목 적 : 근육과 관절 등에서 유발된 심부통증(deep pain)이 척수상위로 전달되는 신경로에 대해서는 아직 잘 알려져 있지 않다. 그러나 최근 일부 연구자들은 피부에서 유발된 천부통증(superficial pain)과는 달리 중뇌의 PAG에 위치한 신경원에 침해 자극이 전달되어 자율신경계와 행동양식에 영향을 줄 것이라는 가설을 보고하였다. 또한, 비스테로이드성의 항염증성 약품들은 말초조직에서 프로스타글란딘 합성을 방해하여 진통효과를 유발시킨다고 알려져 왔으나 최근에는 척수와 뇌간에서도 진통효과가 있을 것이라고 추측하고 있다. 그러므로 이 연구자는 포르말린으로 체성 심부통증을 유발시켜 중뇌의 어느 부위에서 신경세포가 활성화되는지를 c-Fos 단백의 발현으로 확인하고 또한 비스테로이드성의 항염증성 약품인 아스피린의 효과를 알아보고자 이 연구를 시도하게 되었다. 방 법 : 실험 I군에서는 생리식염수를 흰쥐 꼬리에 미리 피하주사한 뒤 포르말린을 이용해 체성 심부통증을 유발시켰고, 실험 II군은 아스피린을 주사한 후 포르말린으로 체성 심부통증을 유발시켰다. 정상군에서는 통증자극을 주지 않았다. 실험 I군과 실험 II군의 흰쥐는 통증을 유발 시킨 뒤 30분, 1, 2, 6, 24시간에 희생시켜 뇌를 적출하여 뇌절편을 만들었다. 뇌절편으로 냉동 연속조직절편을 제작하여 면역조직화학적 방법으로 c-Fos 단백의 출현여부를 확인하였다. Interaural 1.00-1.36 mm를 통과하는 관상 뇌절편의 연속조직표본에서 나타난 양성면역반응성을 토대로 중뇌의 VLPAG와 DMPAG를 관찰하였고, 단위면적($0.2mm^2$)당 면역양성반응을 보인 신경세포를 계수하고 통계 처리하였다. 결 과 : c-Fos 양성면역반응 신경세포 수는 DMPAG에서 보다 VLPAG에서 현저하게 많았다. DMPAG와 VLPAG에서 통증유발 2시간 후 c-Fos 양성면역반응 신경세포 수는 최고치에 도달하였다. 아스피린을 투여한 군의 c-Fos 양성면역반응 신경세포 수는 투여하지 않은 군보다 전시기에 걸쳐 적었다. 결 론 : 이 연구결과는 포르말린에 의해 유발된 체성 심부통증의 기전과 아스피린의 효과를 이해하는데 기초적인 자료로 이용될 수 있을 것으로 생각된다.
목 적 : 근육과 관절 등에서 유발된 심부통증(deep pain)이 척수상위로 전달되는 신경로에 대해서는 아직 잘 알려져 있지 않다. 그러나 최근 일부 연구자들은 피부에서 유발된 천부통증(superficial pain)과는 달리 중뇌의 PAG에 위치한 신경원에 침해 자극이 전달되어 자율신경계와 행동양식에 영향을 줄 것이라는 가설을 보고하였다. 또한, 비스테로이드성의 항염증성 약품들은 말초조직에서 프로스타글란딘 합성을 방해하여 진통효과를 유발시킨다고 알려져 왔으나 최근에는 척수와 뇌간에서도 진통효과가 있을 것이라고 추측하고 있다. 그러므로 이 연구자는 포르말린으로 체성 심부통증을 유발시켜 중뇌의 어느 부위에서 신경세포가 활성화되는지를 c-Fos 단백의 발현으로 확인하고 또한 비스테로이드성의 항염증성 약품인 아스피린의 효과를 알아보고자 이 연구를 시도하게 되었다. 방 법 : 실험 I군에서는 생리식염수를 흰쥐 꼬리에 미리 피하주사한 뒤 포르말린을 이용해 체성 심부통증을 유발시켰고, 실험 II군은 아스피린을 주사한 후 포르말린으로 체성 심부통증을 유발시켰다. 정상군에서는 통증자극을 주지 않았다. 실험 I군과 실험 II군의 흰쥐는 통증을 유발 시킨 뒤 30분, 1, 2, 6, 24시간에 희생시켜 뇌를 적출하여 뇌절편을 만들었다. 뇌절편으로 냉동 연속조직절편을 제작하여 면역조직화학적 방법으로 c-Fos 단백의 출현여부를 확인하였다. Interaural 1.00-1.36 mm를 통과하는 관상 뇌절편의 연속조직표본에서 나타난 양성면역반응성을 토대로 중뇌의 VLPAG와 DMPAG를 관찰하였고, 단위면적($0.2mm^2$)당 면역양성반응을 보인 신경세포를 계수하고 통계 처리하였다. 결 과 : c-Fos 양성면역반응 신경세포 수는 DMPAG에서 보다 VLPAG에서 현저하게 많았다. DMPAG와 VLPAG에서 통증유발 2시간 후 c-Fos 양성면역반응 신경세포 수는 최고치에 도달하였다. 아스피린을 투여한 군의 c-Fos 양성면역반응 신경세포 수는 투여하지 않은 군보다 전시기에 걸쳐 적었다. 결 론 : 이 연구결과는 포르말린에 의해 유발된 체성 심부통증의 기전과 아스피린의 효과를 이해하는데 기초적인 자료로 이용될 수 있을 것으로 생각된다.
Purpose : It had been suggested that pain arising from deep somatic body regions influences neural activity within periaqueductal gray(PAG) of midbrain via distinct spinal pathways. Aspirin is one of the popular non-steroidal anti-inflammatory drugs used in the management of pain. Fos expression was...
Purpose : It had been suggested that pain arising from deep somatic body regions influences neural activity within periaqueductal gray(PAG) of midbrain via distinct spinal pathways. Aspirin is one of the popular non-steroidal anti-inflammatory drugs used in the management of pain. Fos expression was used as a marker for neuronal activity throughout central neurons following painful peripheral stimulation. This study was prepared to investigate changes of c-Fos immunoreactivity in midbrain by deep pain and effects of aspirin. Methods : Male Sprague-Dawley rats were injected with 0.1 mL of 5% formalin in the plantar muscle of the right hindpaw. For experimental group II, aspirin was injected intravenously before injection of formalin. An aspirin-untreated group was utilized as group I. Rats were sacrificed at 0.5, 1, 2, 6 and 24 hours after formalin injection. Rat's brains were removed and sliced in rat brain matrix. Brain slices were coronally sectioned at interaural 1.00-1.36 mm. Serial sections were immunohistochemically reacted with polyclonal c-Fos antibody. The numbers of c-Fos protein immunoreactive neurons in ventrolateral periaqueductal gray(VLPAG) and dorsomedial periaqueductal gray(DMPAG) were counted and analyzed statistically with Mann-Whitney U tests. Results : Higher numbers of c-Fos protein immunoreactive neurons were found in VLPAG. In both VLPAG and DMPAG of formalin-treated group, the numbers of c-Fos protein immunoreactive neurons were significantly higher at all time points than the formalin-untreated group, which peaked at two hours. The numbers of c-Fos immunoreactive neuron of the aspirin-treated group were less compared to the aspirin-untreated group at each time point. Conclusion : These results provide some basic knowledge in understanding the mechanism of formalin-induced deep somatic pain and the effects of aspirin.
Purpose : It had been suggested that pain arising from deep somatic body regions influences neural activity within periaqueductal gray(PAG) of midbrain via distinct spinal pathways. Aspirin is one of the popular non-steroidal anti-inflammatory drugs used in the management of pain. Fos expression was used as a marker for neuronal activity throughout central neurons following painful peripheral stimulation. This study was prepared to investigate changes of c-Fos immunoreactivity in midbrain by deep pain and effects of aspirin. Methods : Male Sprague-Dawley rats were injected with 0.1 mL of 5% formalin in the plantar muscle of the right hindpaw. For experimental group II, aspirin was injected intravenously before injection of formalin. An aspirin-untreated group was utilized as group I. Rats were sacrificed at 0.5, 1, 2, 6 and 24 hours after formalin injection. Rat's brains were removed and sliced in rat brain matrix. Brain slices were coronally sectioned at interaural 1.00-1.36 mm. Serial sections were immunohistochemically reacted with polyclonal c-Fos antibody. The numbers of c-Fos protein immunoreactive neurons in ventrolateral periaqueductal gray(VLPAG) and dorsomedial periaqueductal gray(DMPAG) were counted and analyzed statistically with Mann-Whitney U tests. Results : Higher numbers of c-Fos protein immunoreactive neurons were found in VLPAG. In both VLPAG and DMPAG of formalin-treated group, the numbers of c-Fos protein immunoreactive neurons were significantly higher at all time points than the formalin-untreated group, which peaked at two hours. The numbers of c-Fos immunoreactive neuron of the aspirin-treated group were less compared to the aspirin-untreated group at each time point. Conclusion : These results provide some basic knowledge in understanding the mechanism of formalin-induced deep somatic pain and the effects of aspirin.
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문제 정의
그러므로 연구자들은 포르말린으로 체성 심부통증을 유발시켜 중뇌에서 통증자극에 반응을 나타내는 신경세포를 c-Fos 단백의 발현으로 확인하고, 또한 아스피린의 효과를 알아보고자 이 연구를 시도하였다.
또한, 비스테로이드성의 항염증성 약품들은 말초조직에서 프로스타글란딘 합성을 방해하여 진통효과를 유발시킨다고 알려져 왔으나 최근에는 척수와 뇌간에서도 진통효과가 있을 것이라고 추측하고 있다. 그러므로 이 연구자는 포르말린으로 체성 심부통증을 유발시켜 중뇌의 어느 부위에서 신경세포가 활성화되는지를 c-Fos 단백의 발현으로 확인하고 또한 비스테로이드성의 항염증성 약품인 아스피린의 효과를 알아보고자 이 연구를 시도하게 되었다.
연구자들은 포르말린으로 체성 심부통증을 유발시켜 중뇌에서 통증자극에 반응을 나타내는 신경세포를 c-Fos 단백의 발현으로 확인하고 또한 아스피린이 심부통증을 완화시킬 수 있는지를 알아보고자 이 연구를 실시하여 다음과 같은 결과를 얻었다.
제안 방법
3.5% chloral hydrate(1 mL/100 g)를 주사하여 동물을 마취시킨 상태에서 머리를 분리시킨 뒤 최단시간 내에 뇌를 적출하였다. 뇌를 rat brain matrix(RBM)에 넣고 면도날로 상구(superior colliculus)를 통과하는 관상절단 뇌절편을 만들었다.
뇌절편으로 냉동 연속조직절편을 제작하여 면역조직화학적 방법으로 c-Fos 단백의 출현여부를 확인하였다. Interaural 1.00-1.36 mm를 통과하는 관상 뇌절편의 연속조직표본에서 나타난 양성면역반응성을 토대로 중뇌의 VLPAG와 DMPAG를 관찰하였고, 단위면적(0.2 mm2)당 면역양성반응을 보인 신경세포를 계수하고 통계 처리하였다.
광학현미경(Axiophot, Germany)으로 조직표본을 관찰한 후, c-Fos 단백 항체에 양성반응을 보이는 신경세포 수를 계수하였다. 계수부위는 경계가 명확한 복외측중뇌수도회색질(ventrolateral periaqueductal gray, VLPAG)과 배내측중뇌수도회색질(dorsomedial periaqueductal gray, DMPAG)로 국한시켰다.
뇌 적출시기는 포르말린 피하주사 후 30분, 1, 2, 6, 24시간으로 정하였다.
5% chloral hydrate(1 mL/100 g)를 주사하여 동물을 마취시킨 상태에서 머리를 분리시킨 뒤 최단시간 내에 뇌를 적출하였다. 뇌를 rat brain matrix(RBM)에 넣고 면도날로 상구(superior colliculus)를 통과하는 관상절단 뇌절편을 만들었다.
실험 I군과 실험 II군의 흰쥐는 통증을 유발 시킨 뒤 30분, 1, 2, 6, 24시간에 희생시켜 뇌를 적출하여 뇌절편을 만들었다. 뇌절편으로 냉동 연속조직절편을 제작하여 면역조직화학적 방법으로 c-Fos 단백의 출현여부를 확인하였다. Interaural 1.
뇌절편을 탄산가스(CO2 gas)로 동결고정한 후 동결절편기(Reichert-Jung, Germany)를 사용하여 약 6 µm 두께로 조직절편을 제작하여 poly-l-lysine coated slide에 부착시켰으며 조직절편은 interaural 1.00-1.36 mm 사이를 통과하는 절편만을 선택하였다. 조직절편을 40℃의 조직신전기에서 40분 정도 충분히 말린 다음 4℃에서 4% paraformaldehyde로 5분간 고정하였고, 이를 다시 조직신전기에서 2시간 이상 충분히 말렸다.
면역염색은 대조실험에서는 상기 일차항체 적용과정을 생략하거나 ABC 용액 적용과정을 생략하였고, 이 과정을 거친 표본에서는 어떤 면역반응성도 나타나지 않아 면역염색의 특이성을 확인하였다.
정상군에서는 통증자극을 주지 않았다. 실험 I군과 실험 II군의 흰쥐는 통증을 유발 시킨 뒤 30분, 1, 2, 6, 24시간에 희생시켜 뇌를 적출하여 뇌절편을 만들었다. 뇌절편으로 냉동 연속조직절편을 제작하여 면역조직화학적 방법으로 c-Fos 단백의 출현여부를 확인하였다.
실험 I군에서는 생리식염수를 흰쥐 꼬리에 미리 피하 주사한 뒤 포르말린을 이용해 체성 심부통증을 유발시켰고, 실험 II군은 아스피린을 주사한 후 포르말린으로 체성 심부통증을 유발시켰다. 정상군에서는 통증자극을 주지 않았다.
일차항체를 적용시킨 뒤 PBS에서 10분씩 3회 수세하였고, 이어서 이차항체인 biotinylated goat anti-rabbit IgG(Vector Lab., U.S.A.)를 실온에서 1시간 동안 반응시켰다. 그 후 조직절편들을 PBS로 10분씩 3회 수세한 다음 30분 전에 미리 만들어 실온에 방치해 놓은 avidin-biotin horseradish peroxidase complex(ABC)용액(Vector Lab.
조직절편을 0.02 M 인산염완충액(pH. 7.4, PBS)에서 약 10분 동안 2회 수세한 후 조직내 과산화효소의 활성을 제거하기 위해 0.3% 과산화수소(H2O2)가 포함된 메틸알코올 용액에서 20분간 처리하고, PBS에서 10분간 3회 수세한 다음 5% 정상염소 혈청(normal goat serum)에 30분간 두었다. 그 후 조직절편들을 수세하지 않고 가볍게 털어낸 다음 일차항체인 rabbit antirat c-Fos antibody(희석비율 1 : 500, OncoGene, U.
01% 과산화수소가 혼합된 용액으로 약 10분간 처리하여 실온에서 발색시켰다. 조직절편의 발색상태를 광학현미경으로 확인한 후 Tris buffer, PBS 및 증류수에서 각각 10분간씩 차례로 수세한 다음, 통상적인 조직제작과정을 거쳐 Permount(Polysciences, U.S.A.)로 봉입하였다.
특수 고안된 플라스틱 용기에 흰쥐를 고정한 뒤 0.9% 생리식염수를 흰쥐 꼬리에 정맥주사(0.1 mL)한 다음 15분 경과 후 오른쪽 뒷발바닥 근육에 5% 포르말린용액 0.1 mL를 주사하였다.
특수 고안된 플라스틱 용기에 흰쥐를 고정한 뒤 아스피린을 흰쥐 꼬리에 정맥주사(0.1 mL, 500 mg/kg)한 다음 15분 경과 후 오른쪽 뒷발바닥 근육에 5% 포르말린용액 0.1 mL를 주사하였다.
대상 데이터
실험동물은 성숙하고 건강한 200-250 g의 Sprague-Dawley계 수컷 흰쥐였으며 스트레스를 받지 않도록 배려한 상태로 사육하였고, 실험 I군(25마리), 실험 II군(25마리) 및 정상군(5마리)을 합쳐 총 55마리를 사용하였다.
데이터처리
계수부위는 경계가 명확한 복외측중뇌수도회색질(ventrolateral periaqueductal gray, VLPAG)과 배내측중뇌수도회색질(dorsomedial periaqueductal gray, DMPAG)로 국한시켰다. 단위면적(0.2 mm2)에서 관찰된 세포수의 평균값을 구한 다음 정상군과 실험군 및 실험군 간의 통계적 유의성을 Mann-Whitney U test를 이용하여 검증하였다.
이론/모형
이 모든 포르말린 시험의 전형적 행동들은 많은 연구자들에 의해 재확인되고 정량화 되었다7, 10, 11, 23, 27). Woolf3)에 의해 정의된 임상적 통증의 모든 특성들이 포르말린에 의해 유발된 통증모델에서 나타난다고 주장하는 연구자도 있어7), 이 실험에서는 체성 통증의 모델로 포르말린 시험을 채택하게 되었다.
성능/효과
1, 2). 실험 II군에서도 면역양성반응세포수는 정상군에 비해 전시기에 걸쳐 증가되어 있었고, 시기별로는 통증유발 30분 후부터 증가되다가 2시간에 최고치에 달하였으며, 그 후 24시간까지 감소하였다(Table 1, Fig. 1, 2).
3, 4). 실험 II군에서도 면역양성반응세포수는 정상군에 비해 전시기에 걸쳐 증가되어 있었고, 시기별로는 통증유발 30분 후부터 증가되다가 2시간에 최고치에 달하였으며, 그 후 24시간까지 감소하였다(Table 2, Fig. 3, 4).
실험 I군과 실험 II군 사이에서 시기에 따른 면역양성반응세포의 수적 차이는 전시기에 걸쳐 실험 II군이 실험 I군에 비해 양성반응을 보인 세포수가 적었으며 특히 통증유발 2시간 후에서 현저한 차이를 보였다(P<0.01, Table 1).
실험 I군과 실험 II군를 비교하여 시기별로 면역양성반응세포의 수적 차이는 전시기에 걸쳐 실험 II군이 실험 I군에 비해 양성반응을 보인 세포수가 적었으며 특히 통증유발 2시간 후에서 현저한 차이를 보였다(P<0.01, Table 2).
실험 I군에서 면역양성반응세포수는 정상군에 비해 전시기에 걸쳐 증가되어 있었고, 시기별로는 통증유발 30분 후부터 증가되다가 2시간에 최고치에 달하였으며, 그 후 24시간까지 감소하였다(Table 1, Fig. 1, 2). 실험 II군에서도 면역양성반응세포수는 정상군에 비해 전시기에 걸쳐 증가되어 있었고, 시기별로는 통증유발 30분 후부터 증가되다가 2시간에 최고치에 달하였으며, 그 후 24시간까지 감소하였다(Table 1, Fig.
실험 I군에서 면역양성반응세포수는 정상군에 비해 전시기에 걸쳐 증가되어 있었고, 시기별로는 통증유발 30분 후부터 증가되다가 2시간에 최고치에 달하였으며, 그 후 24시간까지 감소하였다(Table 2, Fig. 3, 4). 실험 II군에서도 면역양성반응세포수는 정상군에 비해 전시기에 걸쳐 증가되어 있었고, 시기별로는 통증유발 30분 후부터 증가되다가 2시간에 최고치에 달하였으며, 그 후 24시간까지 감소하였다(Table 2, Fig.
이 실험에서도 c-Fos 양성면역반응 신경세포 수가 DMPAG에서 보다 VLPAG에서 더 많이 관찰되었기 때문에 이 사실이 더욱 명백하다는 결론을 얻었다. 이 실험에서 PAG를 DMPAG, DLPAG, LPAG, VLPAG로 정확히 구분하여 계수하기가 곤란하여 경계가 분명히 차이가 나는 DMPAG와 VLPAG만을 선택하였으나 DLPAG나 LPAG는 DMPAG와 유사한 양상을 보였다. 앞으로 이들 부위에 대한 연구가 요구된다.
이 실험에서는 체성 통증군 뿐만 아니라 정상군에서도 c-Fos가 발현되는 것이 관찰되었다. 정상군, 실험 I군, 실험 II군, 통증 유발 후 경과한 시기 및 뇌의 부위별로 c-Fos에 면역양성반응을 보인 신경세포를 계수해 본 결과 통계학적으로 유의한 차이가 나타났다.
이 실험에서는 흰쥐 발바닥에 5% 포르말린 0.1 mL를 투여해 체성통증을 유발 시킨 실험 II군에서 위와 같은 전형적인 이상성(biphasic) 행동들을 확인할 수 있었다.
이 실험에서도 c-Fos 양성면역반응 신경세포 수가 DMPAG에서 보다 VLPAG에서 더 많이 관찰되었기 때문에 이 사실이 더욱 명백하다는 결론을 얻었다. 이 실험에서 PAG를 DMPAG, DLPAG, LPAG, VLPAG로 정확히 구분하여 계수하기가 곤란하여 경계가 분명히 차이가 나는 DMPAG와 VLPAG만을 선택하였으나 DLPAG나 LPAG는 DMPAG와 유사한 양상을 보였다.
이 실험에서는 체성 통증군 뿐만 아니라 정상군에서도 c-Fos가 발현되는 것이 관찰되었다. 정상군, 실험 I군, 실험 II군, 통증 유발 후 경과한 시기 및 뇌의 부위별로 c-Fos에 면역양성반응을 보인 신경세포를 계수해 본 결과 통계학적으로 유의한 차이가 나타났다.
정상군, 실험군 모두에서 DMPAG에서는 VLPAG에서 보다 면역양성반응세포수가 적었다(Table 1, 2).
후속연구
이 연구결과는 포르말린에 의해 유발된 체성 심부통증의 기전과 아스피린의 효과를 이해하는데 기초적인 자료로 이용될 수 있을 것으로 생각된다.
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