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문제 정의
- KOH와 KOR의 메탄올 추출물의 항암효과를 실험적으로 입증하기 위하여 연구를 수행하였다. TLC상 국산 및 중국 산간에 성분과 함량의 차이가 있음을 알 수 있었다.
- 13-14)그러나 대부분이 중국산 백화사설초를 이용한 연구이며, 더욱 백화사설초의 뿌리 연구는 전혀 이루어지지 않았다. 최근 국내에서도 백화 사설 초를 제주도, 진주 및 무주에서 재배하고 있는 바, 효능 검색을 통해 향후 농민의 수익 증대를 위한 재배 약초가 가능한지를 평가하기 위한 일환으로 본 연구에서는 국내산 백화 사설 초의 전초 (KOH)와 뿌리 (KOR)를 이용하여 다양한 항암효과를 평가하여 유의한 결과를 보고하는 바이다.
가설 설정
- Effect of methanol extracts of Korean Oldenlandiae diffusa on the survival of S-180 tumor bearing ICR mice. H : Herba, R : Radix, 1250 : 1250㎎/㎏, 2500 : 2500 ㎎/㎏.
제안 방법
- ,37℃의 조건에서 24시간 배양하였다. 24시간 후 KOH와 KOR를 농도별로 처리하였으며 24시간 후에 세포를 수거하여 Trizol Reagent를 이용한 방법으로 RNA를 추출하였다.Total RNA 1에 oligo (dT)와 MMLV reverse trandcriptase를 첨가하여 25℃에서 10®-, 42℃에서 60분, 99℃에서 5분간 RT-PCR analysis로 cDNA를 합성하였다.
- 암의 전이를 용이하게 한다.25)KOH와 KOR의 항암 활성효과 중 항전이 실험으로 세포 외 기질 분해 효소인 uPA, MMP2, 그것의 억제인자인 TIMP2의 mRNA 발현을 보았다. KOH는 세포 외 기질 분해효소인 MMP2의 발현을 200(㎍/m에서부터 400pig/mZ까지 억제하는 효과를 나타냄을 확인하였으나, uRX와 TEMP2의 발현에서는 변화가 없었다.
- 또한 DNA topoisomerase I의 IC50 값을 결정하기 위해 relaxation assay를 실시하였다. 35 mM Tris-HCl (pH 8.0), 72 mM KC1, 5 mM MgCl2, 5 mM dithiothreitol, 5 mM spermidine, 0.01% bovine serum albumin을 함유하는 용액에 0.5 μg pBR 322 supercoiled DNA와 효소만 가하여 총반응액을 20 ㎕ 가 되게 한 것을 대조군으로 하고, 0.5 μg pBR 322 DNA와 효소와 KOH와 KOR를 가하여 총 반응액이 20|U되게 한 것을 실험군으로 하여 이들을 37℃에서30분간 배양하였다. 반응은 2% sodium dodecyl sulfate, 20% glycerol 및 0.
- 양성 대 조군으로 M199 media에 5 ng/m/ 의 basic fibroblast growth factor (bFGF)를 첨가한 배지를 사용하였으며, 이와 같은 배지에 K0H와 KOR를 희석하여 각 well에 농도별로 첨가한 후 HUVECs을 well당 4x 104으로균일하게 seeding하였다. 37℃, 5% CO2 조건으로 6시간 동안 배양하고 형성된 tube network를 사진 촬영하여 대조군과 비교하였다. 음성대조군에는 bFGF를 첨가하지 않았다.
- mobile solvents. CHC13 : MeOH 비율을 조절하여 TLCchamber에서 전개시켰으며, 이에 대한 UV 흡광도를 측정하였고, 10% 황산에 발색하였다.
- 이식 후 24시간부터 각 군당 7마리씩 배정 하였다. KOH와 KOR (1250㎎/㎏, 2500 ㎎/㎏)는 생리식염수로 용해시켜 만든 후 4℃에 보존하였으며 0.2 m/씩 일주일간 연속 투여하였으며 대조군에는 동량의 생리식염 수액을 투여하였다. 생존비 (T/C%)는 미국립 암연구소 p* rotocol' 에 언급된 식에 따라 계산하였다.
- 이에 합성된 cDNA에 uPA, MMP2, TIMP2 각각의 primer (Table I)를첨가하여 94℃ 3。초, 59℃ 30초, 72℃ 3。초의 패턴으로 30 회 반복한 후 72℃에서 5분간 PCR-I- 수행하였다. PCR<> 물을 agarose gel에서 전기영동한 후 UV하에서 각각의 band를 확인하였다.
- RT-PCR analysis for uPA, MMP2, and TIMP2 -HT1080 세 포를 well 당 5 x 1(/로 seeding하여 5% CO2,37℃의 조건에서 24시간 배양하였다. 24시간 후 KOH와 KOR를 농도별로 처리하였으며 24시간 후에 세포를 수거하여 Trizol Reagent를 이용한 방법으로 RNA를 추출하였다.
- 24시간 후 KOH와 KOR를 농도별로 처리하였으며 24시간 후에 세포를 수거하여 Trizol Reagent를 이용한 방법으로 RNA를 추출하였다.Total RNA 1에 oligo (dT)와 MMLV reverse trandcriptase를 첨가하여 25℃에서 10®-, 42℃에서 60분, 99℃에서 5분간 RT-PCR analysis로 cDNA를 합성하였다. 이에 합성된 cDNA에 uPA, MMP2, TIMP2 각각의 primer (Table I)를첨가하여 94℃ 3。초, 59℃ 30초, 72℃ 3。초의 패턴으로 30 회 반복한 후 72℃에서 5분간 PCR-I- 수행하였다.
- coli 600의 것을 사용하였다. 또한 DNA topoisomerase I의 IC50 값을 결정하기 위해 relaxation assay를 실시하였다. 35 mM Tris-HCl (pH 8.
- 1% gelatine0] coating된 plate에서 3 ng/m/ bFGF, 5 unit/m/ heparin, antibiotics가 첨가된 M199 배지에서 배양하였다. 모든 세포는 5% CO2, 37℃ 배양기에서 배양하였고, 암세포의 계대는 2-3일에 1회씩 하였으며 , monolayer 암주를 부착 면으로부터 분리하기 위하여 phosphate buffered saline 용액에 0.25% trypsin과 ED1A를 녹인 용액을 사용하였다.
- 5 μg pBR 322 DNA와 효소와 KOH와 KOR를 가하여 총 반응액이 20|U되게 한 것을 실험군으로 하여 이들을 37℃에서30분간 배양하였다. 반응은 2% sodium dodecyl sulfate, 20% glycerol 및 0.05% bromophenol blue를 포함하는 반응종결액 5 를 첨가하여 반응을 종결시키고 이를 TBE runningbuffer (50 mM Tris base, 50 mM boric acid, 2.5 mM EDIA)로 전기 영동을 한 후 agarose gel을 0.5 |ig/rW의 ethidium bromide용액에서 염색하여, 자외선하에서 사진을 찍었다.
- 백화사설초 중국산, 국내산 전초, 국내산 뿌리 메탄올 추출물의 TLC profile - CO (중국산 백화사설초), KOH, KOR 메탄올 추출물을 용매의 조건을 달리하여 TLC 패턴을 확인하였다. Fig.
- 암세포 부착저지 실험'1句 - Gelatin (0.1 %)이 coating된plate의 각 well에 HT1080 세포 (1 x 106/* well) KOH와KOR와 함께 처리한 다음 37℃ 배양기에서 대조군 세포들이 붙을 때까지 배 양하였다. 세포를 phosphate buffered saline로 조심스럽게 세척하고 MTT법 ")으로 well에 붙어있는 세포를 염색한 후, 570 nm에서 흡광도를 측정하였다.
- 세포를 phosphate buffered saline로 조심스럽게 세척하고 MTT법 ")으로 well에 붙어있는 세포를 염색한 후, 570 nm에서 흡광도를 측정하였다. 약재의 세포부착저지 활성은 대조군의 OD값과 비교하여 계산하였다.
- ) 20(%를 첨가하고 37℃에서 30분간 incubation흐]여 matrigel 을 굳혔 다. 양성 대 조군으로 M199 media에 5 ng/m/ 의 basic fibroblast growth factor (bFGF)를 첨가한 배지를 사용하였으며, 이와 같은 배지에 K0H와 KOR를 희석하여 각 well에 농도별로 첨가한 후 HUVECs을 well당 4x 104으로균일하게 seeding하였다. 37℃, 5% CO2 조건으로 6시간 동안 배양하고 형성된 tube network를 사진 촬영하여 대조군과 비교하였다.
- 1 nV씩 복강내에 이식하였다. 이식 후 24시간부터 각 군당 7마리씩 배정 하였다. KOH와 KOR (1250㎎/㎏, 2500 ㎎/㎏)는 생리식염수로 용해시켜 만든 후 4℃에 보존하였으며 0.
대상 데이터
- DNA topoisomerase I assay - 실험에 사용된 DNA topoisomerase Ie calf thymus에서 유래된 것이며, supercoiled pBR322 DNA는 E. coli 600의 것을 사용하였다. 또한 DNA topoisomerase I의 IC50 값을 결정하기 위해 relaxation assay를 실시하였다.
- 세포배양 - 암세포주인 HT1080 세포(ATCC, CRL-12011) 는 L-gulutamine이 포함된 RPMI 1640 배지에 56℃ 수조에서 30분간 가온하여 불활성화시 킨 fetal bovine serum을 10% 혼합하고, 1% 항생제 (antibiotics)와* NaHCO3 2 g을 첨가하여 제조된 배지에서 배양하였다. 정상 혈관 내피 세포인 human umbilical vein endothelial cells (HUVECs) 은삼성 산부인과에서 공급받<斗 primary culture한 것을 0.
- 실험약재 - KOH (GSM-20031103-I)와 KOR (GSM-20031103-2)fe- 진주의 대도농산에서 공급받았으며, powder 1kg씩을 상온에서 100% 메탄올 10 Z에 담가 3회 추출하였으며, 주줄물은 filter paper로 여과하여 rotary vacuum evaporator> 이용하여 감압 농축한 후 분말(Yield : KOH-3.65%, KOR-0.84%)을 얻었다.
- 2 g을 첨가하여 제조된 배지에서 배양하였다. 정상 혈관 내피 세포인 human umbilical vein endothelial cells (HUVECs) 은삼성 산부인과에서 공급받<斗 primary culture한 것을 0.1% gelatine0] coating된 plate에서 3 ng/m/ bFGF, 5 unit/m/ heparin, antibiotics가 첨가된 M199 배지에서 배양하였다. 모든 세포는 5% CO2, 37℃ 배양기에서 배양하였고, 암세포의 계대는 2-3일에 1회씩 하였으며 , monolayer 암주를 부착 면으로부터 분리하기 위하여 phosphate buffered saline 용액에 0.
이론/모형
- Tube formation assay - Grant et al. (1992)방법 '"에 의거하여 24 well plate에 matrigel (Bekton dickinson, U.S.A.) 20(%를 첨가하고 37℃에서 30분간 incubation흐]여 matrigel 을 굳혔 다. 양성 대 조군으로 M199 media에 5 ng/m/ 의 basic fibroblast growth factor (bFGF)를 첨가한 배지를 사용하였으며, 이와 같은 배지에 K0H와 KOR를 희석하여 각 well에 농도별로 첨가한 후 HUVECs을 well당 4x 104으로균일하게 seeding하였다.
- 2 m/씩 일주일간 연속 투여하였으며 대조군에는 동량의 생리식염 수액을 투여하였다. 생존비 (T/C%)는 미국립 암연구소 p* rotocol' 에 언급된 식에 따라 계산하였다.
- 세포독성 실험 - MTT 방법'을 이용하여 KOH와 KOR 의 메탄올 추출물의 세포 독성을 측정하였다. HT1080 세포를 1 X 1S가 되도록 하여 96 well plate에서 24시간 배양한 후 serum free 배양액에 메탄올 추출물을 여러 농도로 희석하여 1001〃씩 처리하였다.
성능/효과
- 분리되었다.')Epigallocathechin-3-gallate, resveratrol, lycopene 등은 각각 green tea, grape,tomatoe에서 분리되었고, ° 특히 항암제로 사용되고 있는taxol, etoposide, camptothecine Pacific yew (Taxus brevifolia)^ mayapple (Podophyllum peltatum)^, 4) camptotheca (Camptotheca acuminate)5^-^ 분리되었다. 백화 사설 초는 꼭두서니과(Rubiaceae)에 속하는 1년생 초본인 백운풀[Oldeplandia diffusa (Willd.
- 28-29) Angiostatine- endostatin을 투여하여 쥐에 유발된 종양의 성장이 억제되었다는 발표가 있은 후로 신생혈관형성의 억제가 종양의 새로운 치료방법으로 부각되었다.3。0)본 실험에서는 bFGF로 유도된 HUVECs의 tube formation assay에서 대조군에서는 tube가 많이 형성된 것에 반하여 KOH와 KOR 를 처리한 군에서는 모든 농도에서 음성대조군과 같이 tube 형성을 저해하였다(Fig. 4). 이는 KOH와 KOR가 혈관 형성을 차단시킴으로써 암의 성장을 억제할 것으로 추측되어진다.
- DNA topoisomerase I assay - DNA의 synthesis에 즈}용을 하여 세포의 증식을 억제하는 효능을 가지고 있는지의 여부를 확인하고자 DNA Topoisomerase I assay를 실행한 결과 Fig. 6에서 보는 바와 같이 DNA만을 처리한 실험군은 supercoiled form으로 나타났으며, DNA에 Topo-I을 처리한 대조군은 relaxed form으로 전환되었다. KOH와 KOR 모두 Topo-I의 활성을 억제하지 못한 것으로 보아 DNA synthesis에는 관여하지 않는 것으로 확인할 수 있었다.
- 25)KOH와 KOR의 항암 활성효과 중 항전이 실험으로 세포 외 기질 분해 효소인 uPA, MMP2, 그것의 억제인자인 TIMP2의 mRNA 발현을 보았다. KOH는 세포 외 기질 분해효소인 MMP2의 발현을 200(㎍/m에서부터 400pig/mZ까지 억제하는 효과를 나타냄을 확인하였으나, uRX와 TEMP2의 발현에서는 변화가 없었다. KOR는 세포 외 기질분해효소 중 하나인 uPA와 MMP2의 발현이 대조군에 비해 감소시킴을 확인할 수 있었으며, TIMP2의 발현을 증가시킴을 알 수 있었다(Fig.
- 6에서 보는 바와 같이 DNA만을 처리한 실험군은 supercoiled form으로 나타났으며, DNA에 Topo-I을 처리한 대조군은 relaxed form으로 전환되었다. KOH와 KOR 모두 Topo-I의 활성을 억제하지 못한 것으로 보아 DNA synthesis에는 관여하지 않는 것으로 확인할 수 있었다.
- KOH와 KORe bFGF로 유도된 사람 제대 내피세포 (HUVECs)의 tube formation을 유효하게 억제하였고, 동물실험에서도 S-180을 복강내에 이식시킨 마우스에서 KOH 와 KOR 모두 평균 생존일수를 증가시켰고, T/C %도 각각134.9% (KOH), 171% (KOR)로 증가시 킴으로써 KOH와 KOR이 모두 S-180 암의 성장을 저해함을 알 수 있었다.
- KOH는 세포 외 기질 분해효소인 MMP2의 발현을 200(㎍/m에서부터 400pig/mZ까지 억제하는 효과를 나타냄을 확인하였으나, uRX와 TEMP2의 발현에서는 변화가 없었다. KOR는 세포 외 기질분해효소 중 하나인 uPA와 MMP2의 발현이 대조군에 비해 감소시킴을 확인할 수 있었으며, TIMP2의 발현을 증가시킴을 알 수 있었다(Fig. 5). 이로써 K0H와 KOR는 전이에 관여하는 인자인 MMP 2의 발현을 저해함으로써 전이억제 효과를 나타낼 가능성을 보여주었다.
- S-180이 이식된 생쥐의 생존비에 미치는 효과 - S-180 이 이식된 생쥐에 KOH와 KOR의 메탄올 추출물을 7일간 경구 투여한 후 체중증가를 측정하였던 바, 복수암으로 인한 체중 증가는 대조군에서는 암주 이식 후 8일에 급격히 증가하여 10일에 모두 죽었다. 평균 생존일수 (MST)는 대조군이 8.
- 위하여 연구를 수행하였다. TLC상 국산 및 중국 산간에 성분과 함량의 차이가 있음을 알 수 있었다. KOH 와 KOR의 메탄올 추출물은 HT1080 암주에 대한 세포독성을 나타내지 않았으나, 독성 없는 농도에서 암세포의 gelatin 에 대한 세포부착은 각각 최고 32.
- 2일로 평균 생존일수가 증가하였다. 또한 S-180이 이식된 생쥐의 생존비에 미치는 효과에서는 생리식염수만을 경구 투여한 대조군보다 KOH와 KOR를 경구투여한 모든 군에서 T/C %가 높게 나왔으며 그 중에서도 KOR 2500㎎/㎏ 농도에서 171%로 가장 높게 나왔다(Table U, Fig. 7). 이로써 KOH와 KOR는 S-180의 증식을 억제하며 생명연장에 효과가 있음을 확인할 수 있었다.
- 또한 전이에 관련된 MMP2와 uIA의 mRNA수준을 감소시켰으며, TTMP2의 발현은 증가시켰으나 topoisomerase-1에는 영향이 없었다.
- 본 실험에서 HT1080에 대한 세포 독성 실험을 한 결과 KOH 와 KOR 모두 유의한 독성을 나타내지 않았다(Fig. 2).
- 암세포 부착저지 효과 - KOH와 KORS] 암세포 부착저지 효과를 측정하였던 바, 농도가 증가할수록 HT1080 세포의 부착을 저지하는 효과를 나타내었고 KOH와 KOR의 400 gg/m/ 농도에서는 각각 32.6%, 37.0%의 높은 부착 저지 효과를 보였다(Fig. 3). 이는 KOH와 KOR는 암세포가 세포 기질에 부착하는 것을 저해함으로써 전이를 억제할 가능성을 시사하고 있다.
- 5). 이로써 K0H와 KOR는 전이에 관여하는 인자인 MMP 2의 발현을 저해함으로써 전이억제 효과를 나타낼 가능성을 보여주었다.
- 7). 이로써 KOH와 KOR는 S-180의 증식을 억제하며 생명연장에 효과가 있음을 확인할 수 있었다.
- 이상의 결과를 보아 KOH와 KOR는 혈관형성 저해를 통해 전이를 차단하고 암의 성장을 조절함으로써 항암효과를 나타냄을 확인할 수 있었다. 그러나 앞으로도 중국산 백화 사설 초와 효능비교, 특성적 유효물질 분리 및 구체적인 작용기전 등에 대한 연구는 지속되어야 할 것으로 사료된다.
- 1의 TLC에서 보면, K0R의 연두색으로 발색 된 성분이 CO나 KOH에 비해 다른 특이 성분으로 보여지며, 마찬가지로 CO의 경우 KOH나 KOR에서 보여지지않는 성분이 포함되어 있음을 알 수 있었다. 특히 KOH에서 분홍색 성분인 ursolic acid의 함량이 가장 높은 것을 확인 할 수 있었다(Fig. 1). 위와 같이 동종임에도 불구하고 지역별, 약용 부위별로 성분의 차이가 나타남을 알 수 있었다.
- 10일에 모두 죽었다. 평균 생존일수 (MST)는 대조군이 8.3일인데 반해 KOH 1250 ㎎/㎏, 2500 ㎎/㎏에서 각각 10.6일, 11.2일이었으며 KOR 1250 ㎎/㎏, 2500 ㎎/㎏의 농도에서 각각 10.6일, 14.2일로 평균 생존일수가 증가하였다. 또한 S-180이 이식된 생쥐의 생존비에 미치는 효과에서는 생리식염수만을 경구 투여한 대조군보다 KOH와 KOR를 경구투여한 모든 군에서 T/C %가 높게 나왔으며 그 중에서도 KOR 2500㎎/㎏ 농도에서 171%로 가장 높게 나왔다(Table U, Fig.
후속연구
- 확인할 수 있었다. 그러나 앞으로도 중국산 백화 사설 초와 효능비교, 특성적 유효물질 분리 및 구체적인 작용기전 등에 대한 연구는 지속되어야 할 것으로 사료된다.
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