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문제 정의
- 기존의 LAPS형 바이오센서의 감지막 고정화 방법인 고분자 지지체의 접착력, 여과문제, 생체 활성의 문제점을 보완하기 위하여 본 연구에서는 자기조립 단분자법으로 페니실린 감응막을 제작하였다[8-11].
- 본 연구에서는 제약 및 의학, 임상 분야에 매우 중요한 요소인 페니실린의 정량적 분석을 위하여, 광지시형 전위차 센서 기반의 측정 시스템을 구현하였으며, 페니실린나아제와의 효소 반응에 의한 응답 특성을 조사하였다. 또한, 페니실린 감지막의 유지를 위해 자기 조립단분자법을 도입하였으며 LabVIEW를 이용해 기존의 복잡한 측정 시스템을 간략히 하였다.
제안 방법
- 또한, 기존의 LAPS 측정 시스템에서 요구되는 Lock-in-Amp., A/D변환기, 전위차계, display부 등의 복잡한 하드웨어 부분을 Labview를 이용하여 소프트웨어적으로 구현하여 측정시스템을 간략히 하여 페니실린에 대한 감응 측정을 평가하였다.
- Si3N4 감지막에 페니실린나아제를 고정한 후 AFM 측정음 통해 반응의 견과를 관찰하였다. 분석 결과는 그림 7(a), (b)와 같으며 약 50~70 A의 두께를 가지는 페니실린나아제가 고정화 되었음을 확인할 수 있었다.
- 감지막 표면에 생체 물질을 고정하기 위해, 우선 0.4 M EDC와 0.1 M NHS를 포함하는 0.3 M GA 메탄올 용액에서 3시간 반응시킨 후, 0.4 M EDC, 0.1 M NHS가 포함된 20 ml의 PBS 완충용액에 소자률 넣고 2시간 반응시켰다. 접속인자층 제조가 완성되면 페니실린나아제를 고정하기 위하여 20ml의 PBS 완충용액에 10mg의 페니실린나아제(β-Lactamase from Bacilluscereus, 10000 units/mg, Aldrich)가 포함된 페니실린나아제 용액에 15시간 반응시켜 Si3N3막에 효소를 고정하였다.
- 따라서 본 연구에서는 기존 측정시스템을 간략화하기 위해 National Instrument사의 Labview를 이용하여 복잡한 하드웨어부분을 소프트웨어적으로 처리하여 전체 시스템을 간략히 하였다.
- 본 연구에서 제작된 측정 시스템은 그림 3에서와 같이 940 nm LED를 광원으로 사용하여 1 kHz로 변조된 광을 조사하였다. 또한 제어전극으로는 백금(Pt), 기준 전극으로 Ag/AgCl 전극을 사용하였으며, 센서에서 발생된 신호는 DAQ board를 통해 PC내로 인가되도록 하였다. 발생된 광전류의 신호 처리회로와 전위차계 디스플레이부는 그림 4와 같다.
- 본 연구에서는 제약 및 의학, 임상 분야에 매우 중요한 요소인 페니실린의 정량적 분석을 위하여, 광지시형 전위차 센서 기반의 측정 시스템을 구현하였으며, 페니실린나아제와의 효소 반응에 의한 응답 특성을 조사하였다. 또한, 페니실린 감지막의 유지를 위해 자기 조립단분자법을 도입하였으며 LabVIEW를 이용해 기존의 복잡한 측정 시스템을 간략히 하였다.
- 본 연구에서 제작된 측정 시스템은 그림 3에서와 같이 940 nm LED를 광원으로 사용하여 1 kHz로 변조된 광을 조사하였다. 또한 제어전극으로는 백금(Pt), 기준 전극으로 Ag/AgCl 전극을 사용하였으며, 센서에서 발생된 신호는 DAQ board를 통해 PC내로 인가되도록 하였다.
- 광지시형 전위차 센서의 기판으로 사용되는 실리콘 웨이퍼는 p형 웨이퍼(ρ = 6 ~ 12Ω • cm), 직경이 5인치(100)를 사용하였다. 우선, 건식 산화법으로 950℃에서 약 300 A정도의 게이트 산화막을 성장시키고, 감지막으로 사용되는 실리콘 질화막은 790℃에서 LPCVD법으로 약 800 A의 두께로 산화막 위에 증착하였다. 실리콘 웨이퍼 뒷면의 산화막과 실리콘 질화막은 건식 식각법으로 제거하고 열 증착법으로 Au 전극을 증착한 후, photolithogr aphy 방법으로 광지시 부분을 형성하였다.
- 이를 위하여 말단에 아민그룹을 가진 실란화합물 APTMS(aminoprophyltrimethoxy silane)와 Glutaric acid를 사용하여 센서표면과 페니실린나아제가 고정되도록 하였다. 이러한 방법은 감지막이 안정성을 유지할 수 있으며, 효소를 포함한 모든 단백질이 아마이드본드를 주된 결합으로 이루어지므로, 페니실린나아제의 생체활성에 영향을 주지 않는 장점을 가진다.
- . 이를 위하여 말단에 아민그룹을 가진 실란화합물 APTMS(aminoprophytrimethoxysilane)와 Glutaricacid를 사용하여 센서표면과 페니실린나아제가 고정되도록 하였다. 이러한 방법은 감지막이 안정성을 유지할 수 있으며, 효소를 포함한 모든 단백질이 아마이드본드를 주된 결합으로 이루어지므로, 페니실린나아제의 생체활성에 영향을 주지 않는 장점을 가진다[12,13].
- 1 M NHS가 포함된 20 ml의 PBS 완충용액에 소자률 넣고 2시간 반응시켰다. 접속인자층 제조가 완성되면 페니실린나아제를 고정하기 위하여 20ml의 PBS 완충용액에 10mg의 페니실린나아제(β-Lactamase from Bacilluscereus, 10000 units/mg, Aldrich)가 포함된 페니실린나아제 용액에 15시간 반응시켜 Si3N3막에 효소를 고정하였다. 전체 반응에 대한 모식도는 그림 5와 같다.
- 페니실린나아제가 부착된 LAPS 소씨를 시료 충전 셀 내에 상착하고, 준비된 페니실린 G 용액을 완충 용액부터 높은 농도 순으로, 일정 시간간격을 두고 주입하면서 인가전압에 대한 광전류 곡선의 변화를 측정하였다. 이때 사용된 페니실린 G 용액은 pH 7, Tris 완충용액에 페니실린 G (Potassium salt, 1600unit/mg, Aldrich)를 첨가하여 0.
대상 데이터
- 광지시형 전위차 센서의 기판으로 사용되는 실리콘 웨이퍼는 p형 웨이퍼(ρ = 6 ~ 12Ω • cm), 직경이 5인치(100)를 사용하였다. 우선, 건식 산화법으로 950℃에서 약 300 A정도의 게이트 산화막을 성장시키고, 감지막으로 사용되는 실리콘 질화막은 790℃에서 LPCVD법으로 약 800 A의 두께로 산화막 위에 증착하였다.
- 형성된 전극은 360℃, 질소 분위기에서 약 30분간 열처리하여 센서소자를 제작하였다. 제작된 센서의 크기는 20x20mm이며 감지 영역은 10x10mm로 정의하였다.
이론/모형
- 따라서, 본 연구에서는 이러한 단점을 해결하기 위하여 자기조립 단분자법을 이용하여 페니실린 감응막을 제작하였다[12]. 이를 위하여 말단에 아민그룹을 가진 실란화합물 APTMS(aminoprophytrimethoxysilane)와 Glutaricacid를 사용하여 센서표면과 페니실린나아제가 고정되도록 하였다.
- 우선, 건식 산화법으로 950℃에서 약 300 A정도의 게이트 산화막을 성장시키고, 감지막으로 사용되는 실리콘 질화막은 790℃에서 LPCVD법으로 약 800 A의 두께로 산화막 위에 증착하였다. 실리콘 웨이퍼 뒷면의 산화막과 실리콘 질화막은 건식 식각법으로 제거하고 열 증착법으로 Au 전극을 증착한 후, photolithogr aphy 방법으로 광지시 부분을 형성하였다. 형성된 전극은 360℃, 질소 분위기에서 약 30분간 열처리하여 센서소자를 제작하였다.
성능/효과
- 소자에 생체물질을 고정하기에 앞서, 기판의 유기물을 제거하고 접속인자층을 효과적으로 제조하기 위하여 감지막인 Si3N4 박막의 전처리가 필요하며, 이러한 과정을 통하여 고체 기판의 산화물이나 불순물을 제거할 뿐만 아니라 감지막 표면에 하이드록실기를 생성시킴으로써 접속인자층과의 반응성을 증가시킬 수 있었다. 전처리 과정의 세부실험은 다음과 같이 진행하였다.
- 측정 결과, 1 mM 이하의 페니실린 G 농도 범위에서는 반응 후 평형에 이르기까지 1분 이하의 시간이 소요되었으며, 그 이상의 농도범위에서는 대략 5분 내의 시간이 소요되었다. 또한 그림 11은 위의 결과를 페니실린 G 농도에 따른 바이어스 전압의 변화 로 나타낸 결과로써 약 60 mV/decade의 감도를 나타내었다.
후속연구
- 본 연구결과는 LAPS 센서 시스템을 이용하여 생화학적 물질의 정밀한 감지가 가능함을 보여주었으며, 각종 약품, 항생제 분석 및 발효과정을 관측하고 검사하는데 매우 유 용하게 사용될 것으로 판단된다. 또한 이를 바탕으로, LAPS의 특징인 광지시 위치에 따른 응답 특성을 이용한다면 병원성 미생물의 2차원 농도 분포나 확산속도 분석이 가능한 이미지 센서뿐만 아니라 최근 관심의 대상이 되고 있는 DNA 칩, 단백질 칩에도 응용 가능할 것으로 기대된다.
- 본 연구결과는 LAPS 센서 시스템을 이용하여 생화학적 물질의 정밀한 감지가 가능함을 보여주었으며, 각종 약품, 항생제 분석 및 발효과정을 관측하고 검사하는데 매우 유 용하게 사용될 것으로 판단된다. 또한 이를 바탕으로, LAPS의 특징인 광지시 위치에 따른 응답 특성을 이용한다면 병원성 미생물의 2차원 농도 분포나 확산속도 분석이 가능한 이미지 센서뿐만 아니라 최근 관심의 대상이 되고 있는 DNA 칩, 단백질 칩에도 응용 가능할 것으로 기대된다.
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