선택한 단어 수는 입니다.
최소 단어 이상 선택하여야 합니다.
최소 단어 이상 선택하여야 합니다.
선택한 단어 수는 30입니다.
최대 10 단어까지만 선택 가능합니다.
최대 10 단어까지만 선택 가능합니다.
문제 정의
- 본 연구에서는 우리나라 결핵 환자들의 아이나와 리팜피신 내성에 관련되어 있는 유전자의 분포를 분석하고 이 중 아이나와 리팜피신 내성에 가장 관련성이 높은 유전자를 선택하여 해당 유전자의 돌연변이를 역교잡반응법(Reverse hybridization technique)을 이용하여 내성균 검출을 시도하였고, 이 방법이 직접 임상검체에 적용할 수 있는지를 평가하였다.
제안 방법
- 반응시켰다. Probe와 교잡된 중합 효소 연쇄반응 산물은 streptavidin-alkaline phospha-tase를 처리한 다음 NBWCIP 기질로 발색시켰다.
- 1에 나타내었다. 돌연변이 검출을 위한 probe는 rpoB 유전자의 핵심부위 81 bp (codons 507-533), katG 유전자의 codon 315, inhA 유전자와 ahpC 유전자의 promoter 부위에서 정상적인 염기서열과 돌연변이 염기서열을 바탕으로 합성하였다.
- 아이나 또는 리팜피신 내성에 관련된 유전자 rpoB, katG, inhA, ahpC 등의 돌연변이를 검출할 수 있는 probe를 합성하였고, 총 502개의 내성균을 대상으로 중합효소연쇄반응 역교잡반응법으로 내성균 검출을 시도하였다.
- 중합 효소 연쇄반응은 Perkin Elmer 480 DNA Thermal Cycler (Perkin Elmer, Norwalk, CT. 06859 USA) 제품을 사용하여 실시하였다. 처음 denaturation 반응은 95℃ 에서 10분 하였고, 이후 95℃ 1분, 65℃ 1 분, 72℃ 2분씩 중합효소 연쇄반응을 30회 반복 하였으며 마지막 extention 반응으로는 72 ℃ 10분을 실시하였다.
대상 데이터
- 본 연구에 사용된 502 내성균주는 1998년부터 결핵연구원에 약제 감수검사가 의뢰된 균주 중에서 검사 결과 아이나 또는 리팜피신에 내성인 균을 선택하였다. 502주는 아이나와 리팜피신에 동시 내성인 다제내성균을 231주, 아이나 단독내성균이 167주 리팜피신을 제외한 아이나와 다른 약제 동시 내성을 가진 균주가 기주, 리팜피신 단독 내성균이 26주, 아이나를 제외한 리팜피신과 여타 다른 약제에 동시 내성인균 7주 등으로 이루어졌다.
이론/모형
- 약제 감수성 검사는 Lowenstein Jensen (LJ) 배지를 이용한 내성비율법에 따라서 실시하였다5. 약제 함유 농도는, 아이나 0.
- 여러 유전자 돌연변이 검출을 위한 역교잡반응은 Kox 등의 방법을 적용하였다& 간단히 서술하면, pebe들은 dTTP로 tailing하여 나일론막 (Amer-sham Pharmacia Biotech, Buckinghamsliire, England) 에 고착시키고 cross blotter 기구(Accutran-Cross ACC 100/0; Sclileicher & Schuell, Dassel, Germany)를 이용하여 중합효소연쇄반응 산물을역교잡으로 반응시켰다. Probe와 교잡된 중합 효소 연쇄반응 산물은 streptavidin-alkaline phospha-tase를 처리한 다음 NBWCIP 기질로 발색시켰다.
- 2 mcg/ml, 리팜피신 40 mcg/ml, 스트렙토마이신 10 mcg/ml, 에탐부톨 2 mcg/ml, 가나마이신 40 mcg/ml, 엔비오마이신 40 mcg/ml, 프로치오나마이드 40 mcg/ml, 사이훌로세린 30 mcg/ml, 파스 1 mcg/ml, 오플로삭신 2 mcg/ml로 하였다. 피라지나마이드는 pyrazinami-dase test로 감수성검사를 실시하였다‘
성능/효과
- 264개의 리팜피신 내성균 중에서 Ser&lLeu돌연변이가 46%를 차지하였고, codon 526 에서는 32%의 균주에서 돌연변이를 보였으며, codon 516에서는 10%의 균주가 돌연변이를 나타냈다 469개의 아이나 내성균 중에서는 64%가 katG 유전자의 Ser315Thr 돌연변이를 나타내었고, 19%의 균은 inhA 유전자 promoter 돌연변이를 가지고 있었으며, q 知 C 유전자 돌연변이는 3%에 불과하였다. 역교잡반응법에 의한 검출율은 아이나 내성균 중 80% 이상이었으며, 리팜피신 내성균에서도 92%이상을 검출할 수 있었다.
- 이 중에는 중복 돌연변이를 나타내는 균주가 3주가 포함되어 있다. 그리고 이 세 가지 유전자에서 검출할 수 없었던 균주는 30주(12.6%) 로(Table 3), 역교잡반응법으로 검출할 수 없는 균이 다제내성균(21.6%)보다 유의하게 낮았다 (p<0.01).
- 다제내성균주 231균주와 그외 리팜피신 내성균 33주의 돌연변이 분포는 다음과 같았다. 다제내성균 231주 중에서, Ser531Leu 돌연변이가 105주 (45.5 %)이었고, 75주(32.5%)는 526 codon에서 나타났다. Asp516Val 돌연변이는 25주이었고, Leu511Pro 는 4주, Gln513Leu 는 3주, Ser522Leu 는 3주, Leu533Pro는 1주이었다.
- 5%)는 아무런 돌연변이가 없었다. 다제내성균이 아닌 리팜피신 내성균 33주의 돌연변이 분포에서는, 역시 Ser531Leu 돌연변이가 16주(48.4%)로 가장 많았었고, 두 번째로 많은 돌연변이는 526 codon에서 9주(27.2%)이었다. Asp516Val 돌연변이는 2주(6.
- 본 연구에서 사용한 유전자 검출방법만으로도 리팜피신 내성균의 92%이상을 아이나 내성균의 83% 를 검출할 수 있으므로 이 방법은 다제내성균을 의조기 검출에 매우 유용한 것으로 판단 되었다.
- 본 연구에서는 Ser531Leu 돌연변이가 46%이었고, His526Tyr 돌연변이가 13%이었고, I-Iis526Asp 돌연변이가 4%이었으며, 그 외 526 codon 돌연변이가 14%이었는데, 이 결과는 우리나라에서 분리된 균주로 실험하였던 박 등, 김 등의 결과와 비슷하였다. KF 박 등의 결과에서는 Ser531Leu 돌연변이가 47%이었고, His526Tyr 돌연변이가 12%이었고, His526Asp 돌연변이가 7%이었으며김 등의 결과에서는 Ser531Leu 돌연변이가 24.
- 비록 Type II Fatty Acid Synthe-tase(FAS) system 의 InhA, KasA(ketoacyl ACP synthase), AcpM(acyl carrier protein specific for long chain fatty acids)의 돌연변이가 아이나 내성을 줄 가능성은 있지만26, 이들 중에서 현재까지는 inhA 유전자 돌연변이만 아이나 내싱과 관련이 있는 것으로 확인되었다. 본 연구에서는 inhA 돌연변이 비율이 18.7%로서 South Africa에서 분리된 균으로 실험한 KQepiela의 결괴-(24%产 보다 다소 낮았다.
- 아이나 내성균을 역교잡법으로 검출하기 위해서 katG probe 2개, inhA probe 2개, ahpC probe 3개를 사용하여 아이나 내성균의 82.9%를 성공적으로 검출할 수 있었다.
- 역교잡반응법에 의한 검출율은 아이나 내성균 중 80% 이상이었으며, 리팜피신 내성균에서도 92%이상을 검출할 수 있었다.
- 역교잡반응법에 의해 리팜피신 뿐만 아니라 아이나에 대한 감수성검사를 신속하게 수행할 수 있음을 확인하였고, 이 검사법은 특히 재발 또는 다제내성이 의심되는 환자의 처방 결정에 매우 유용한 수단이 될 수 있다.
- 이를 다제내성균과 다제내성이 아닌 아이나 내성 균주로 나누어 보면, 다제내성균 231주의 분포에서는, katG 돌연변이는 142주(61.5%)이었고, inhA 돌연변이는 39주(16.9%)이었으며 ahpC 돌연변이는 8주(3.5%)이었다. 이 중에는 중복 돌연변이를 나타내는 균주가 8주가 포함되어 있다.
- 중합효소 연쇄반응 산물은 예상대로 439bp로 나타났다 리팜피신 내성균주 264주 중에서 14개의 rpoB probe를 사용한 역교잡법에 의해서 총 244개의 돌연변이 균주(92.4%)를 검출할 수 있었다 돌연변이 분포를 보면 가장 많은 돌연변이는 Ser531Leu로서 121 균주(45.8%)이었다. Codon 526에서는 84주(31.
※ AI-Helper는 부적절한 답변을 할 수 있습니다.