치주질환이 없는 청년의 치은연상 및 치은연하 치면세균막에 존재하는 치주질환 관련 4종 세균의 분포 비교 Comparison of the prevalence of 4 periodontopathogens in supra-and subgingival plaque of young adults without periodontitis원문보기
The purpose of this study was to investigate and compare the frequence of 4 periodontal pathogens in the supra- and subgingival plaque in periodontally healthy subjects. Twenty adult individuals aged 22 to 28 years (mean age 23.65 years) participated in this study. All subjects had no pocket sites m...
The purpose of this study was to investigate and compare the frequence of 4 periodontal pathogens in the supra- and subgingival plaque in periodontally healthy subjects. Twenty adult individuals aged 22 to 28 years (mean age 23.65 years) participated in this study. All subjects had no pocket sites more than 3 mm deep, and the sites selected for sampling were all negative for bleeding. After drying and isolation of the sites with cotton rolls, supragingival plaque was sampled using sterile periodontal curette. Each plaque sample was placed in individual tubes containing 500 ml of 1X PBS. After removal of the supragingival sample and any remaining supragingival plaque, subgingival plaque samples were taken from the same sites using sterile curette and placed in similar individual tubes. Identification of 4 putative periodontal pathogens from the samples was performed by polymerase chain reaction based on 16S rDNA. Chi-square test was employed to identify significant explanatory variables for the presence of the 4 periodontal pathogens. The data show that Actinobacillus actinmycetemcomitans, Porphyromonanas gingivalis, Bacteroides forsythus, and Fusobacterium nucleatum occurred in 16.9%, 14.4%, 52.5%, and 80.6%, respectively. No significant differences were noted in the periodontal pathogens between supra- and subgingival plaques according to the kind of teeth. However, the incisors were at higher risk for harboring F. nucleatum (p <0.05). Conclusion: These results reveal that anaerobic periodontal pathogens can be detected in supragingival plaques. Supragingival plaque may function as a reservoir of peri-odotopathogens.
The purpose of this study was to investigate and compare the frequence of 4 periodontal pathogens in the supra- and subgingival plaque in periodontally healthy subjects. Twenty adult individuals aged 22 to 28 years (mean age 23.65 years) participated in this study. All subjects had no pocket sites more than 3 mm deep, and the sites selected for sampling were all negative for bleeding. After drying and isolation of the sites with cotton rolls, supragingival plaque was sampled using sterile periodontal curette. Each plaque sample was placed in individual tubes containing 500 ml of 1X PBS. After removal of the supragingival sample and any remaining supragingival plaque, subgingival plaque samples were taken from the same sites using sterile curette and placed in similar individual tubes. Identification of 4 putative periodontal pathogens from the samples was performed by polymerase chain reaction based on 16S rDNA. Chi-square test was employed to identify significant explanatory variables for the presence of the 4 periodontal pathogens. The data show that Actinobacillus actinmycetemcomitans, Porphyromonanas gingivalis, Bacteroides forsythus, and Fusobacterium nucleatum occurred in 16.9%, 14.4%, 52.5%, and 80.6%, respectively. No significant differences were noted in the periodontal pathogens between supra- and subgingival plaques according to the kind of teeth. However, the incisors were at higher risk for harboring F. nucleatum (p <0.05). Conclusion: These results reveal that anaerobic periodontal pathogens can be detected in supragingival plaques. Supragingival plaque may function as a reservoir of peri-odotopathogens.
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문제 정의
그러므로, 본 연구에서는 치주질환을 가지고 있지않는 청년을 대상으로 치은 연상 및 치은 연하 치면 세균막에 존재하는 치주질환 관련 병원성 세균 중 치주질환과 밀접한 상관관계가 있다고 보고 한 4 actinomycetemcomitans, P. gingivalis, B, forsythus 와 중증도의 상관관계가 있다고 보고 한 F. nuclea- tum등 4종 병원성 세균의 존재 유무를 중합 효소 연쇄 반응법을 이용하여 알아보고, 이를 바탕으로 치주질환에 이환된 확률이 높은 군과 낮은 군을 예측할 수 있는 모델을 정립하는데 이용하고자 한다.
본 연구는 치주치료를 받은 경험이 없는 건강한 남녀 20명의 상하악 제1대구치와 중절치에서 각각 치은연상 치면세균막과 치은연하 치면세균막을 채취하여 총 160개의 표본을 대상으로 치주질환의 대표적인 병원균인 A. actinomycetemcomitans, P. gingi-valis, B. forsythus, F. nudeatum$] 정상 치주조직 에서의 발현을 연구하고자 동시다발적으로 검출할 수 있는 nested PCR 방법을 이용하였다.
제안 방법
PCR의 반응조건은 다음과 같다. 95℃에서 1분간 denaturaion, 55℃ 에서 30초간 annealing, 72℃ 에서 30초간 extension하는 과정을 30회 반복하였고, 95℃ 에서 2분간 predenaturation, 72℃ 에서 10분간 pos-textension을 실시하였다.
Nested PCR의 반응조건은 다음과 같다. A actino- niycetemconiitanst: 확인하기 위해 94P 에서 1분간 denaturation, 55P 에서 1분간 annealing, 72P 에서 1 분간 extension의 과정을 36회 반복시행하였고, P. gingivalis와 B. Rxsythus를 확인하기 위해 95tJ 에서 30초간 denaturation, 60P 에서 1분간 annealing, 72 에서 1분간 extension 과정을 36회 반복 시행하였다. 또한 E n니deamm을 확인하기 위해 94P 에서 1 분간 denaturion, 65P 에서 3。초간 annealing, 72, 0 에서 45초간 extensiori의 과정올 30회 반복 시행하였다.
남아있는 치은연상 치면세균막을 제거한 후에 같은 부위에서 다른 멸균된 치주과용 큐렛으로 치은연하치면세균막을 채취하여 또 다른 500 ml의 IX PBS 용액에 담았다. Komiya등0의 Direct DNA extraction method를 이용하여, 채취한 표본을 2X LSE buffer(2 mM EDTA, 1% Triton X-100) 용액 100ml에넣고 95P 이상에서 15분간 가열하여 세균 DNAS 추출하였다.
Nested PCR 산물을 ethidium bromide가 첨가된 1.5% 아가로스 젤에서 100 V로 25분간 전기영동을 시행하고 UV transilluminator를 이용하여 각각의 band 위치를 확인하였다
PCR 산물을 1/100로 희석한 다음 A.actino-mycetemcomitans, P. gingivalis, B. forsythus 및 F. nucieatum등 4종의 세균에 대해 기존에 알려진 16S ribosomal RNA 종 특이 PCR 프라이 머 (Table 1)를 이용하여 치면세균막 내에 각각의 세균의 존재 유무를 알아보기 위해 nested PCR을 실시하였다12
65세였다. 대상 치아의 치주낭 깊이는 3 mm 이내로, William씨 치주낭 측정기를 이용하여 조직의 저항이 느껴질 때까지 치은변연에서 치주낭 최심부까지의 거리를 계측하고 가장 가까운 눈금을 읽어 탐침 시 치주낭 깊이로 기록하였다. 또한 L6e & Silliness(13) 치은지수(Gingival Index; GI)가 “0” 이고, 치면 세균막 지수(19)(Plaque index; PI)가 0-2, Ainam。와 Bay(1)의 치은 출혈지수(Gingival bleeding index; GBI) 측정 방법에 의해 출혈이 없는 경우만을 선별하였다.
면구와 압축공기를 이용하여 치아주위를 방습하고, 멸균된 치주과용 큐렛으로 치은연상 치면 세균막을 채취하여 500 ml의 IX PBS 용액에 담았다. 남아있는 치은연상 치면세균막을 제거한 후에 같은 부위에서 다른 멸균된 치주과용 큐렛으로 치은연하치면세균막을 채취하여 또 다른 500 ml의 IX PBS 용액에 담았다.
본 연구에서는 nested PCR법을 이용하여 치주 적으로 건강한 청년에서 치주질환과 관련된 병원성 세균 중 A actinomycetemcomitans, P. gingivalis, B. forsythus, F. nucleatum등 4종에 대한 치은연상과 치은연하 치면세균막에서의 분포를 동시다발적으로 분석하였고, 치아부위와 성별에 따른 차이를 분석하였다. 본 연구에서 A.
또한 E n니deamm을 확인하기 위해 94P 에서 1 분간 denaturion, 65P 에서 3。초간 annealing, 72, 0 에서 45초간 extensiori의 과정올 30회 반복 시행하였다. 위의 4종류 세균의 nested PCR에서 95P 에서 2 분간 predenaturion, 72P 에서 1아분간 postextension 을 시행하였다.
일차적으로 16S rRNA를 증폭하기 위하여 AccuPowei® Premix (Bioneer Corp., Seoul, Korea), 20 pmoles의 primers, 100 pg의 세균 genomic DNA 와 멸균 증류수로 20 闰의 PCR 혼합용액을 만들었다. PCR primer는 Uni-F(AGA GTT TGA TCC TGG CTC AG)와 Uni-R(GGT TAC CTT GTT ACG ACT T), PCR machine으로는 PTC-200 (MJ Research Inc.
Rxsythus를 확인하기 위해 95tJ 에서 30초간 denaturation, 60P 에서 1분간 annealing, 72 에서 1분간 extension 과정을 36회 반복 시행하였다. 또한 E n니deamm을 확인하기 위해 94P 에서 1 분간 denaturion, 65P 에서 3。초간 annealing, 72, 0 에서 45초간 extensiori의 과정올 30회 반복 시행하였다. 위의 4종류 세균의 nested PCR에서 95P 에서 2 분간 predenaturion, 72P 에서 1아분간 postextension 을 시행하였다.
대상 데이터
조사 대상자의 상하악 저n대구치와 중절치 치아에서 각각 치은연상 치면세균막과 치은연하 치면 세균막을 채취하여 총 160개의 표본을 대상으로 하였다.
조선대학교 치과대학에 재학 중인 학생들 중 최근 6개월 이내에 항생제를 복용한 경험이 없으며 치주치료를 받지 않았고, 치주질환이 없는 남녀 20명을 조사 대상으로 하였다{Table 1). 조사 대상자의 연령은 22세 이상 28세 미만이었고, 평균 연령은 23.
데이터처리
치아부위와 성별에 따른 치은연상 또는 치은연하치면세균막의 세균 분포를 C7]j-Square lests를 시행하여 분석하였다
성능/효과
반면에 본 연구에서는 4종의 치주병원균 모두 치은연상과 치은연하의 분포에서 통계학적으로 유의성 있는 차이는 없었으나, P. gingivalis와 A. actino- mycetemcomifans가 치은연하에서 더 높은 분포를 나타내었다. 본 연구의 성별에 따른 분포를 살펴보면 P.
nucleatum등 4종에 대한 치은연상과 치은연하 치면세균막에서의 분포를 동시다발적으로 분석하였고, 치아부위와 성별에 따른 차이를 분석하였다. 본 연구에서 A. actinomycetemcomitans 16.9%, P. gingivalis 14.4%, B. forsyt由us 52.5%, F. nucleatum 80.6% 로 관찰되었다(Table 4).
actino- mycetemcomifans가 치은연하에서 더 높은 분포를 나타내었다. 본 연구의 성별에 따른 분포를 살펴보면 P. gingivalise 여성에서 더 높은 분포를 보였고, 나머지 3종의 치주 병원균은 남자에서 더 높은 분포를 보였다.
성별에 따른 치면세균막 간의 세균 분포를 보면, 남녀 모두 치은연상과 치은연하의 차이는 없었으나, 전체적인 분포에 있어서 P. gingivalis는 여자에서 더 높게 나타났고, A. actinomycetemcomitans, B. forsythus, F. nucleatume 남자에서 더 높게 나타났다(p<Q01)(Table 3).
총 160개의 표본 중 A. actinomycetemcomitanse: 27개 (16.9%), P. gingivalis는 23개 (14.4%), B. /brsy出us는 84개(52.5%), F. nuc/eatume 129개 (80.6%) 표본에서 관찰되었다.
치아 부위에 따른 치면세균막 간의 세균 분포를 보면, 전치부와 구치부 모두 치은연상과 치은연하의 차이는 없었으나, 전체적인 분포에 있어서 F. nudea-tum이 전치부에서 더 유의성 있게 높게 나타났고(P <0.05), 다른 3종에서는유의성 있는 차이가 없었다.
치아 위치에 따른 치면세균믹■의 세균 분포에서 4 종 모두 치은연상과 치은연하 간의 유의 성은 없었다.
후속연구
사료된다. 또한 조사에 응하였던 학생들을 꾸준히 연차적으로 추적하여 초기 치주질환 병소가 생 겼을 때 정상일 때와 비교 분석하면 초기 치주질환에 깊이 관여하는 세균을 동정할 수 있을 것으로 생각되며, 중합효소연쇄반응에 사용한 프라이머의 특이성에 따른 문제점을 고려하여 앞으로 더 많은 사람을 대상으로 한 연구가 필요할 것으로 사료된다.
저자등은 본 연구를 통해 치주질환과 관련된 혐 기성 세균을 치은연하뿐만 아니라 치은연상 치면 세균막에서도 검출함으로서 치주질환이 없는 한국인 의치 면세균막 내 치주질환 관련 세균의 분포양상에 대한 기초 자료를 얻었으며, 치은연상 치면세균막의 세균 동정을 통해 치주질환의 초기 진단 및 예후 평가에 활용할 수 있고 치은연상 치면세균막을 제거함으로서 치주질환의 초기 치료 및 예방에 기여할 것으로 사료된다. 또한 조사에 응하였던 학생들을 꾸준히 연차적으로 추적하여 초기 치주질환 병소가 생 겼을 때 정상일 때와 비교 분석하면 초기 치주질환에 깊이 관여하는 세균을 동정할 수 있을 것으로 생각되며, 중합효소연쇄반응에 사용한 프라이머의 특이성에 따른 문제점을 고려하여 앞으로 더 많은 사람을 대상으로 한 연구가 필요할 것으로 사료된다.
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