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문제 정의
- 따라서 본 연구에서는 LC/MS-ESI (전기 분무 이온화) 방법과 LC/MS-APCI (대기압 화학 이온화)방법의 두 가지 이온화 방식을 사용한 LC/MS/MS 기법을 사용하여 sildenafil, homosildenafil, vardenafil 그리고 tadalafil을신속하게 낮은 농도까지 분석할 수 있는 조건을 확립하고자 하였다.
제안 방법
- APCI와 ESI 방법에서 얻은 product ion들을 MRM 모드에 사용하여 정량에 응용하도록 하였다. APCI 방법에서는 sildenafile 475->100, 475, homosildenafile 489->114, 489, vardenafil 은 489->114, 489 그리고 tadalafile 390->135, 268을 MRM 모드의 파라미터로 설정하였다.
- HPLC 분석 조건에 사용된 컬럼은 YMC사 (Kyoto, Japan) C, 8 컬럼이며 ESI 에서는 15 cm (length)x2.0 mm (i.d.)><5 ^(particle size)를 사용하였으며, APCI에서는 15 cm (length)x4.6 mm (i.d.)x5 im (particle size)를 사용하였고 용매는 APCI와 ESI 방법 모두 아세토니트릴(용매 A)과 10 tnM ammonium formate 용액 (pH 4.8) (용매 B)을 사용하여 70 (A) : 30 (B)의 비율로 등 용매 용리 조건으로 30분동안에 분리하였으며 운반 유량은 APCI 방법에서는 I tnL/min이었으며 ESI 방법에서는 0.2 mL/min이었다.
- LC/MS/MS를 이용한 sildenafil, homosildenafil, vardenafil 및 tadalafil 분석 조건을 확립하였다. APCI와 ESI 방법을 비교 분석한 결과 화합물의 구조를 확인하기에 유용한 fragment ion을 보기 위해서는 APCI 방법이 좋은 방법이었지만 검출한계가 높아서 정량 분석에는 적합하지 않았다.
- 25 ㎍/mL이었다. Scan 모드의 경우 검출한계는 sildenafile 2.5 /ig/mL, homosi-Idenafile 1.0 ㎍/mL, vardenafile 1.0 ㎍/mL 그리고 tadalafil은 50 #g/mL이었으며, MRM 모드의 검출한계와 비교한 결과는 Table 3에 요약하였다 ESI 방법에서 swan과 MRM 모드를 비교한 크로마토그램은 Fig. 8과 같으며 sildenafil 및 그 유사체의 분석에 있어서, MRM 모드를 사용하면 scan 모드에 비해 25-200배의 감도 증가를 얻을 수 있으므로 MRM 모드를 사용하도록 하였다.
- 만들어 사용하였다. Sildenafil, homosildenafil 및 vardenafile 메탄올 용액에 만들어진 20 ㎍/mL의 표준용액을 0.01, 0.025, 0.05, 0.1, 0.25, 0.5, 1.0, 2.5 의 농도로 희석하여 조제하였으며, tadalafile 100 ㎍/mL의 표준 용액을 Q25, 0.5, 1.0, 2.5, 5, 10 ㎍/mL의 농도로 희석하여 만들어서 LC/MS/MS로 분석하였다. 각 검정용액의 표준 물질에 대한 피크 면적과 농도와의 관계를 표시하는 외부 표준 검정 곡선을 작성하였다.
- 5, 5, 10 ㎍/mL의 농도로 희석하여 만들어서 LC/MS/MS로 분석하였다. 각 검정용액의 표준 물질에 대한 피크 면적과 농도와의 관계를 표시하는 외부 표준 검정 곡선을 작성하였다.
- 이때 이동상의 조성으로 용매 A는 10mM ammonium formate 용액을 사용하였고 용매 B는 아세토니트릴을 사용했으며 A:B=80:20으로 하였을 때 sildenafil, homosildenafil 그리고 vardenafil의 머무름 시간이 10분 이내로 검출되었지만, 피이크 넓어짐 현상이 심하고 tadalafil의 경우 용출 시간이 길어져 동시 분석에 적합하지 않았다. 따라서 이동상의 비율을 A:B=70:30의 등용매 용리 조건으로 하였을 때 sildenafil 은 10.01 분, homosildenafile 1Q83분, vardenafile 8.34 분, 그리고 tadalafile 25.09분으로 모든 성분의 분석 시간이 30분 이내에 검출 (Fig. 2)이 가능하였으므로 HTLC는 모두 이 조건을 사용하였고 이온화 방법에 따라서 단지 유량의 차이만 존재하도록 하였다.
- 순수한 표준 물질 즉 sildenafil, homosildenafil, vardenafil 그리고 tadalafil을 메탄올을 용매로 사용하여 1000 ㎍ /mL의 표준 원액이 되도록 표준 용액을 제조하였다. 실제 분석을 위해서는 이 표준 용액을 1차 표준 물질로 사용하였으며, 메탄올을 사용하여 희석함으로써 20 ㎍/mL가 되도록 작업 표준 용액을 조제하였다.
- 실제 분석을 위해서는 이 표준 용액을 1차 표준 물질로 사용하였으며, 메탄올을 사용하여 희석함으로써 20 ㎍/mL가 되도록 작업 표준 용액을 조제하였다. 작업 표준 용액은 분석에 앞서서 0.
- 위에서의 파라미터 변화를 통해서 설정된 조건을 텐 뎀 질량 분석기의 작동 모드 중의 하나인 multiple reaction monitoring (MRM) 모드에 적용하여 sildenafil 및 그 유사체들의 정량을 위한 검출한계 및 검정 곡선을 구하였다.
- 최적의 토막이온 생성 조건과 감도를 찾기 위하여 entrance는 -5-0 V, collision energy는 10-40 eV, exit는 0-5 V, corona는 1-7 /zA, cone voltage는 15-55 V, extractor는 0-5 V, RF lens는 3-4 V, cone gas는 50-150 L/hr, desolvation gas는 200-500 L/hr까지 변화 시켜주면서 화합물들의 감도와 product ion 생성 양상을 관찰하면서 최적의 조건을 설정하였다.
- 한편, ESI 방법에서는 sildenafile 475->475, homosildenafil 은 489->489, vardenafil 은 489->489 그리고 tadalafile 390->135, 268을 MRM 모드의 파라미터로 설정하였으며 MRM 모드에서의 검출한계는 sildenafile 0.10 ㎍/mL, homosildenafiler 0.025 ㎍/mL, vardenafiler 0.025 ㎍/mL 그리고 tadalafile 0.25 ㎍/mL이었다. Scan 모드의 경우 검출한계는 sildenafile 2.
- 한편, triple quadrupole 형태의 텐뎀 질량 분석기 (MS/MS) 작동 모드에는 product ion spectrum, parent ion spectrum, multiple reaction monitoring, constant neutral loss spectrum 등이 있는데 본 연구에서는 product ion spectrum 모드를 이용하여 특정 이온에 대한 토막 이온을 관찰한 후 이 생성이온들을 MRM 모드 파라미터로 사용하여 분석하였다.
대상 데이터
- 본 연구에서 사용한 표준물질인 sildenafil (69.4%), homosildemifil, vardenafil (99.8%), tadalafil (99.9%)은 식품의약품안전청에서 공급받았으며 시료를 여과하기 위하여 0.2 pmxl3 mm PTFE syringe filter (Whatman, UK) 를 사용하였다. 이동상 용매로 사용된 물과 아세토니트릴은 J.
- 2 pmxl3 mm PTFE syringe filter (Whatman, UK) 를 사용하였다. 이동상 용매로 사용된 물과 아세토니트릴은 J. T. Baker (HPLC grade, USA)에서 구입하였으며완충용액에 사용되는 ammonium formate(99.995+%)는 Aldrich사 (Missouri, USA), formic acid (99%)는 Sigma사* (Missouri, USA)에서 구입하였다.
이론/모형
- Agilent HP 1100 series liquid chromatograph/Micromass Quattro™mass spectrometer (Micromass, Manchester, UK) 를 사용하였으며 질량 분석기의 이온화 방식은 전기 분무 이온화 (electrospray ionization, ESI) 법과 대기압 화학 이온화 (atmospheric pressure chemical ionization, APCI) 법을 사용하였으며, 역상 HPLC system으로 화합물들을 분리하였다. HPLC 분석 조건에 사용된 컬럼은 YMC사 (Kyoto, Japan) C, 8 컬럼이며 ESI 에서는 15 cm (length)x2.
성능/효과
- 및 tadalafil 분석 조건을 확립하였다. APCI와 ESI 방법을 비교 분석한 결과 화합물의 구조를 확인하기에 유용한 fragment ion을 보기 위해서는 APCI 방법이 좋은 방법이었지만 검출한계가 높아서 정량 분석에는 적합하지 않았다. Product ion spectrum에서 precursor ion 을 제외한 다른 product ion들을 생성하지는 않았지만 감도가 좋고 직선성이 좋은 모드는 ESI 방법이었고 이는 정량 분석에 적합한 방법임을 알 수 있었다.
- APCI와 ESI 방법을 비교 분석한 결과 화합물의 구조를 확인하기에 유용한 fragment ion을 보기 위해서는 APCI 방법이 좋은 방법이었지만 검출한계가 높아서 정량 분석에는 적합하지 않았다. Product ion spectrum에서 precursor ion 을 제외한 다른 product ion들을 생성하지는 않았지만 감도가 좋고 직선성이 좋은 모드는 ESI 방법이었고 이는 정량 분석에 적합한 방법임을 알 수 있었다. 이 연구에서 확립된 방법은 sildenafil 및 유사체들의 확인 및 정량과 가짜 발기부전 치료제의 검출에 유용하게 이용될 수 있을 것이다.
- APCI 방법에서는 sildenafile 475->100, 475, homosildenafile 489->114, 489, vardenafil 은 489->114, 489 그리고 tadalafile 390->135, 268을 MRM 모드의 파라미터로 설정하였다. 그 결과 APCI 방법의 경우 MRM모드에서는 20 ㎍/mL에서도 거의 검출되지 않았다.
- 본 실험에서도 APCI와 ESI 방법에서 분자량이 474인 sildenafil의 경우에 nVz=475의 [M+H]가 기준 피이크로 검출되었고, homosildenafil, vardenafil 그리고 tadalafil의 경우에는 m/z=489, 489, 390에서 [M+H]+ 이온들이 기준 피이크 (base peak)로 검출되었다.
- 그림에서 보여진 바와 같이 RF lens 값이 증가함에 따라서 생성되는 product ion들의 갯수즉 토막이온들의 갯수와 서]기가 증가됨을 볼 수 있다. 생성된 product ion을 보면 sildenaRle m/z = 475에 대한 product km으로 m/z = 475, 99, 100, 283, 311이 재현성 있게 나타났으며, homosildenafile m/z = 489에 대한 product ion으로 m/z = 489, 114, 313이 재현성 있게 나타났다. Vardenafil 은 m/z = 489와 product ion으로 m/z = 489, 114, 151, 169, 312가 재현성있게 나타났다.
후속연구
- Product ion spectrum에서 precursor ion 을 제외한 다른 product ion들을 생성하지는 않았지만 감도가 좋고 직선성이 좋은 모드는 ESI 방법이었고 이는 정량 분석에 적합한 방법임을 알 수 있었다. 이 연구에서 확립된 방법은 sildenafil 및 유사체들의 확인 및 정량과 가짜 발기부전 치료제의 검출에 유용하게 이용될 수 있을 것이다.
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