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문제 정의
- 따라서, 본 연구는 그람 음성세균의 LPS에 의한 기도 점액 과생성의 기전을 밝히고, LPS에 의한 기도 점액 과분비에서 EGFR의 신호 전달에 대한 연구와 G-protein과 세포막의 신호 전달과정에 대한 연구를 하였다.
- HB-EGF의 유리는 G-protein과 연관이 있다. 따라서, 본 연구는 그람 음성세균의 lipoiDolysaccaride(LPS) 에 의한 기도 점액 과생성의 기전을 밝히고, 기도 점액 과분비에서 EGFR과 G-protein의 연관성을 밝혀 기도 점액 과분비 기전을 밝히고자 한다.
제안 방법
- MUC5AC의 생성에서 G-protein과 EGFR의 연관성을 확인 하기 위하여 EGFR이 항상 발현되어 있고 MUC5AC를 분비할 수 있는 NCI-H292 세포에 G-protein 자극제 인 masto -paran-7로 자극한 후 MUC5AC의 생성을 측정하였다. G-protein이 활성화하여 metalloproteinase 가 세포막에 있는 HB-EGF를 유리하여 EGFR이 활성화하여 MUC5AC가 생성여부를 확인하기 위하여 ADAM10 으로 NCI-H292세포에 자극하여 MUC5AC의 생성을 측정하였다. MUC5AC 생성이 EGFR과 연관성을 확인하기 위하여 특이 EGFR tyrosine kinase 억제제인 AG1478고} 중화 poly clonal EGF 항체를 전처치 후 MUC5AC를 측정하였다.
- ELISA 법으로 측정하였다. LPS 에 의한 MUC5AC 당단백질의 생성 기전을 밝히기 위해서 heterotrimeric G-protein 억 제 제 인 mastoparan 을 투여하고 TNF-a 와 MUC5AC를 ELISA법으로 각각 측정하였다. MUC5AC의 생성에서 G-protein과 EGFR의 연관성을 확인 하기 위하여 EGFR이 항상 발현되어 있고 MUC5AC를 분비할 수 있는 NCI-H292 세포에 G-protein 자극제 인 masto -paran-7로 자극한 후 MUC5AC의 생성을 측정하였다.
- LPS(Sigma, St. Louis, MO, USA)를 0.5, 1 또는 2 陽/md의 농도로 24시간 배양하여 NCI-H 田 92세 포로부터 MUC5AC의 생성여부를 확인하였다. LPS에 의한 MUC5AC의 생성에서 신호 전달을 확인하기 위하여 각종 신호 전달 억제제를 사용하였다.
- 5, 1 또는 2 陽/md의 농도로 24시간 배양하여 NCI-H 田 92세 포로부터 MUC5AC의 생성여부를 확인하였다. LPS에 의한 MUC5AC의 생성에서 신호 전달을 확인하기 위하여 각종 신호 전달 억제제를 사용하였다. EGFR tyrosine kinase의 선택 억제제인 AG 1478 (10 “M; Calbiochem, San Diego, CA, USA), 중화 polyclonal TNF- a 항체 (anti-human TNF- a neutralizing antibody; R & D systems, Minne apolis, MN, USA), heterotrimeric G-protein 억제제 인 mastoparan(Quality Control Biochemicals, Hopkinton, MA, USA)을 각각 사용하였다.
- G-protein이 활성화하여 metalloproteinase 가 세포막에 있는 HB-EGF를 유리하여 EGFR이 활성화하여 MUC5AC가 생성여부를 확인하기 위하여 ADAM10 으로 NCI-H292세포에 자극하여 MUC5AC의 생성을 측정하였다. MUC5AC 생성이 EGFR과 연관성을 확인하기 위하여 특이 EGFR tyrosine kinase 억제제인 AG1478고} 중화 poly clonal EGF 항체를 전처치 후 MUC5AC를 측정하였다.
- LPS 에 의한 MUC5AC 당단백질의 생성 기전을 밝히기 위해서 heterotrimeric G-protein 억 제 제 인 mastoparan 을 투여하고 TNF-a 와 MUC5AC를 ELISA법으로 각각 측정하였다. MUC5AC의 생성에서 G-protein과 EGFR의 연관성을 확인 하기 위하여 EGFR이 항상 발현되어 있고 MUC5AC를 분비할 수 있는 NCI-H292 세포에 G-protein 자극제 인 masto -paran-7로 자극한 후 MUC5AC의 생성을 측정하였다. G-protein이 활성화하여 metalloproteinase 가 세포막에 있는 HB-EGF를 유리하여 EGFR이 활성화하여 MUC5AC가 생성여부를 확인하기 위하여 ADAM10 으로 NCI-H292세포에 자극하여 MUC5AC의 생성을 측정하였다.
- MUC5AC의 생성에서 G-protein과 EGFR의 연관성을 확인 하기 위하여 EGFR이 항상 발현되어 있고 MUC5AO 분비할 수 있는 NCI-H292 세포에 G-protein 자극제인 mastoparan-7로 자극한 후 MUC5AC의 생성을 측정하였다. 다양한 농도의 mastoparan-7는 MUC5AC의 생성이 mastoparan -7의 농도에 따라 유의하게 증가되었다(Fig.
- 배양하였다. NCI-H292 세포가 약 95% 이상의 confluency를 나타낼 때 실험을 진행하였고, ADAM 10의 실험에서는 NCI-H292세포를 10% FBS가 포함되지 않고, 100U/ml의 페니실린과 100 “g/ml의 스트렙토마이신 및 25mM HEPES가 포함된 RPMI 1640의 배양액으로 실험하였다.
- 또한 G-protein°] metalloproteinase를 활성화하여 HB-EGF를 유리하여 EGFR을 transactivation함을 확인하기 위하여 다양한 농도의 matrix metallopro -teinase인 ADAM10 (R & D systems, Minne apolis, MN, USA)을 전처치한 후 중화 polyclonal EGF 항체 (anti-human TGF-a rabbit polyclonal antibody(Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA)를 사용하였다.
- MUC5AC의 생성에서 G-proteir과 EGFR의 연관성에 대한 실험에서 MUC5AC의 생성이 mastoparan-7의 농도에 따라 유의하게 증가되었으며, EGF의 중화항체를 사용한 경우는 MUC5AC의 생성이 감소되었다. 또한 Matrix metalloproteinase인 ADAMIO의 농도에 비례하여 MUC5AC의 생성을 증가시켰다.
- ' 는 가설 하에 실험을 하였다. 이를 증명하기 위하여 우선 metal loproteinasee ADAM 10으로 NCI-ffi92세포에 자극하여 MUC5AC의 생성을 측정한 결과 ADAM 10의 농도에 비례하여 MUC5AC의 생성을 증가시켰다(Fig. 5). G-protein 자극제인 mastoparan-7을 NCI-H292세포에 자극하였을 때 MUC5AC의 생성이 유의하게 증가되었으며, EGF의 중화항체를 사용한 경우는 MUC5AC의 생성이 감소되었다(Fig.
- 점액 생성에서 G-protein과의 연관성을 확인하기 위하여 다양한 농도의 G-protein 자극제 인 Masto -paran-7 (Calbiochem; San Diego, CA, USA)으로자극하여 MUC5AC의 생성을 확인하였다. 또한 G-protein°] metalloproteinase를 활성화하여 HB-EGF를 유리하여 EGFR을 transactivation함을 확인하기 위하여 다양한 농도의 matrix metallopro -teinase인 ADAM10 (R & D systems, Minne apolis, MN, USA)을 전처치한 후 중화 polyclonal EGF 항체 (anti-human TGF-a rabbit polyclonal antibody(Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA)를 사용하였다.
대상 데이터
- LPS에 의한 MUC5AC의 생성에서 신호 전달을 확인하기 위하여 각종 신호 전달 억제제를 사용하였다. EGFR tyrosine kinase의 선택 억제제인 AG 1478 (10 “M; Calbiochem, San Diego, CA, USA), 중화 polyclonal TNF- a 항체 (anti-human TNF- a neutralizing antibody; R & D systems, Minne apolis, MN, USA), heterotrimeric G-protein 억제제 인 mastoparan(Quality Control Biochemicals, Hopkinton, MA, USA)을 각각 사용하였다.
- 점액상피세포양 폐암의 NCI-H田92세포를 10% FBS, 100U/ml의 페니실린과 100 “g/ml의 스트렙토마이신 및 25mM HEPES 가 포함된 RPMI 1640의 배양액으로 37℃ 에서 5%이산화탄소 water-jacket의 세포배양 기로 배양하였다. NCI-H292 세포가 약 95% 이상의 confluency를 나타낼 때 실험을 진행하였고, ADAM 10의 실험에서는 NCI-H292세포를 10% FBS가 포함되지 않고, 100U/ml의 페니실린과 100 “g/ml의 스트렙토마이신 및 25mM HEPES가 포함된 RPMI 1640의 배양액으로 실험하였다.
데이터처리
- 모든 결과는 mean士SE로 표시하였다. 각 군 간의 비 교는 nonparametric Mann-Whitney U test로 비교하여, P 값이 0.05 이하이면 유의한 것으로 판단하였다.
이론/모형
- NCI-H292 세포를 24시간 배양한 후 배양액과 lysis buffer(l% Triniton X-100, 1% deoxycholic acid, 50 mM NaF, ImM sodium orthovandate, proeinase inhibitor in PBSX 이용한 세포내의 MUC5AC에 대한 당단백을 ELISA법으로 측정하였다”. TNF-a 는 회사 (Genzyme; Cambridge, MA, USA)에서 제시한 ELISA법으로 측정하였다.
- NCI-H292 세포배양에서 LPS 단독 투여 또는 TGF-a 오] 병합 투여한 후 MUC5AC의 당단백질을 ELISA 법으로 측정하였다. LPS 에 의한 MUC5AC 당단백질의 생성 기전을 밝히기 위해서 heterotrimeric G-protein 억 제 제 인 mastoparan 을 투여하고 TNF-a 와 MUC5AC를 ELISA법으로 각각 측정하였다.
- TNF-a 는 회사 (Genzyme; Cambridge, MA, USA)에서 제시한 ELISA법으로 측정하였다.
성능/효과
- 또한 matrix metalloproteinase 의 일종인 ADAM 10으로 자극한 경우에 농도에 비례하여 MUC5AC의 생성이 증가되었다. 이를 종합하여 보면 Prenzel"과 Dong"의 연구와 같이 G-protein의 활성은 matrix metalloproteinase에 의하여 EGFR 의 ligand를 유리시켜 EGFR의 세포 내 신호전달로 이어져 MUC5AC가 생성됨을 알 수 있었다(Fig. 7).
- 5). G-protein 자극제인 mastoparan-7을 NCI-H292세포에 자극하였을 때 MUC5AC의 생성이 유의하게 증가되었으며, EGF의 중화항체를 사용한 경우는 MUC5AC의 생성이 감소되었다(Fig. 5). 이로써 G-protein의 자극제인 mastoparan-7은 EGFR을 transactivation시켜서 MUC5AC의 생성이 증가됨을 알 수 있었다.
- G-protein의 활성은 matrix metalloproteinase를 유리하는 것으로 보고되었고, 유리된 matrix metalloproteinase는 세포막에 존재하는 pro-HB-EGF를 분리하여 HB-EGF를 유리하여 EGFR을 transactivation하는 것으로 알려져 있다以也 본 연구에서 G-protein자극제 인 mastoparan-7의 농도에 비례하여 MUC5AC의 생성이 증가하였고, mastoparan-7의 자극에 증가된 MUC5AC는 중화 EGF 항체를 전처치한 경우에 유의하게 감소되었다(Fig. 4). 또한 matrix metalloproteinase 의 일종인 ADAM 10으로 자극한 경우에 농도에 비례하여 MUC5AC의 생성이 증가되었다.
- LPS의 자극에 의한 MUC5AC의 생성은 LPS 농도에 유의하게 증가 되지 않았으나, EGFR의 ligand 인 TGF-a 를 동시 투여한 경우는 LPS의 농도에 비례하여 유의하게 증가하였다(Fig. 1). LPS의 자극은 TNE, a의 생성을 유의하게 증가시켰으며, G-protein 억제제인 mastoparan을 전처치한 경우는 TNF-a 가 유의하게 감소 되었다(Fig.
- 1). LPS의 자극은 TNE, a의 생성을 유의하게 증가시켰으며, G-protein 억제제인 mastoparan을 전처치한 경우는 TNF-a 가 유의하게 감소 되었다(Fig. 2). 이는 LPS에 의한 TNI, 。의 생성은 G-protein에 의하여 매개됨을 알 수 있었다.
- 하여 유의하게 증가하였다. LPS의 자극은 TNF* 의 생성을 유의하게 증가시켰으며, G-protein 억제제인 mastoparan을 전처치한 경우는 TNF-a 가 유의하게 감소 되었다. LPS 자극 전에 TNF-a antibody, AG1478 또는 mastoparan을 전 처치한 경우는 MUC5AC의 생성이 유의하게 억제되었다.
- LPS 자극 전에 TNF-a antibody, AG1478 또는 mastoparan을 전 처치한 경우는 MUC5AC의 생성이 유의하게 억제되었다. MUC5AC의 생성에서 G-proteir과 EGFR의 연관성에 대한 실험에서 MUC5AC의 생성이 mastoparan-7의 농도에 따라 유의하게 증가되었으며, EGF의 중화항체를 사용한 경우는 MUC5AC의 생성이 감소되었다. 또한 Matrix metalloproteinase인 ADAMIO의 농도에 비례하여 MUC5AC의 생성을 증가시켰다.
- 따라서, 이와 같은 G-protein이 활성화가 HB-EGF의 유리를 통하여 배상세포의 이형성을 유발함으로써, 기관지 점액의 과다 분비의 세포 내 기전에 있어서 주요한 역할을 할 것으로 사료된다.
- 이는 LPS에 의한 TNI, 。의 생성은 G-protein에 의하여 매개됨을 알 수 있었다. 또한 LPS 자극 전에 TNF- a antibody로 중화한 경우와 nastoparan을 전처 치한 경우는 농도에 비례하여 MUC5AC의 생성이 유의하게 감소하였으며, EGFR tyrosine kinase inhibitor를 사용한 경우는 MUC5AC의 생성이 유의하게 억제되었다(Fig. 3). 이로써 LPS에 의한 MUC5AC의 분비는 LPS가 TNF-a 를 생성시키고, TNT、a 가 EGFR 의 발현을 유도하여 MUC5AC가 분비되는 것으로 사료된다.
- 4). 또한 matrix metalloproteinase 의 일종인 ADAM 10으로 자극한 경우에 농도에 비례하여 MUC5AC의 생성이 증가되었다. 이를 종합하여 보면 Prenzel"과 Dong"의 연구와 같이 G-protein의 활성은 matrix metalloproteinase에 의하여 EGFR 의 ligand를 유리시켜 EGFR의 세포 내 신호전달로 이어져 MUC5AC가 생성됨을 알 수 있었다(Fig.
- 본 연구에서 LPS에 의한 MUC5AC의 분비는 LPS 가 TNF*를 생성시키고, TNF-a가 EGFR의 발현을 유도하였으며, EGFR의 ligand를 투여하는 경우에 EGFR이 활성되어 MUC5AC가 분비되었다. 또한 LPS에 의한 TNF-a의 생성은 G-protein을 통하여 생성되었다.
- 본 연구에서도 LPS에 의하여 TNF-a의 생성이 LPS의 농도에 비례하이 증가하였고, hete rotrimeric G-protein의 억제제인 mastoparan을 투여한 경우는 LPS에 의한 TNF-a의 생성이 감소하였다. LPS에 의한 TNF-a의 생성이 증가하였음에도 불구하고, LPS에 의한 MUC5AC의 생성은 유의하게 증가되지 않았다.
- 5). 이로써 G-protein의 자극제인 mastoparan-7은 EGFR을 transactivation시켜서 MUC5AC의 생성이 증가됨을 알 수 있었다.
- 그러나, LPS와 일정량 (20 ng/戒) EGFR의 ligand인 TGF」z 를 동시에 투여한 경우는 MUC5AC의 생성이 증가되었고, LPS에 의하여 증가된 MUC5AC는 중화 TNF-a 항체 또는 EGFR tyrosine kinase inhibitor0!] 의하여 감소되었다. 이를 종합하여 보면 LPS는 TNF-a 의 생성으로 EGFR 의 발현을 유도하였지만 EGFR이 활성되지 않았으나, 외부에서 준 TGF-tz 에 의하여 EGFR이 활성되어 MUC5AC의 생성이증가되었다. Lamjabbai*등에 의하면 그람 양성 균과는 달리 LPS는 EGFR계와 상관없는 다른 세포 신호 전달이 일어 나는 것으로 설명하여 본 연구와 상의한 결과를 얻었다.
- 이상의 결과로 기관지 점액 과분비 질환에서 LPS는 TNF-a 를 통하여 EGFR의 발현을 증가 시켜 MUC5AC의 생성에 EGFR계가 작용함을 알 수 있었고, G-proteine matrix metalloproteinase에의하여 EGF의 ligand를 유리하여 EGFR계가 활성화 되어 MUC5AC가 생성되었다. 향후 점액의 생성에서 세포 내 신호 전달이 구체적으로 밝혀지면, 점액 과분비 호흡기 질환의 근치 치료 약제 개발이 가능할 것으로 사료된다.
후속연구
- Lainjabbar의 실험은 LPS어】 의하여 TNF-a 가 유리되고, TNF-a 는 EGFR의 발현을 증가하여도 EGFR의 ligand의 부족으로 EGFR이 활성화가 일어나지 않았을 가능성이 있다. 본 연구와 실험 조건의 차이로 상이한 결과를 얻었을 것으로 추정할 수 있으나, 향후 연구가 더 필요하다.
- AC가 생성되었다. 향후 점액의 생성에서 세포 내 신호 전달이 구체적으로 밝혀지면, 점액 과분비 호흡기 질환의 근치 치료 약제 개발이 가능할 것으로 사료된다.
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