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문제 정의
- 따라서, 본 연구에서는 유전체 연구에 필수적인 DNA 칩 제작을 위한 연구용 pin 타입 microarrayer를 개발하는데 목적을 두었으며, 그구체적인 목적은 다음과 같다.
- 외국의 경우 게놈 연구 및 바이오 산업에 DNA 칩을 제작할 수 있는 로봇 시스템을 싼 가격에 사용하고 있으나 우리나라의 경우 자동화 시스템을 비싼 가격에 외국에서 도입하여 사용하기 때문에 바이오 산업 및 연구 분야에서의 생산비를 높이게돼 국내외적으로 생명공학의 경쟁력을 저하시키는 원인이 된다. 따라서, 본 연구에서는 유전체 연구에 필수적인 DNA 칩 제작을 위한 연구용 pin 타입 microarrayer를 개발하였으며, 그 구체적인 연구결과는 다음과 같다.
- 본 실험에서는 DNA가 묻어있는 핀을 세척하고 건조하여 다음 DNA를 점착할 때 핀의 세척 및 건조시간을 설정하는 실험을 실시하였다. 핀에 묻어 있는 DNA를 세척하는 최소시간을 설정하고, 핀에 묻어있는 증류수를 건조하기 위한 최소 시간을 설정하였다.
- 본 연구에서는 silylated 슬라이드에 DNA를 고밀도로 접합시키기 위하여 3축 자유도의 직교좌표형 로봇을 설계, 제작하였다. X, Y축은 AC 서보모터와 1405 전조 볼 스크류 및 LM 가이드 등을 사용하였고, Z축은 VS DC모터 및 볼트 스크류, LM 가이드 등을 사용하여 DNA 점착 헤드가 상하 왕복운동을 할 수 있게 하였다.
- DNA 칩을 제작할 때 핀에 묻혀 한번 사용된 DNA는 다른 DNA를 묻히기 위해서 핀으로부터 제거돼야 한다. 이를 위해 본 연구에서는 핀에 증류수를 분사하며 진동 브러쉬로 DNA를 세척하는 장치를 개발하였다. 증류수를 분사하는 장치는 수중모터를 사용하였으며, 분사된 증류수가 핀을 세척하며 머무를 수 있도록 용기에 턱을 지게 제작하였다.
제안 방법
- 1. 본 연구에서는 DNA칩 제작을 위한 연구용 pin 타입 microarrayer를 개발하였으며 3축 직교좌표형 로봇 본체, DNA를 묻혀 silylated 슬라이드에 점착하는 DNA 점착 헤드, 칩 및 웰 플레이트 고정부, 핀을 세척 및 건조하는 세척 및 건조장치 등으로 시스템을 구성하였다.
- 2. DNA 점착 헤드는 DNA 점착시 제도용 펜촉을 사용하도록 설계, 제작하였으며, 슬라이드에 DNA를 점착할 때는 핀이 일정한 힘으로 슬라이드를 누르며 점착할 수 있도록 자석의 반발력을 이용하였다.
- 본 연구에서는 웰 플레이트와 silylated 슬라이드를 고정할 수 있도록 칩 및 웰 플레이트 고정부를 제작하였다. 96/384 웰 플레이트 2개와 슬라이드 12개를 고정할 수 있도록 300×300×15mm 두랄루 민판을 가공하여 로봇 본체에 부착하였으며 웰 플레이트를 가로로 2개 배열하고 4×3으로 12개의 silylated 슬라이드를 배열할 수 있도록 하였다. 그림 6에 칩 및 웰 플레이트 고정부를 나타내었다.
- 본 연구에서는 silylated 슬라이드에 DNA를 고밀도로 접합시키기 위하여 3축 자유도의 직교좌표형 로봇을 설계, 제작하였다. X, Y축은 AC 서보모터와 1405 전조 볼 스크류 및 LM 가이드 등을 사용하였고, Z축은 VS DC모터 및 볼트 스크류, LM 가이드 등을 사용하여 DNA 점착 헤드가 상하 왕복운동을 할 수 있게 하였다. 그림 2는 설계, 제작된 3축 직교좌표형 로봇 본체를, 그림 3에는 로봇 시스템의 콘트롤러를 나타내었고, 표 1에 로봇 시스템 및 제어장치의 제원을 나타내었다.
- 형광검사 방법으로는, 5μM의 SYTO 61 농축액을 10mM의 Tris-HCl pH 7과 1mM EDTA의 혼합액(TE)으로 1 : 100 희석시킨 dye(염색약)에 DNA가 점착되어 있는 슬라이드를 상온에서 5분간 담그어 놓은후 꺼내어 슬라이드를 다시 TE로 1회 씻는다. 그 다음 3차 증류수와 에탄올을 1회씩 차례로 이용하여 씻은 후 슬라이드를 완전히 건조시키고 532nm 파장의 Laser scanner로 읽어들였다.7) 형광검사에 사용된 microarray 레이져 스케너 로는 Axon Instruments社의 GenePix 4000B를 사용하였다.
- 02mm 이하가 되어야 한다. 따라서 본 연구에서는 위치 정밀도의 허용 오차범위를 0.02mm로 설정하였다.
- aldehyde가 코팅된 슬라이드에 DNA 시료를 머금은 핀을 접촉할 경우 DNA가 슬라이드에 빨려나가는 현상이 발생한다. 따라서 우선 DNA를 묻히는 과정에서 웰 플레이트에 있는 DNA에 핀을 담그고 있는 시간을 설정하고 silylated 슬라이드에 DNA를 점착할 때 핀과 슬라이드가 접촉하고 있는 시간을 설정하여 점착된 DNA 시료의 크기를 결정하는 실험을 실시하였다.
- 메인 창에는 DNA 점착 간격에 따라 필요로 하는 웰 플레이트의 개수를 파악할 수 있도록 하였으며, 1개의 웰 플레이트의 DNA를 전부 점착하였을 경우 메시지를 출력하여 웰 플레이트를 교환할 수 있도록 하였다. 그림 8에 로봇 시스템의 구동 및 제어 프로그램의 흐름도를 나타낸 것이다.
- 본 연구에서 개발된 DNA 칩 제작을 위한 microarrayer 제어 프로그램은 Microsoft社의 Visual Basic 6.0 프로그램 언어를 사용하여 개발되었다.
- 본 연구에서 개발된 로봇 시스템으로 정해진 작업을 수행하기 위해서는 위치 정밀도 오차가 최대 허용오차범위 내에 있어야 한다. 본 로봇 시스템으로 DNA 칩을 제작할 때 DNA 스팟 크기는 0.
- 본 연구에서 개발한 로봇 시스템의 성능을 실험하기 위해서 핀을 이용한 DNA 점착 성능을 검정하였다. aldehyde가 코팅된 슬라이드에 DNA 시료를 머금은 핀을 접촉할 경우 DNA가 슬라이드에 빨려나가는 현상이 발생한다.
- 본 연구에서는 시스템의 초기화 없이 가로 세로 100mm의 정방형 가상 공간을 움직여 10회, 20회, 30회씩 CW, CCW 방향으로 회전하며 왕복하는 실험을 하였고, 그때의 위치 정밀도를 X, Y축 방향에서 측정하였다. 반복 정밀도 측정을 위한 실험장치로는 1㎛까지 측정할 수 있는 Anritsu社(Japan)社에서 제작한 모델명이 KL135A인 레이저 변위 센서를 사용하였다.
- 본 연구에서는 웰 플레이트와 silylated 슬라이드를 고정할 수 있도록 칩 및 웰 플레이트 고정부를 제작하였다. 96/384 웰 플레이트 2개와 슬라이드 12개를 고정할 수 있도록 300×300×15mm 두랄루 민판을 가공하여 로봇 본체에 부착하였으며 웰 플레이트를 가로로 2개 배열하고 4×3으로 12개의 silylated 슬라이드를 배열할 수 있도록 하였다.
- 먼저 시스템을 초기화하여 원점을 잡은 후 핀부분을 세척 및 건조시킨다. 세척시에는 증류수를 분사시키며 진동 브러쉬로 핀부를 세척하는데, 이때 핀부를 미리 설정해 놓은 속도로 왕복 이동시키며 브러쉬에 의해 DNA가 세척될 수 있도록 하였다. 증류수가 묻어있는 핀부를 건조시키기 위해서 건조시스템에서 압축공기를 미리 설정해 놓은 시간동안 핀부에 분사함으로써 핀부를 건조시킨다.
- 핀 건조장치는 장치 위부분에 구멍을 내어 핀이 입출할 수 있도록 하고, 측면에서 들어오는 콤프레셔에 의한 압축공기를 일정시간 핀에 분사하여 DNA를 씻고 핀에 묻은 증류수를 제거할 수 있게 하였다. 압축공기는 오일필터, 워터필터, 에어 드라이어에 의해 여과되도록 하였다. 그림 7에 핀 세척 및 건조장치를 나타내었다.
- 웰 플레이트의 고정은 웰 플레이트 밑면과 측면의 경계가 고정부에 파 놓은 홈에 밀착되어 고정되는 방법을 사용하였고, 슬라이드의 고정은 슬라이드를 위치시킬 때 슬라이드가 놓여지는 양단 끝에 고무를 삽입시켜 고무의 조임에 의해 슬라이드가 고정되도록 설계, 제작하였다.
- 5mm의 자석을 핀 홀더 위의 자석의 윗 극성과 같은 극성이 밑으로 행하게 삽입한 후 쿠션과 윗 덮개판을 차례로 올려놓고 결합시켜 자석의 이탈을 방지하였다. 이렇게 조립된 DNA 점착 헤드의 윗 부분을 핀 지그에 장착하여 DNA를 점착할 때 자석의 반발력에 의해 일정한 하중을 가할 수 있도록 하였다.
-
5mm의 DNA 칩을 제작하였다. 정확한 간격을 이루며 DNA를 점착 하는지를 살펴보았고,
형광검사를 통해 슬라이드에 DNA가 잘 점착되는 지와 동일한 12개의 칩을 제작하여 12개의 칩이 동일한가를 검사함으로써 본 연구에서 개발된 microarrayer의 성능을 검증하였다. - 이를 위해 본 연구에서는 핀에 증류수를 분사하며 진동 브러쉬로 DNA를 세척하는 장치를 개발하였다. 증류수를 분사하는 장치는 수중모터를 사용하였으며, 분사된 증류수가 핀을 세척하며 머무를 수 있도록 용기에 턱을 지게 제작하였다. 진동 브러쉬는 직경 10mm의 회전판에 상방향으로 섬모가 박혀 있는 형태이며 모터에 연결되어 CW, CCW 방향으로 45°씩 왕복 회전하도록 되어있으며, 이때 핀을 브러쉬 위로 지나가게 하여 브러쉬에 의해 세척될 수 있도록 하였다.
- 칩을 제작하는데 소요되는 시간은 시스템 원점에서 이동시작, 핀 세척 및 건조, 웰 플레이트에서의 DNA 묻힘, 12개의 칩에 DNA 점착 등의 일련의 과정을 2분 50초 동안 수행하였다. 최소 점 간격 0.
- 프로그램 내에서 96 및 384 웰 플레이트를 선택할 수 있도록 하였으며, DNA 점착 간격 및 시스템 속도, 세척시간, 건조시간 등의 파라메터를 설정할 수 있도록 하였다.
- 핀 건조의 경우는 8.5kgf/㎠의 압축공기를 직경 6mm의 호스를 통하여 분사시켜 핀이 완전히 건조하는 시간을 설정하였다. 그림 9에 핀 세척 및 건조실험을 하고 있는 모습을 나타내었다.
- DNA 점착 헤드는 시료에 녹아있는 DNA를 핀에 묻혀 silylated 슬라이드에 점착하기 위한 장치로윗 덮개부, 윗 자석 받침대, 자석, 핀 지그, 핀부로 구성되어 있다. 핀부에 DNA 시료를 묻힌 후 silylated 슬라이드에 DNA를 점착할 때 일정한 힘으로 핀부를 누를 수 있도록 자석을 사용하였고 silylated 슬라이드에 DNA를 점착할 수 있는 핀으로 제도용 펜촉을 사용하였다. 이 핀은 끝이 두 부분으로 갈라져 있어 DNA가 녹아있는 시료를 머금고 있기에 알맞고 재질은 스프링강이다.
- 본 실험에서는 DNA가 묻어있는 핀을 세척하고 건조하여 다음 DNA를 점착할 때 핀의 세척 및 건조시간을 설정하는 실험을 실시하였다. 핀에 묻어 있는 DNA를 세척하는 최소시간을 설정하고, 핀에 묻어있는 증류수를 건조하기 위한 최소 시간을 설정하였다. 세척시간은 핀이 진동 브러쉬를 통과하는 속도를 달리하여 핀과 브러쉬가 접촉하고 있는 시간을 조절하였다.
- 형광검사 방법으로는, 5μM의 SYTO 61 농축액을 10mM의 Tris-HCl pH 7과 1mM EDTA의 혼합액(TE)으로 1 : 100 희석시킨 dye(염색약)에 DNA가 점착되어 있는 슬라이드를 상온에서 5분간 담그어 놓은후 꺼내어 슬라이드를 다시 TE로 1회 씻는다. 그 다음 3차 증류수와 에탄올을 1회씩 차례로 이용하여 씻은 후 슬라이드를 완전히 건조시키고 532nm 파장의 Laser scanner로 읽어들였다.
대상 데이터
- 그 다음 3차 증류수와 에탄올을 1회씩 차례로 이용하여 씻은 후 슬라이드를 완전히 건조시키고 532nm 파장의 Laser scanner로 읽어들였다.7) 형광검사에 사용된 microarray 레이져 스케너 로는 Axon Instruments社의 GenePix 4000B를 사용하였다.
- 본 연구에서 로봇 시스템의 성능실험에 사용된 DNA 시료는 지부계 배추의 잎에서 추출한 DNA로 cDNA library를 제작하여 그중 한 크론의 plasmid DNA를 추출해서 사용하였다. DNA 칩용 슬라이드는 aldehyde가 코팅된 76×25mm 크기의 silylated 슬라이드를 사용하였다. 그림 1에 DNA 시료 및 silylated 슬라이드를 나타내었다.
- 본 연구에서는 시스템의 초기화 없이 가로 세로 100mm의 정방형 가상 공간을 움직여 10회, 20회, 30회씩 CW, CCW 방향으로 회전하며 왕복하는 실험을 하였고, 그때의 위치 정밀도를 X, Y축 방향에서 측정하였다. 반복 정밀도 측정을 위한 실험장치로는 1㎛까지 측정할 수 있는 Anritsu社(Japan)社에서 제작한 모델명이 KL135A인 레이저 변위 센서를 사용하였다.
- 본 연구에서 로봇 시스템의 성능실험에 사용된 DNA 시료는 지부계 배추의 잎에서 추출한 DNA로 cDNA library를 제작하여 그중 한 크론의 plasmid DNA를 추출해서 사용하였다. DNA 칩용 슬라이드는 aldehyde가 코팅된 76×25mm 크기의 silylated 슬라이드를 사용하였다.
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본 연구에서 연구, 개발된 DNA 칩 제작을 위한 microarrayer의 성능실험을 실시하기 위하여 DNA점 간격 0.5mm의 DNA 칩을 제작하였다. 정확한 간격을 이루며 DNA를 점착 하는지를 살펴보았고,
성능/효과
- 3. DNA 점착 헤드 핀의 세척을 위하여 증류수 분사 및 진동 브러쉬를 이용하였으며 세척실험 결과, 핀을 1mm/s로 이동시키며 브러쉬를 통과하도록 하는 방법이 세척효과가 높은 것으로 나타났으며, 핀 건조실험결과는 8.5kgf/㎠의 압축공기를 30초 동안 핀에 분사하였을 때 핀이 건조되는 것으로 나타났다.
- 4. 본 로봇 시스템을 이용하여 DNA를 12장의 슬라이드에 모두 점착시키기 위하여 웰 플레이트에서 핀이 DNA를 묻히는 실험을 실시한 결과, 10초 이상 핀에 DNA를 묻혔을 때 슬라이드 12장을 모두 찍는 것으로 나타났으며, 슬라이드에 핀이 1초간 접촉할 때의 DNA 스팟의 크기는 평균 280㎛가 되는 것으로 나타났다. 최소 점 간격을 0.
- 5. 본 로봇 시스템은 12장의 동일 DNA 칩을 생성하기 위해 핀의 세척, 건조, DNA를 묻히는 과정 및 DNA 점착 등의 한 과정을 2분 50초 동안 수행할 수 있는 것으로 나타났다.
- DNA를 핀에서 씻기기 위한 최소 세척시간은 1mm/s로 핀부를 이동할 때, 즉 핀과 브러쉬와의 접촉시간이 10초 이상일 때 cy3, cy5가 섞이지 않아 이때를 최소 세척시간으로 설정하였고, 8.5kgf /㎠의 압축공기를 30초 이상 분사하였을 때 본 시스템에서 핀이 건조되는 것으로 나타났다. 그림 13 및 표 4에 핀 세척 및 건조시간 설정결과를 나타내었다.
- aldehyde로 표면처리한 silylated 슬라이드에 DNA를 머금은 핀을 접촉하는 시간을 달리하며 접촉시켜 점착된 DNA의 크기를 조사해본 결과 1sec로 설정했을 때 크기가 가장 일정하게 DNA를 점착하였다.
- 이는 모세관 현상에 의한 핀에 DNA가 빨려 올라가는 현상을 의미하며 시간에 따라 그 양이 결정된다. 따라서 DNA 크기가 가장 일정하게 찍혔던 슬라이드와 핀과의 접촉시간을 1sec로 설정한 후 웰 플레이트에서 DNA를 묻히는 시간을 달리 하였을 때 점의 크기가 변하지 않게 점착할 수 있는 최대 슬라이드 수를 조사한 결과 웰 플레이트에서 DNA를 묻히는 시간은 최소 10sec 이상은 되어야 한다는 결과가 나타났다.
- 결과를 살펴보면 각 측정위치에서의 반복에 의한 편차는 전 구간에서 14㎛ 이내로 나타났다. 반복횟수에 상관없이 오차가 고르게 나타났으며, 이 오차는 인접 DNA 스팟과의 겹침 최소 간격 20㎛보다 작은 수치이므로 본 로봇 시스템은 목표한 작업을 수행하는데 적절하다고 사료된다.
- 본 로봇 시스템을 이용하여 DNA를 12장의 슬라이드에 모두 점착시키기 위하여 웰 플레이트에서 핀이 DNA를 묻히는 실험을 실시한 결과, 10초 이상 핀에 DNA를 묻혔을 때 슬라이드 12장을 모두 찍는 것으로 나타났으며, 슬라이드에 핀이 1초간 접촉할 때의 DNA 스팟의 크기는 평균 280㎛가 되는 것으로 나타났다. 최소 점 간격을 0.32mm로 설정한 후 DNA를 점착해 본 결과 최대 8,100여 점의 DNA 스팟을 한 슬라이드에 점착할 수 있는 것으로 나타났다.
- 칩 제작결과를 그림 15에 나타내었다. 칩 제작실험결과 12개의 동일한 칩이 생성되었으며, 제작된 칩을 형광검사를 통해 DNA가 칩에 잘 점착되는 지를 검사해본 결과 DNA 점착성능이 우수한 것으로 나타났으나, 점착된 DNA 형상의 원형도를 계산한 결과 평균 91%의 원형도를 나타내었다.
- 핀부를 지탱해주는 핀 지그는 6개의 핀부를 9mm 간격으로 2행 3열을 이루도록 직경 3.1mm의 구멍을 뚫어 핀 홀더가 상하운동을 할 수 있도록 하였으며, 구멍 위 끝은 핀 홀더의 가이드캡이 운동할 수 있도록 타원형상의 구멍으로 형성하여 DNA 점착시 핀부가 회전하는 것을 방지하였다.
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