에서 카드뮴을 처리하지 않은 배지에서는 85%의 빈도를 보였으나 카드뮴을 처리한 배지에서는 34%로 낮은 빈도를 보여 카드뮴에 의한 세포 활성 저해를 확인 할 수 있었다(Table 2).
- Flow cytometry를 이용한 배지별 세포의 활력도 분석에서 조류세포에 대한 카드뮴의 영향을 확인할 수 있었다 (Fig. 2). Propidium iodide (PI)는 non- permeant dye로 건강한 세포 내로는 흡수가 되지 않는다.
- 변화하였다. 녹조류에 있어서 카드뮴에 대한 영향으로 나타나는 생장저해는 세포분열의 감소와 Flow-cytometry 에 의한 세포의 활력도에 저해로 뚜렷이 나타났다.
- , 1979;Wendel, 1980). 두 군 간의 GPX 활성도는 t 검정을 통하여 유의한 차이를 보여 (t = 3.6, p = 0.022), 카드뮴을 처리한 것에서 모두 높은 활성을 보인 것으로 나타났다 (Fig. 6).
- 따라서 죽은 세포나 죽지는 않았지만 스트레스로 인해 세포막의 기능이 저하된 세포로는 침투하여 핵산사이에 삽입되어 red fluorescence을 나타내게 된다. 따라서 조류세포를 95℃에서 10분간 반응시킴으로써 모두 죽은 세포는 모두 PI 영역인 left area에 분포하게 되는데 점의 분포가 왼쪽으로 치우칠수록 PI의 형광도가 높은 것으로 카드뮴을 처리한 세포에서는 left area의 분포가 카드뮴을 처리하지 않은 세포보다 넓은 것을 확인할 수 있었다(Fig. 2. A). 한편 fluorescein diacetate (FDA)는 permeant dye로 세포내로 들어가게 되면 esterase에 의해 diacetate group cleave off 되면서 강한 green fluorescence을 나타내게 된다.
- 9배의 차이를 보였다. 또한 새로운 배지에의 적응기간을 두기 위해 접종 후 4일째에 카드뮴을 처리한 바, 처리 후 2일째 되는 날부터 생존율이 감소하기 시작했다. 이와같은 결과는 세포분열에 의한 세포수로 계산한 조류세포의 상대성장율 (Specific Growth Rate, SGR) 산정에서도 확인되어, independent t 검정에 의한 두 군의 평균 SGR은 카드뮴처리 후 2일까지의 변화에서만 유의한 차이를 나타내지 않았고 나머지 4일과 6일까지의 비교에서는 모두 도루- 유의한 차이를 확인할 수 있었다(Table 1).
- 또한 중금속에 의해 야기되는 oxidative stress를 해소하기 위한 peroxidation 관련 효소인 APX나 GPX activity가 증가함을 보였고, glutathione을 conjugation시키는 GST의 activity가 높아지므로써 GSH의 이용이 활발해짐을 알 수 있었다. APX의 활성이 높아짐에 따라 ascorbate가 합성올 조절하는 세포벽 구성물질 중에 하나인 chitin의 합성이 조절되지 못해 세포벽 합성이 계속되어 세포팽창과 같은 현상이 관찰되었다.
- 또한 새로운 배지에의 적응기간을 두기 위해 접종 후 4일째에 카드뮴을 처리한 바, 처리 후 2일째 되는 날부터 생존율이 감소하기 시작했다. 이와같은 결과는 세포분열에 의한 세포수로 계산한 조류세포의 상대성장율 (Specific Growth Rate, SGR) 산정에서도 확인되어, independent t 검정에 의한 두 군의 평균 SGR은 카드뮴처리 후 2일까지의 변화에서만 유의한 차이를 나타내지 않았고 나머지 4일과 6일까지의 비교에서는 모두 도루- 유의한 차이를 확인할 수 있었다(Table 1). 즉, 카드뮴 처리 후 2일에 카드뮴의 처리일의 경과에 따라 카드뮴을 처리하지 않은 배지에서는 0.
- 조류의 배지에 5 ppm의 카드뮴을 처리했을 때 카드뮴을 처리하지 않은 배지보다 조류의 세포 수는 현저히 낮아짐을 확인 할 수 있었다(Fig. 1). 이들 두 군간의 카드뮴 처리 후 각 일별 평균세포수비교에서 t 검정 후 모두 고도로 유의한 차이를 보였는데 (2 days t = 7.
- 이와같은 결과는 세포분열에 의한 세포수로 계산한 조류세포의 상대성장율 (Specific Growth Rate, SGR) 산정에서도 확인되어, independent t 검정에 의한 두 군의 평균 SGR은 카드뮴처리 후 2일까지의 변화에서만 유의한 차이를 나타내지 않았고 나머지 4일과 6일까지의 비교에서는 모두 도루- 유의한 차이를 확인할 수 있었다(Table 1). 즉, 카드뮴 처리 후 2일에 카드뮴의 처리일의 경과에 따라 카드뮴을 처리하지 않은 배지에서는 0.1805에서 0.1703으로 상대성장율이 유지되는데 반하여 카드뮴을 처리한 배지에서는 0.0833에서 0.0175로 카드뮴에 의한 세포분열 속도가 저해됨을 확인할 수 있었다.
- Right area는 FDA의 영역으로 오른쪽으로 치우칠수록 FDA의 형광도가 높은 것으로 95℃로 처리한 죽은 세포에서는 esterase activity를 볼 수 없어 right area 에 점이 표시되지 않았다. 카드뮴을 처리하지 않은 배지의 세포는 PI의 형광도가 적은 반면 FDA의 형광도는 매우 컸으며 카드뮴을 처리한 배지의 조류세포는 PI의 형광도가 카드뮴을 처리하지 않은 세포보다 증가하고 FDA 의 형광도가 감소하였다. 또한, 카드뮴을 처리한 대부분의 세포가 left area 중에서도 아랫부분에 많은 것을 볼 수 있는데 이것은 esterase의 activity는 있지만 점점 PI 의 형광을 띠게 되는 left area의 윗부분으로 migra- tion하여, 세포가 완전히 죽지는 않았지만 카드뮴에 의한 스트레스로 인해 membrane integrity/} 낮아졌음을 의미할 수 있다.
- 한편 이들 세포의 처리군 별 viability를 FDA에 반응한 esterase의 활성 정도에 대한 강도를 서로 비교한 결과 카드뮴을 처리하지 않은 건강한 조류 세포의 형광강도는 mature 한 세포군과 정상적으로 분열하여 그 크기와 형광강도가 약한 어린 세포군으로 양분되어 정상적인 세포 성장과정에 따른 양분 현상을 보인 반면 대부분은 카드뮴을 처리한 배지에서의 형광흡광은 중앙에 편중되어 카드뮴에의한 성장저해효과로 세포의 각 성장주기가 고정되어 있다는 것을 알 수 있었다(Fig. 3).
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