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문제 정의
- 따라서 본 연구에서는 2000~2002년 부산지역의 바이러스성 뇌수막염 유행예측조사 과정 중 분리된 장내바이러스를 분석하여 앞으로의 역학조사의 지표 자료 및 백신 개발의 기초 자료를 제공하기 위하여 그 결과를 보고하고자 한다.
제안 방법
- 국립보건원으로부터 세포 배양을 위하여 분양 받은 RD (Rhabdomyosarcoma), HEp-2 (human epidennoid carcinoma), "Vfero (aftica green monkey kidney), BGM (Buffalo green monkey) 세포주는 penicillin (0.05 units/ml)/streptomycin (0.05 과 5% FBS (fetal bovine serum)가 첨가된 MEM (minimum essential medium, GibcoBRL) 배지로 배양하여 24 well 배양판에 분주하고 34℃, 5-7% 이산화탄소 항온기 내에서 단층배양시킨 후 2% FBS가 첨가된 MEM 배지를 1ml 첨가하여 전처리한 가검물을 lx, 10x, 100x로 희석하여 각각 100ul씩 접종하고 1~10일간 배양하면서 세포병변효과(cytopathic effect, CPE)를 관찰하였다.
- 분리된 바이러스를 연속적으로 2~3회 계대배양하여 역가를 높인 후 4% uranyl acetate에 1분간 negative stain한 다음", 전^4* 현미경(JEM 1200 EX2, JEOL, TEM)으로 80KV (xl20 K) 에서관찰하였다.
- 합성하였다. PCR 반응액 (cDNA template, dNTP mixture, 양 방향의 primer, 10x PCR buffer, Th이 polymerase)을 thermal cycler# 이용하여 증폭한 후 PCR 산물은 1.2% agarose gel에 전기영동한 후 ethidium bromide로 염색한 후 특정 band를 관찰하였다. 그리고 분리한 enteroviruses의 확인시험은 국립보건원에 의뢰하였다.
- 3과 같이 모두 크기가 30-35 nm로 아주 작고 envelope이 없는 icosaheadral 모양의 전형적인 picomaviridae의 특징을 나타내었다. 세포병변 효과가 나타난 세포배양액에 대하여 전술한 방법에 따라서 RNA를 추출한 후 cDNA를 합성하였다. 합성된 RNA-cDNA hybrid는 본 연구에 사용된 primer, 즉 EntlF와 EntR을 이용하여 PCR을 수행한 결과 Fig.
- 세포병변 효과가 나타난 세포배양액으로부터 Tri-reagent (Molecular Research Center, USA), viral RNA extraction kit (Qiagen, Hilden, Germany) 또는 DNA QIAamp blood mini kit (QiagenX 이용하여 RNA를 추출하고 이것을 각 바이러스 유전자를 증폭하기 위한 template로 이용하여 cDNA를 합성하였다. PCR 반응액 (cDNA template, dNTP mixture, 양 방향의 primer, 10x PCR buffer, Th이 polymerase)을 thermal cycler# 이용하여 증폭한 후 PCR 산물은 1.
- 환자로부터 채취된 대변가검물은 -2(rc에 냉동한 후 해동시켜서 장내바이러스용 PBS (NaCl 8.0g, KC1 0.2g, Na^PQ 1.15 g, KHPO4 0.2 g, 800 ml DDW, pH 7.0-7.4, MgCl2 . 6H2O 0.1 g in 100 ml, CaCl2 0.1g in 100 ml)에 10% 농도로 희석하여 10분간 강하게 진탕한 후 원심분리(VS-15CFN, 한스텍, 500 xg, 20 분)하여 상등액을 6-7 ml 회수하였다. 이 상등액에 1/10 분량의클로로포름을 첨가하고 10분간 혼합한 후 원심분리하여 상등액을 회수하고 검체를 lx, 10x, 100x로 희석하여 사용하였다.
대상 데이터
- 2000년~2002년 사이 부산지역의 병 . 의원으로부터 의뢰된 바이러스성 뇌수막염 환자로 의심되는 환자의 가검물을 대상으로 바이러스 분리를 시도한 결과 2000년에는 검체 292건 중 2건, 20()1년에는 3기건 중 4건, 2002년에는 703건 중 83건이 장내바이러스를 분리하였으므로 전년도에 비해 점차 증가 추세를 나타내었다(Table 2).
- 바이러스 분리용 검체는 2000~2002년 사이 부산지역의 10개 지정병원으로부터 내원한 의심환자의 대변, 뇌척수액, 인후 가검물 등을 채취하여 사용하였으며, 2000년에는 검체가 292건, 2001년은 3기건, 2002년에는 703건이었고 채취된 시료는 수송용 용기에 넣어 냉장온도를 유지하면서 신속하게 운반하여 사용하였다.
성능/효과
- 이처럼 월별 발생 양상이 연속적이지 못하므로 바이러스성 뇌막염의 유행현황 파악은 매년 지속적으로 이루어져야 할 것으로 사료된다. 세포병변 효과를 관찰하기 위해서 RD, HEp-2, Vero 및 BGM 세포주에 분리된 바이러스를 접종한 결과 Fig. 1과 2에서와 같이 echovirus와 coxsackievirus는 Vfero와 HEp-2 세포주에서 강한 병변 효과를 나타내었다. 전자현미경으로 촬영한 echovirus 및 coxsackievirus의 형태학적 양상은 Fig.
- 4오+ 같이 echovirus 및 coxsackievirus 모두 436bp 의장 내 바이러스 특이 band를 확인할 수 있었다. 음성대조로 증류수를 동일한 방법으로 PCR을 실시한 결과 오염이 의심되는 특이한 DNA band는 확인되지 않았다. 이러한 결과는 1993년부터 1996년까지 국내에서 분리된 5종의 장내바이러스(coxsackievirus Bl, echovirus 3, 7, 9, 10)⑼와 일치하였으며, serotype은 국립보건원 소화기계 바이러스과에 의뢰하여 확인 동정하였다.
- 2000년~2002년 사이 부산지역의 병 . 의원으로부터 의뢰된 바이러스성 뇌수막염 환자로 의심되는 환자의 가검물을 대상으로 바이러스 분리를 시도한 결과 2000년에는 검체 292건 중 2건, 20()1년에는 3기건 중 4건, 2002년에는 703건 중 83건이 장내바이러스를 분리하였으므로 전년도에 비해 점차 증가 추세를 나타내었다(Table 2). 우리나라에서는 바이러스성 뇌수막염에 대한 관심이 그리 높지 않았지만 1990년 많은 환자들이 발생한 이후 1993년, 1996년, 1997년에 전국적인 대유행이 일어났다(3).
- 1과 2에서와 같이 echovirus와 coxsackievirus는 Vfero와 HEp-2 세포주에서 강한 병변 효과를 나타내었다. 전자현미경으로 촬영한 echovirus 및 coxsackievirus의 형태학적 양상은 Fig. 3과 같이 모두 크기가 30-35 nm로 아주 작고 envelope이 없는 icosaheadral 모양의 전형적인 picomaviridae의 특징을 나타내었다. 세포병변 효과가 나타난 세포배양액에 대하여 전술한 방법에 따라서 RNA를 추출한 후 cDNA를 합성하였다.
- 세포병변 효과가 나타난 세포배양액에 대하여 전술한 방법에 따라서 RNA를 추출한 후 cDNA를 합성하였다. 합성된 RNA-cDNA hybrid는 본 연구에 사용된 primer, 즉 EntlF와 EntR을 이용하여 PCR을 수행한 결과 Fig. 4오+ 같이 echovirus 및 coxsackievirus 모두 436bp 의장 내 바이러스 특이 band를 확인할 수 있었다. 음성대조로 증류수를 동일한 방법으로 PCR을 실시한 결과 오염이 의심되는 특이한 DNA band는 확인되지 않았다.
후속연구
- 신속한 바이러스의 분리 동정은 항생제 남용의 감소, 불필요한 검사의 감소 등 보건적 차원에서도 효과적이며, 또한 장내바이러스에 의해 일어나는 질환을 인식하고 유행 추세에 대해 보다 적극적이고 연속적인 역학적 조사 및 연구의 활성화가 필요하다. 본 연구의 경우 부산지역만의 연구결과이므로 전국적인 분포에 따른 다양한 혈청형이나 분리율에 대한 비교가 부족하다고 사료되므로, 이후 전국규모의 분포에 대한 연구 결과가 기대되며 또한 예방 차원에서 지속적인 관심이 필요할 것이라사료된다.
- 이러한 유전자 기법에 의한 진단은 민감도가 높아서 임상적으로 많은 도움이 되지만 경비가 비싸고 진단 방법의 기술적인 면 등을 고려해 볼 때 대중화는 아직 시간이 걸릴 것이다(2). 신속한 바이러스의 분리 동정은 항생제 남용의 감소, 불필요한 검사의 감소 등 보건적 차원에서도 효과적이며, 또한 장내바이러스에 의해 일어나는 질환을 인식하고 유행 추세에 대해 보다 적극적이고 연속적인 역학적 조사 및 연구의 활성화가 필요하다. 본 연구의 경우 부산지역만의 연구결과이므로 전국적인 분포에 따른 다양한 혈청형이나 분리율에 대한 비교가 부족하다고 사료되므로, 이후 전국규모의 분포에 대한 연구 결과가 기대되며 또한 예방 차원에서 지속적인 관심이 필요할 것이라사료된다.
- 바이러스에 의한 월별 발생 시기는 하계절(7, 8, 9월) 이 주 발생시기이지만(4), 2000년의 경우 동절기인 12월과 1월에, 2001년에는 5월에 집중적으로 발생하였으므로 다소 차이를 나타내었으나, 2002년의 경우 4월부터 11월까지 넓은 발생 분포를 나타내면서 특히 6월과 7월에 가장 발생율이 높아 1993년도와 1996년도에 발생한 대유행과 비슷한 양상을 나타내었다(3). 이처럼 월별 발생 양상이 연속적이지 못하므로 바이러스성 뇌막염의 유행현황 파악은 매년 지속적으로 이루어져야 할 것으로 사료된다. 세포병변 효과를 관찰하기 위해서 RD, HEp-2, Vero 및 BGM 세포주에 분리된 바이러스를 접종한 결과 Fig.
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