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문제 정의
- 연구의 시작에는 다양한 근골격계 종양에서 발현되는 케모카인 유전자를 분석하여 각 종양의 발현 양상을 비교, 분석하려 하였다. 그러나, 제한적인 증례의 수집으로 인하여 본 연구에서 얻은 자료만으로 각 종양의 특징적인 케모카인 유전자 발현을 대표한다고 하기에는 무리가 있었다.
- 이에 이 논문에서는 임상에서 자주 접하는 다양한 양성 및 악성의 근골격계 종양에서의 케모카인의 발현 양상을 관찰하여 종양의 분류 혹은 종류에 따른 케모카인의 발현 특성을 분석 하고자하였다.
제안 방법
- 2000년 2월에서 2000년 7월 사이 영남대학교의료원에서 종양 적출술을 실시한 환자 7명의 근 골격계 종양조직을 대상으로 역전사 중합효소 연쇄 반응(reverse transcription polymerase chain reaction; RT-PCR)과 RNase 보호 분석법(RNase protection assay; RPA)을 이용하여 케모카인 MIP-1α, MIP-1β 및 IP-10의 유전자 발현을 관찰하였다.
- 말린 침전 시료는 5 ㎕ 1X loading buffer로 녹인 뒤 전기영동의 시료로 사용하였다. 8% acrylamide/8 M urea로 구성된 전기영동 겔의 각 well에 1000-2000 cpm/g 활성도의 probe size marker와 각각의 시료를 넣은 뒤 250 V에서 약 2시간 30분 동안 전기영동을 실시하였다. 그 후 겔을 조심스럽게 필터종이에 부착시킨 뒤 1시간 동안 진공 건조시키고 완전히 말린 후 이를 -70℃에서 X-ray 필름에 적정시간 노출시켜 결과를 관찰하였다.
- 증폭된 상보 DNA는 8% polyacrylamide gel 상에서 1배 농도의 TAE buffer로 150 volt에서 50분간 전기 영동 시켰다. EtBr (ethidium bromide) 0.5 ㎍/㎖에 20분 염색 후 나타나는 띠(band)를 관찰하였다. DNA marker로는 100 bp DNA ladder를 사용하였다.
- 그 후 99℃에서 5분간, 5℃에서 5분간 반응시켜 reverse transcriptase를 불활성화시킨 다음 PCR을 실시하였다. PCR master mixture는 MgCl2 4 ㎍/㎖, 10×PCR buffer 8 ㎕ 그리고 Taq polymerase 0.5 ㎕와 멸균 증류수를 혼합시켜 전체 78 ㎕가 되도록 하였다. 여기에 각각 20 M의 sense primer와 antisense primer를 1 ㎕ 첨가하여 PCR을 실시하였다.
- PCR 시험관에 농도가 100 ng/㎕의 RNA 3㎕, MgCl2 1 ㎍/㎖, 10×PCR buffer 2 ㎕, dNTP 각각 2 ㎕씩 8 ㎕, RNase inhibitor 1㎕, reverse transcriptase (M-MLVRT; RAV-2) 1 ㎕, oligo {dT} 1 ㎕가 혼합된 RT 시료 17㎕를 넣고 그 위에 mineral oil을 중첩 시킨 후 42℃에서 15분간 반응시켜 cDNA를 합성시켰다. 그 후 99℃에서 5분간, 5℃에서 5분간 반응시켜 reverse transcriptase를 불활성화시킨 다음 PCR을 실시하였다.
- 여기에 각각 20 M의 sense primer와 antisense primer를 1 ㎕ 첨가하여 PCR을 실시하였다. PCR은 thermal cycler (Perkin Elmer, USA)를 이용하여 실시하였으며, 처음의 thermal cycling 단계는 MIP-1α와 MIP-1β의 경우 94℃에서 45초 동안의 불활성화 단계, 62℃에서 1분 동안 결합 반응 단계와 72℃에서 1분 동안의 핵산 중합 단계로 구성하여 35회의 thermal cycling을 실시하였고 β-actin과 IP-10의 경우 94℃에서 45초 동안의 불활성화 단계, 59℃에서 1분 동안 결합 반응 단계와 72℃에서 1분 동안의 핵산 중합 단계로 구성하여 31회의 thermal cycling을 실시한 뒤 별도로 72℃에서 10분 동안 더 핵산 중합 반응을 실시하여 부분적으로 신장된 산물을 완전한 가닥으로 완성시켜 주는 단계로 하였다.
- RNA 분리를 위하여 TEL-TEST사(TX, USA)의 RNAzol B를 사용하였으며, 케모카인 유전자 발현을 관찰하기 위한 RT-PCR은 RNA PCR kit (N808-0017 Perkin Elmer, USA)를 사용하였고 RPA는 RiboQuant (Pharmingen, USA)의 multi-probe RNase protection assay system을 이용하였으며, 이때 lymphotactin, RANTES, IP-10, MIP-α, MIP-β, MCP-1, IL-8, 및 I-309의 8종류 케모카인 발현 유무를 관찰할 수 있는 hck-5 template set을 사용하였다. RT-PCR에 사용된 케모카인 primer들은 바이오니아사(충북 청원군)로부터 구입하였다.
- 그 후 4℃에서 12,000 rpm으로 15분간 원심분리하여 위층을 조심스럽게 취한 뒤 같은 양의 isopropanol을 첨가하여 -20℃에서 45분간 정치시킨 후 원심 분리하여 얻어진 침전물은 에탄올로 세척한 후에 공기 중에서 말린 뒤 0.1% DEPC (diethyl pyrocarbonate)가 첨가된 증류수에 녹여서 이중 2 ㎕를 취하여 DEPC에 500배 희석하여 흡광기를 이용하여 농도를 측정한 후 RT-PCR 및 RPA의 시료로 사용하였다.
- 8% acrylamide/8 M urea로 구성된 전기영동 겔의 각 well에 1000-2000 cpm/g 활성도의 probe size marker와 각각의 시료를 넣은 뒤 250 V에서 약 2시간 30분 동안 전기영동을 실시하였다. 그 후 겔을 조심스럽게 필터종이에 부착시킨 뒤 1시간 동안 진공 건조시키고 완전히 말린 후 이를 -70℃에서 X-ray 필름에 적정시간 노출시켜 결과를 관찰하였다.
- 5 ㎕와 멸균 증류수를 혼합시켜 전체 78 ㎕가 되도록 하였다. 여기에 각각 20 M의 sense primer와 antisense primer를 1 ㎕ 첨가하여 PCR을 실시하였다. PCR은 thermal cycler (Perkin Elmer, USA)를 이용하여 실시하였으며, 처음의 thermal cycling 단계는 MIP-1α와 MIP-1β의 경우 94℃에서 45초 동안의 불활성화 단계, 62℃에서 1분 동안 결합 반응 단계와 72℃에서 1분 동안의 핵산 중합 단계로 구성하여 35회의 thermal cycling을 실시하였고 β-actin과 IP-10의 경우 94℃에서 45초 동안의 불활성화 단계, 59℃에서 1분 동안 결합 반응 단계와 72℃에서 1분 동안의 핵산 중합 단계로 구성하여 31회의 thermal cycling을 실시한 뒤 별도로 72℃에서 10분 동안 더 핵산 중합 반응을 실시하여 부분적으로 신장된 산물을 완전한 가닥으로 완성시켜 주는 단계로 하였다.
대상 데이터
- 2000년 2월에서 2000년 7월 사이에 영남대학교 의료원에서 종양 적출술을 실시한 환자의 적출 종양조직으로 골종양에서의 케모카인 MIP-1α, MIP-1β 및 IP-10의 유전자 발현을 관찰하여 근골격계 종양의 종류에 따른 케모카인의 특성을 분석하여 얻은 결과는 다음과 같다.
- 5 ㎍/㎖에 20분 염색 후 나타나는 띠(band)를 관찰하였다. DNA marker로는 100 bp DNA ladder를 사용하였다.
- 그리고, IP-10 (10 bp)의 경우에는 sense는 5′-GGA ACC TCC AGT CTC AGC ACC-3′이며, antisense는 5′-GCG TAC GGT TCT AGA GAG AGG TAC-3′이다. Loading 대조군으로 사용된 β-actin (712 bp)의 sense는 5＇-CGG GAA ATC GTG CGT GAC AT-3＇이고, antisense는 5＇-GAA CTT TGG GGG ATG CTC GC-3＇이다. 그 외 일반 시약들은 시판 특급 순수 시약들을 사용하였다.
- RNA 분리를 위하여 TEL-TEST사(TX, USA)의 RNAzol B를 사용하였으며, 케모카인 유전자 발현을 관찰하기 위한 RT-PCR은 RNA PCR kit (N808-0017 Perkin Elmer, USA)를 사용하였고 RPA는 RiboQuant (Pharmingen, USA)의 multi-probe RNase protection assay system을 이용하였으며, 이때 lymphotactin, RANTES, IP-10, MIP-α, MIP-β, MCP-1, IL-8, 및 I-309의 8종류 케모카인 발현 유무를 관찰할 수 있는 hck-5 template set을 사용하였다. RT-PCR에 사용된 케모카인 primer들은 바이오니아사(충북 청원군)로부터 구입하였다. 사용된 케모카인 primer 염기서열은다음과 같다.
- 9세로 13세에서 64세까지의 분포를 보였으며, 이 중 남자가 3명, 여자가 4명이었다. 사용한 적출 종양의 원 종양은 조직학적 확진을 받았으며, 환자의 병명은 지방종(lipoma) 1예, 방골성 골종(parosteal osteoma) 1예, 내연골종(enchondroma) 2예, 색소융모결절성 활막염(pigmented villonodular synovitis) 1예, 결절종(ganglion) 1예였으며, 전이성 편평세포암 (metastatic squamous cell carcinoma)이 1예가 각각 있었다(Table 1). 각종양의 적출 부위는 Table 1과 같다.
이론/모형
- RNA의 분리는 RNA zol B (TEL-TEST, USA)법을 이용하여 분리하였다. 간략하게 설명하면, -70℃에 보관된 조직을 아이스를 이용하여 냉동 유지 상태에서 가루가 될 때까지 빠른 시간 내에 으깬 뒤 이를 RNA zol B가 1㎖ 들어 있는 1.
- RiboQuant에서 제시한 RPA 실험 방법에 따라 RPA를 실행하였다. 먼저 probe 합성을 위하여 [a-32P] UTP 10 ㎕, GACU pool 1 ㎕, DTT 2 ㎕, 5X transcription buffer 4 ㎕, RPA template set (hck-5) 1 ㎕, RNasin 1 ㎕, T7 polymerase 1 ㎕를 혼합하여 37℃, 1시간 정치후 DNase 2 ㎕를 첨가하여 반응을 정지시킨 뒤 20 mM EDTA 26 ㎕, Tris-saturated phenol 25 ㎕, chloroform; isoamyl alcohol (50:1) 25 ㎕, Yeast tRNA 2 ㎕를 넣어 혼합, 원심분리 후 위층을 새 멸균 튜브에 옮긴다.
성능/효과
- 1. 지방종의 경우는 MIP-1α 유전자는 발현하지 않았고, MIP-1β 와 IP-10 유전자는 발현하였다.
- 2. 방골성 골종의 경우도 MIP-1α 유전자는 발현하지 않았고, MIP-1β 와 IP-10 유전자는 발현하였다.
- 3. 내연골종의 경우 두 환자에게서 각기 다른 결과를 볼 수 있었는데, 62세 여자 환자의 족부 제 4근위 지골에서 얻은 조직에서는 MIP-1α, MIP-1β 및 IP-10 유전자 모두를 관찰할 수 있었으나 13세 남자 환자의 수부 제 4 근위 지골에서 얻은 조직에서는 상기한 모든 케모카인이 발현하지 않았다.
- 4. 색소융모결절성활막염의 경우 MIP-1α 와 IP-10 유전자는 타 종양에 비하여 강한 발현을 보이며 이외 MIP-1β 유전자도 나타났다. LTN, RANTES, IP-10, MIP-α MIP-1β, MCP-1, IL-8, 그리고 I-309의 총 8종 케모카인의 발현도를 관찰하는 RPA를 실시한 결과 이 환자의 경우 IP-10, MIP-1α, MIP-1β, MCP-1 및 IL-8의 5종의 유전자 발현을 관찰할 수 있었다.
- 5. 결절종의 조직은 MIP-1α, MIP-1β 및 IP-10 유전자는 전혀 발현되지 않았다.
- 6. 전이성 편평세포암종의 경우는 MIP-1α, MIP-1β 및 IP-10 유전자가 모두 발현하였고, 특히 IP-10 유전자의 강한 발현성을 보였다.
- 색소융모결절성활막염의 경우 MIP-1α 와 IP-10 유전자는 타 종양에 비하여 강한 발현을 보이며 이외 MIP-1β 유전자도 나타났다. LTN, RANTES, IP-10, MIP-α MIP-1β, MCP-1, IL-8, 그리고 I-309의 총 8종 케모카인의 발현도를 관찰하는 RPA를 실시한 결과 이 환자의 경우 IP-10, MIP-1α, MIP-1β, MCP-1 및 IL-8의 5종의 유전자 발현을 관찰할 수 있었다.
- 색소융모결절성활막염의 경우 MIP-1α 와 IP-10이 타 종양에 비하여 강한 발현을 보이며 이외 MIP-1β도 나타났다. 결절종의 조직은 MIP-1α, MIP-1β 및 IP-10이 전혀 발현되지 않았고, 전이성 편평세포암의 경우는 상기한 케모카인이 모두 발현하였고, 특히 IP-10의 강한 발현성을 보였다. 발현도를 비교하여 보면, 색소 융모결절성 활막염의 경우에서는 다른 환자의 적출 종양에 비해 MIP-1α, IP-10이 강하게 나타나는 것을 관찰할 수 있었다.
- 결절종의 조직은 MIP-1α, MIP-1β 및 IP-10이 전혀 발현되지 않았고, 전이성 편평세포암의 경우는 상기한 케모카인이 모두 발현하였고, 특히 IP-10의 강한 발현성을 보였다. 발현도를 비교하여 보면, 색소 융모결절성 활막염의 경우에서는 다른 환자의 적출 종양에 비해 MIP-1α, IP-10이 강하게 나타나는 것을 관찰할 수 있었다. 이에 색소융모결절성활막염 조직을 lymphotax- in (LTN), RANTES, IP-10, MIP-1α, MIP-1β, MCP-1, IL-8, 그리고 I-309의 총 8종 케모카인의 발현도 관찰이 가능한 RPA를 실시한 결과는 Fig.
- 발현도를 비교하여 보면, 색소 융모결절성 활막염의 경우에서는 다른 환자의 적출 종양에 비해 MIP-1α, IP-10이 강하게 나타나는 것을 관찰할 수 있었다. 이에 색소융모결절성활막염 조직을 lymphotax- in (LTN), RANTES, IP-10, MIP-1α, MIP-1β, MCP-1, IL-8, 그리고 I-309의 총 8종 케모카인의 발현도 관찰이 가능한 RPA를 실시한 결과는 Fig. 2와 같이 IP-10, MIP-1α, MIP-1β 이외에도, MCP-1와 IL-8가 발현됨을 관찰할 수 있다.
- 그러나, 제한적인 증례의 수집으로 인하여 본 연구에서 얻은 자료만으로 각 종양의 특징적인 케모카인 유전자 발현을 대표한다고 하기에는 무리가 있었다. 하지만, 본 연구를 통해 관찰한 몇 가지 근골격계 종양의 유전자 발현은 종양에 따라 타 종양에 비하여 대별되는 매우 뚜렷한 발현양상의 차이를 보이고 있다. 특히, 색소융모결절성 활막염과 전이성 편평 세포암종은 타 종양에 비하여 특징적인 케모카인 발현을 보이는데 이 두 종양 모두 골조직에 매우 공격적인 임상 양상을 보인다.
후속연구
- 연구의 시작에는 다양한 근골격계 종양에서 발현되는 케모카인 유전자를 분석하여 각 종양의 발현 양상을 비교, 분석하려 하였다. 그러나, 제한적인 증례의 수집으로 인하여 본 연구에서 얻은 자료만으로 각 종양의 특징적인 케모카인 유전자 발현을 대표한다고 하기에는 무리가 있었다. 하지만, 본 연구를 통해 관찰한 몇 가지 근골격계 종양의 유전자 발현은 종양에 따라 타 종양에 비하여 대별되는 매우 뚜렷한 발현양상의 차이를 보이고 있다.
- 이 연구의 결과가 비록 근골격계 종양의 케모카인 발현을 대표하는 충분한 자료를 제공하지는 못하지만 앞으로 더 많은 연구가 이루어지면 현재까지 알려진 케모카인의 기능에 대한 이해를 보다 넓힐 수 있을 것이며, 바꾸어서 근골격계 종양의 특징에 대한 이해에도 도움을 줄 수 있을 것이다. 나아가 이들의 연관성에 관한 보다 많은 연구가 이루어져 유전자를 이용한 근골격계 종양의 치료 및 임상적용에 도움을 줄 것으로 기대한다.
- 이 연구에서 근골격계 종양의 케모카인의 발현 양상에 대한 다양한 정보를 얻을 수 있었고, 이 연구를 통하여 얻은 결과는 향후 이들을 이용한 사이토카인 조절망을 정립하는데 기초자료를 제공할 수 있을 것으로 생각된다. 나아가서는 치료 및 진단에 필요한 케모카인 연구에 기초 자료가 될 수 있을 것이다.
- 이 연구에서 근골격계 종양의 케모카인의 발현 양상에 대한 다양한 정보를 얻을 수 있었고, 이 연구를 통하여 얻은 결과는 향후 이들을 이용한 사이토카인 조절망을 정립하는데 기초자료를 제공할 수 있을 것으로 생각된다. 나아가서는 치료 및 진단에 필요한 케모카인 연구에 기초 자료가 될 수 있을 것이다.
- 이 연구의 결과가 비록 근골격계 종양의 케모카인 발현을 대표하는 충분한 자료를 제공하지는 못하지만 앞으로 더 많은 연구가 이루어지면 현재까지 알려진 케모카인의 기능에 대한 이해를 보다 넓힐 수 있을 것이며, 바꾸어서 근골격계 종양의 특징에 대한 이해에도 도움을 줄 수 있을 것이다. 나아가 이들의 연관성에 관한 보다 많은 연구가 이루어져 유전자를 이용한 근골격계 종양의 치료 및 임상적용에 도움을 줄 것으로 기대한다.
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